间充质干细胞及其用途的制作方法

专利名称：间充质干细胞及其用途的制作方法
间充质干细胞及其用途
本发明以美国海军部(Department of the Navy )所资助的政府支持合同号 N66001-02-C-8068而进行。美国政府享有本发明中的某些权利。
本申请是2005年3月15日提交的申请系列号ll/080,298的部分继续申请， 其要求基于2004年3月22日提交的临时申请系列号60/555,118的优先权，所 述文献的内容完整地并入作为参考。
本发明涉及间充质干细胞。更具体地，本发明涉及间充质干细胞的新用途， 包括促进多种组织和器官中血管发生、治疗自身免疫性疾病、治疗变态反应、 治疗癌症、治疗炎症疾病和病症、促进伤口愈合、治疗炎症和修复上皮损伤。
间充质干细胞(MSC)是能够立即分化成林系的多能干细胞，其中所述 的抹系包括成骨细胞、肌细胞、软骨细胞和脂肪细胞(Pittenger等，科学 (Science )，第284巻，第143页(1999); Haynesworth等，骨(Bone)，第13 巻，第69页(1992); Prockop， Science,第276巻,第71页(1997))。体外研 究已经证实MSC分化成肌肉(Wakitani等，肌肉神经(Muscle Nerve )，第18 巻，第1417 171995))、神经元样前体(Woodbury等，神经科学研究(J. Neurosci. Res.)，第69巻，第908页(2002); Sanchez-Ramos等，实验神经病学(Exp. N函l).,第171巻，第109页(2001))、心肌细胞(Toma等，循环(Circulation), 第105巻，第93页(2002); Fakuda，人工器官(Artif. Organs),第25巻，第 187页(2001))以及其它可能细胞类型的的能力。此外，已经证实MSC为造血 肝细胞和胚胎肝细胞提供有效饲养层(Eaves等，纽约科学院年报(Ann.N.Y. Acad. Sci.),第938巻，第63页(2001); Wagers等，基因治疗(Gene Therapy )， 第巻9,第页606(2002))。近来用多种动物进行的研究已经证实MSC可以用 于修复或再生损害的骨、软骨、半月板或心肌组织(DeKok等，临床口腔种 植学研究(Clin. Oral Implants Res.)，第14巻，第481页(2003)); Wu等，H 植(丁ransplantetionL第75巻，第679页(2003); Noel等，Curr. Opin. Investiq. Drugs,第3巻，第1000页(2002); Ballas等，细胞生物学副刊(J. Cell. Biochem.Suppl.),第38巻，第20页(2002); Mackenzie等，血细胞分子研究(Blodd Cells Mol. Dis,)，第27巻(2002))。几位研究员已经在动物疾病模型中将MSC用于 移植，获得令人鼓舞的结果，其中所述的动物疾病模型包括骨生成不完全 (Pereira等，国家牙牛学院进展(Proc. Nat. Acad. Sci.),第95巻，第1142页 (1998))、帕金森综合征(Schwartz等，人类基因治疗(Hum. Gene Ther.)，第 10巻，第2539页(1"9))、脊髓损伤(Chopp等，神经系统报道(Neurore。ort )， 第11巻，第3001页(2000); Wu等，神经科学研究杂志(J. Neurosci. Res.), 第72巻，第393页(2003))和心脏病(Tomita等，Circulation,第100巻，第 247页(1999). Shake等，胸外科治疗年报(Ann. Thorac. Surq.)，第73巻，第 1919页(2002)X重要地是，已经在临床试验中对骨生成不完全(Horwitz等， 血液(Blood )，第97巻，第1227页(2001); Horowitz等Proc. Nat. Acad. Sci.， 第99巻，第8932页(2002))和异源骨髓移植物的增强性植活(Frassoni等， Int.细胞治疗组织(Society for Cell Therapy )， SA006(摘要)(2002); Koc等， 临床肿瘤杂志(J. Clin. Oncol.),第18巻，第307页(2000))报道了有希望的 结果。
MSC在其表面上表达主要组织相容性复合物(MHC) I类抗原但是不表 达固C II类(Le Blanc等，血液学实验(Exp. Hematol.),第31巻，第890 页(2003); Potian等，免疫学杂志(J. Immunol.),第171巻，第3426页(2003)) 并且没有B7或CD40共刺激性分子(Majumdar等，生物药科学(J. Biomed. Sci.)，第10巻，第228页(2003)),表明这些细胞具有低免疫原性表型(Tse 等，Transplantation,第75巻，第389页(2003) )。 MSC还以MHC非依赖方式 抑制T细胞增殖反应(Bartholomew等，Exp. Hematol.，第30巻，笫42页(2002); Devine等，癌症杂志(Cancer J.),第7巻，第576页(2001); DiNicola等，Blood, 第99巻，第3838页(2002)X MSC的这些免疫学特性可以增强其移植物植活 并限制受体免疫系统在移植后识别并排斥同种异体细胞的能力。MSC产生调 节免疫应答并且支持血细胞生成的因子，这连同MSC在局部刺激下分化成适 宜细胞类型的能力使得MSC成为用于细胞移植研究的受欢迎的干细胞 (Majumdar等，血液疗法干细胞研究(Hematother. Stem Cell Res.),第9巻， 第841页(2000); Haynesworth等，细胞生理学杂志(J, Cell. Physiol.),第166
巻，第585页(1996))。
申请人现在已经检验了间充质干细胞与分离的免疫细胞群体(包括树突细 胞(DC1和DC2 )、效应T-2细胞(Thl和Th2 )和NK细胞)的相互作用。 基于这类相互作用，申请人发现间充质干细胞可以调节可调节免疫应答过程中 若干步骤的多种因子的产生。因此，间充质千细胞可以用于治疗涉及免疫系统 的疾病、状况和病症或涉及炎症、上皮损伤或变态反应的疾病、状况或病症。 此类疾病、状况和病症包括，但不限于自身免疫性疾病、变态反应、关节炎、 发炎伤口、斑秃(秃顶)、牙周疾病(包括龈炎和牙周炎)和涉及免疫应答的 其它疾病、状况或病症。
另外，据信间充质干细胞表达并分泌血管内皮生长因子或VEGF,这通过 刺激新血管形成而促进血管发生。间充质干细胞还刺激外周血单核细胞 (PBMC)产生VEGF。
此外，据信间充质干细胞刺激树突细胞(DC)产生干扰素-(3 (IFN-卩)， 这促进肿瘤抑制和抗病毒感染免疫。
根据本发明的一个方面，提供治疗动物中选自自身免疫性疾病和移植物抗 宿主病中的疾病的方法。该方法包括以有效治疗动物中该疾病的量给药间充质 干细胞至该动物。
虽然本发明此方面的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞籍此 抑制自身免疫性疾病和移植物抗宿主病的至少一种机理是因引起白细胞介素 -10 (IL-10)从调节性T细胞(Treg细胞)和/或树突细胞(DC)中释放。
根据本发明可以治疗的自身免疫性疾病包括，但不限于多发性硬化、I型 糖尿病、类风湿性关节炎、色素膜炎、自身免疫性曱状腺病、炎症性肠病、硬 皮病,格雷夫斯病、狼疮、克罗恩病(Crohn's disease )、自身免疫性淋巴增生病 (ALPS)、脱髓鞘病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性胃炎(AIG)和自身 免疫性肾小球病。另外，如上文中提及，移植物抗宿主病可以得到治疗。然而 将可以理解的是本发明的范围不限于治疗本文中提及的具体疾病。
在一个实施方案中，向其给药间充质干细胞的动物是哺乳动物。哺乳动物 可以是灵长类，包括人和非人灵长类。
通常，间充质千细胞(MSC)疗法基于例如以下顺序收获含MSC组织、
分离和扩增MSC并且给药MSC至动物，进行或者不进行生物化学4喿作或遗 传操作。
给药的间充质干细胞可以是纯系的组合物或可以是在MSC上被富集的混 合细胞群体。纯系的间充质干细胞组合物可以通过培养贴壁性骨髓细胞或骨膜 细胞而获得，并且间充质干细胞组合物可以通过用独特单克隆抗体鉴別的特定 细胞表面标记而加以识别。在例如美国专利号5,486,359中描述了用于获得在 间充质干细胞上被富集的混合细胞群体的方法。间充质干细胞的替代来源包 括、但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。
间充质干细胞可以通过多种方法给药。间充质干细胞可以全身性地给药， 如通过静脉内、动脉内或腹膜内给药。
间充质干细胞可以来自一系列(spectrum)来源，包括自体性来源、同种 异体性来源或异种来源。
间充质干细胞在动物中以有效治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的 量给药。间充质干细胞可以以约lxl()S个细胞/kg至约lxl(^个细胞/kg的量给 药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约lxl(^个细胞/kg至约5xl(^个 细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的量取决于多种因素，包括患者年龄、 重量和性别，待治疗的自身免疫性疾病以及其程度和严重性。
间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。例如，间充质干细胞可 以作为用于注射或局部应用的可药用液体介质或凝胶中的细胞混悬剂而给药。
根据本发明的另一个方面，提供治疗动物中炎症反应的方法。该方法包括 以有效治疗动物中炎症反应的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明此方面的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞促进 T细胞成熟为调节性T细胞(Treg),因而控制炎症反应。还据信间充质干细胞 抑制辅助T细胞l(Thl细胞)，因而减少干扰素-y (IFN-y)在某些炎症反应 (例如与银屑病有关的那些炎症反应)中的表达。
在一个实施方案中，可以治疗的炎症反应是与银屑病有关的那些炎症反应。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以给药至动物，以至于间充质干细 胞接触脑内的小胶质细胞和/或星形胶质细胞以减少炎症，因而间充质干细胞
在疾病或病症如阿尔茨海默病、帕金森病、中风或脑细胞损伤中限制了由活化 的神经胶质细胞造成的神经变性。
在又一个实施方案中，间充质干细胞可以给药至动物，以至于间充质干细 胞接触皮肤表皮内的角质化细胞和朗汉氏细胞以减少如可在银屑病，慢性皮炎 和接触性皮炎中存在的炎症。虽然该实施方案不限于任何理论性推理，据信间
充质千细胞可以接触表皮内的角质化细胞和朗汉氏细胞，并且改变T细胞受 体的表达和细胞因子分泌谱，导致肿瘤坏死因子-a (TNF-a)表达减少和调节 性T细胞(Treg细胞)群体增加。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用来在骨中减少如在关节炎和关 节炎样状况(包括但不限于骨关节炎和类风湿性关节炎和在网站 www.arthritis.org/conditions/diseases中所列的其它关节炎性疾病)中存在的炎 症。虽然该实施方案的范围不意图限于任何理论性推理，据信间充质干细胞可 以抑制记忆性T细胞在滑膜液中分泌白细胞介素-17。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用来在炎症性肠病和慢性肝炎期 间分别限制肠道和肝脏内的炎症。虽然本发明此方面的范围不意图限于任何理 论性推理，据信间充质干细胞促进增加的白细胞介素-10 (IL-10)分泌和调节 性T细胞(Treg细胞)生成。
在另 一个实施方案中，间充质干细胞可以用来抑制病理学状况如脓毒症和 创伤(包括烧伤、手术和移植)中的嗜中性粒细胞和巨噬细胞过度活化。虽然 该实施方案的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞促进抑制性细胞 因子如IL-IO的分泌，并抑制巨噬细胞迁移抑制因子。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用来控制免疫救免部分如包括角 膜、晶状体、色素上皮和视网膜的眼、脑、脊髓、妊娠子宫和胎盘、卵巢、睾 丸、肾上腺皮质、肝脏和毛嚢中的炎症。虽然该实施方案的范围不限于任何理
论性推理，据信间充质干细胞促进抑制性细胞因子如IL-10的分泌和Treg细胞生成。
在又一个实施方案中，间充质干细胞可以用来治疗与透析和/或肾小球肾
炎期间末期肾病(ESRD)感染相关的组织损害。虽然该实施方案的范围不限 于任何理论性推理，据信间充质干细胞可以促进肾修复。间充质千细胞还表达
并分泌血管内皮生长因子或VEGF,这刺激新血管形成，应当辅助修复损伤的 肾脏组织。
在另 一个实施方案中，间充质干细胞可以用来控制病毒感染如流感病毒、 丙型肝炎病毒、单纯疱症病毒、痘苗病毒感染和Epstein-Barr病毒。虽然该实 施方案的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞促进干扰素-卩 (IFN-卩)分泌。
在又一个实施方案中，间充质干细胞可以用来控制寄生虫感染如利什曼原 虫(Leishmania)感染和螺杆菌(Helicobacter)感染。虽然该实施方案的范围 不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞介导由T辅助2 (Th2)细胞所致 的应答并且因而促进j3-细胞增加产生免疫球蛋白E (IgE)。
然而将可以理解的是本发明此方面的范围不限于治疗任何具体炎症反应。 如上文中所述，间充质干细胞可以给药至哺乳动物，包括人和非人灵长类。 如上文中所述，间充质干细胞也可以全身性地给药。可选地，在骨关节炎 或类风湿性关节炎的情况下，间充质干细胞可以直接给药至有关节炎的关节。 间充质干细胞以有效治疗动物中炎症反应的量给药。间充质干细胞可以以 约lxl()S个细胞/kg至约lxl(^个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间 充质干细胞以约lxl(^个细胞/kg至约5xl(^个细胞/kg的量给药。待给药间充 质干细胞的确切剂量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、正在治疗 的炎症反应以及其程度和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。 根据本发明的另 一个方面，提供治疗动物中炎症和/或修复上皮损伤的方 法。该方法包括有效治疗动物中炎症和/或上皮损伤的量给药间充质干细胞至 该动物。
虽然本发明此方面的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞导致 T细胞分泌促炎性细胞因子TNF-a及干扰素i的减少和T细胞分泌抗炎性细 胞因子白细胞介素-10 (IL-10)及白细胞介素-4 (IL-4)的增加。还据信间充 质干细胞导致天然杀伤(NK)细胞分泌千扰素-y的减少。
根据本发明的该方面而可以治疗的炎症和/或上皮损伤包括，但不限于由 多种疾病和病症引起的炎症和/或上皮损伤，其中所述的疾病和病症包括，但
不限于自身免疫性疾病、移植器官的排异反应、烧伤、切割伤、撕裂伤和溃疡 (包括皮肤溃疡和糖尿病性溃疡)。
在一个实施方案中，间充质干细胞给药至动物以便修复因自身免疫性疾病 所致的上皮损伤、所述的自身免疫性疾病包括、但不限于类风湿性关节炎、
Crohn疾病、I型糖尿病、多发性硬化、硬皮病、格雷夫斯病、狼疮、炎症性 肠病、自身免疫性胃炎(AIG)和自身免疫性肾小球病。间充质干细胞也可以 修复因移植物抗宿主病(GVHD)所致的上皮损伤。
本发明的这个方面尤其应用于修复因移植物抗宿主病所致的上皮损伤并 且更具体地应用于修复因严重移植物抗宿主病所致的上皮损伤，所述的严重移 植物抗宿主病包括影响皮肤和/或胃肠道系统的III和IV级移植物抗宿主病。 申请人:尤其发现当间充质干细胞给药至患有严重移植物抗宿主病并且尤其患 有III和IV级胃肠道性移植物抗宿主病的患者时，间充质干细胞的给药导致该 患者中皮肤和/或溃疡肠上皮组织的修复。
在另 一个实施方案中，间充质干细胞给药至动物以便修复由已移植器官或 组织的排异反应引起的所移植器官或组织(包括但不限于肾脏、心脏和肺脏) 的上皮损伤。
在又一个实施方案中，间充质干细胞给药至动物以修复由烧伤、切割伤、 撕裂伤和溃疡(包括，但不限于皮肤溃疡和糖尿病性溃疡)引起的上皮损伤。
如上文中所述，间充质干细胞可以给药至哺乳动物，包括人和非人灵长类。
如上文中所述，间充质干细胞也可以全身性地给药。
间充质干细胞以有效修复动物中上皮损伤的量给药。间充质干细胞可以以 约lxl()S个细胞/kg至约lxl(^个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间 充质干细胞以约lxl(^个细胞/kg至约5xl(^个细胞/kg的量给药。待给药间充 质千细胞的确切剂量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、正在修复 的上皮损伤类型以及其程度和严重性。
根据本发明的又一个方面，提供治疗动物中癌症的方法。该方法包括有效 治疗动物中癌症的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明此方面的范围不限于任何理"i仑性推理，据信间充质干细胞与树 突细胞相互作用，导致IFN-13分泌，这又起到肿瘤抑制物的作用。可以治疗
的癌症包括但不限于，肝细胞癌、子宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、 髓母细胞瘤和星形细胞瘤。然而将理解的是本发明的范围不限于任何具体类型的癌症。
如上文中所述，动物可以是哺乳动物，包括人和非人灵长类。 间充质干细胞以有效治疗动物中癌症的量给药至该动物。通常，间充质干
细胞以约lxl(5)S个细胞/kg至约lxl(7)个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约lxl(6)个细胞/kg至约5xl(6)个细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的确切量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、正在 治疗的癌症的类型以及其程度和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞与可接受的药用载体一起给药并且可以全身性地给药。备选地，间充质干细胞可以直接给药至正在治疗的癌症。
仍根据本发明的又一个方面，提供治疗动物中变应性疾病或病症的方法。 该方法包括以有效治疗动物中变应性疾病或病症的量给药间充质干细胞至该 动物。
虽然本发明此方面的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞当在急性变态反应后给药时，提供对肥大细胞活化和脱颗粒的抑制。另外，据信间 充质干细胞下调嗜碱性粒细胞活化并且抑制细胞因子如TNF-a、趋化因子如白 细胞介素-8和单细胞趋化蛋白或MCP-1、脂质介质如白细胞三烯，并且抑制 主要介质如组胺、肝素、硫酸軟骨素和组织蛋白酶。
可以治疗的变应性疾病或病症包括，但不限于译喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎和接触性皮炎。然而将可以理解的是本发明的范围不限于任何具体的变应性疾病或病症。
间充质干细胞以有效治疗动物中变应性疾病或病症的量给药至该动物。动物可以是哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。通常，间充质干细胞以约lxl(5)S个细胞/kg至约lxl(7)个细胞/kg的量给药。在另一个实 施方案中，间充质干细胞以约1 x 10(6)个细胞/kg至约5x 10(6)个细胞/kg的量给药。 确切剂量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、正在治疗的变应性疾 病或病症以及其程度和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。间充质干细胞可以全身性地给药，例如通过静脉内或动脉内给药。
根据本发明的又一个方面，提供促进动物中伤口愈合的方法。该方法包括 以有效动物中促进伤口愈合的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明的范围不限于任何理论性推理；据信如本文中提及，间充质干
细胞引起Treg细胞和树突细胞释放白细胞介素-lO (IL-IO)。
IL-10限制或控制
伤口内的炎症，因而促进伤口愈合。
此外，间充质干细胞可以通过诱导其它细胞类型的分泌因子而促进伤口愈
合和骨折愈合。例如，间充质干细胞可以诱导由外周血单核细胞(PBMC )所 致的前列腺素E2 ( PGE2)介导的血管内皮生长因子(VEGF )释放，以及PGE2-介导的生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1 (IGF-1)、胰岛素样生长因 子结合蛋白-3 (IGFBP-3 )和内皮缩血管肽-1释放。
可以愈合的伤口包括，但不限于因切割伤、撕裂伤、烧伤和皮肤溃疡所致 的那些伤口。
间充质干细胞以有效促进动物中伤口愈合的量向动物给药。动物可以是哺 乳动物，并且哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。通常，间充质干 细胞以约lxl()5个细胞/kg至约lxl(^个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案 中，间充质干细胞以约lxl(^个细胞/kg至约5xl(^个细胞/kg的量给药。待给 药间充质干细胞的确切量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别以及正 在治疗的伤口的程度和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞可以与接受的药用载体一起给药。如上文中 所述，间充质干细胞可以全身性地给药。备选地，间充质干细胞可以直接给药 至伤口 ，如在含有间充质干细胞的敷料或储器上的液体内。
根据本发明的又一个方面，提供治疗或预防动物中纤维化的方法。该方法 包括有效治疗或预防动物中纤维化的量给药间充质干细胞至该动物。
间充质干细胞可以给药至动物以便治疗或预防动物中任何类型的纤维化， 包括ing，但不限于肝硬化、与末期肾病相关的肾脏纤维化和肺纤维化(包括， 但不限于急性呼吸道疾病综合征(ARDS)和慢性阻塞性肺病(COPD)。将理 解的是本发明的范围不限于任何具体类型的纤维化。
间充质干细^^以有效治疗或预防动物中纤维化的量^^药至动物。动物可以
是哺乳动物，并且哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。通常，间充 质干细胞以约lxl()5个细胞/kg至约lxlO 个细胞/kg的量给药。在另一个实施
方案中，间充质干细il包以约lxl(^个细胞/kg至约5xl(^个细胞/kg的量给药。 待给药间充质干细胞的确切量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别， 以及正在治疗或防止的纤维化的程度和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。还如上 文中所述，间充质干细胞可以全身性地给药。
本发明的另 一个目标是促进动物组织或器官中的血管发生，其中该组织或 器官需要血管发生。
因此，根据本发明的又一个方面，提供促进动物组织或器官中的血管发生 的方法。该方法包括以有效促进动物组织或器官中血管发生的量给药间充质干 细月包至该动物。
血管发生是从预先存在的微血管床中形成新血管。
血管发生的诱导可以用来治疗冠脉和外周动脉机能不全，并且因此可以是 治疗冠状动脉疾病、缺血性心脏病和外周动脉疾病的非倾入及治愈性方法。血 管发生可以在治疗除心脏之外的组织和器官内的疾病和病症中，以及在发育和 /或维持除心脏之外的器官中发挥作用。血管发生可以在治疗内部伤口和外部 伤口以及皮肤溃疡中发挥作用。血管发生还在胚胎植入和胎盘生长以及发胚胎 脉管系统育中发挥作用。血管发生对于软骨再吸收与骨形成偶联也是必需的， 并且对正确的生长面形态发生是重要的。
此外，血管发生对于成功设计和维护高代谢性器官如肝脏是必需的，在所 述的器官中需要稠密的血管网提供充分的营养物和气体输送。
间充质干细胞可以通过多种方法给药至需要血管发生的组织或器官。间充 质干细胞可以全身性地给药，如通过静脉内，动脉内或腹膜内给药，或间充质 干细胞可以直接给药至需要血管发生的组织或器官，如通过直接注射至需要血 管发生的组织或器官。
间充质干细胞可以来自 一系列来源包括自体性来源、同种异体性来源或异 种来源。
虽然本发明的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞在给药至动 物时刺激了外周血单核细胞(PBMC)产生血管内皮生长因子或VEGF,这刺 激新血管形成。
在一个实施方案中，动物是哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类，包括人和 非人灵长类。
间充质干细胞才艮据本发明可以用于治疗、緩解或预防可通过血管发生而加 以緩解、治疗或预防的任何疾病或病症。因此，例如间充质干细胞可以给药至 动物以便治疗阻塞动脉，包括在肢端即臂、腿、手和足以及颈内或者多种器官 内的那些阻塞动脉。例如，间充质干细胞可以用来治疗供应脑的阻塞动脉，治 疗或预防中风。另外，间充质干细胞可以用来治疗胚角膜和新生后角膜内的血 管并且可以用来提供肾小管构筑作用(structuring )。在另一个实施方案中，间 充质干细胞可以用于治疗内部和外部伤口，以及治疗在足、手、腿或臂中存在 的皮肤溃疡，包括，但不限于由疾病如糖尿病和镰状细胞贫血引起的皮肤溃疡。
此外，因为血管发生参与胚胎植入和胎盘形成，间充质肝细胞可以用于促 进胚胎植入和防止流产。
另外，间充质干细胞可以给药至未出生的动物，包括人，以促进未出生动 物中的血管发育。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以给药至出生或未出生的动物以促 进软骨再吸收和骨形成，以及促进正确的生长面形态发生。
间充质干细胞以促进动物中血管发生的量给药。间充质干细胞可以以约 lxl()5个细胞/kg至约lxl(^个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充 质干细胞以约lxl(^个细胞/kg至约5xl(^个细胞/kg的量给药。待给药间充质 干细胞的量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、待治疗、緩解或预 防的疾病或病症以及其程度和严重性。
间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。例如，间充质干细胞可 以作为用于注射的可药用液体介质中的细胞混悬剂而给药。注射可以是局部 的，即直接进入需要血管发生的组织或器官内，或是全身性的。
间充质千细胞可以用一种或多种编码治疗药的多核苷酸进行基因改造。所 述多核苷酸可以通过适宜表达载体送递至间充质干细胞。可以用来基因改造间 充质细胞的表达载体包括，但不限于逆转录病毒载体，腺病毒载体和腺联病毒
载体。
对编码治疗药的适宜多核香酸的选择:Ef又决于多种因素，包括正在治疗的疾 病或病症以及其程度和严重性。编码治疗药的多核苷酸和适宜表达载体在美国
专利号6,355,239中进一步描述。
域技术人员已知的其它治疗药(包括，但不限于生长因子、细胞因子、药物如 抗炎药)以及除间充质干细胞之外的细胞如树突细胞而组合地使用，并且可以 与用于细胞的可溶性载体如透明质酸一起或与固体基质如胶原、明胶或根据需 要的其它生物相容性聚合物而组合地给药。
将理解的是本文中所述的方法可以按照多种方式并且以其本领域众所周 知的多种变型及置换而实施。也可以理解如对细胞类型间作用或相互作用模式 所述的任何理论不应当以任何方式解释为限制本发明，而仅提出以至于可以更 充分地理解本发明的方法。
本发明现在将参照附图而描述，其中


图1 MSC调节树突细胞功能。(A)使用抗HLA-DR和CDllc抗体的成 熟单核细胞性DC1细胞的流式细胞术分析和使用抗HLA-DR和CD123 (IL-3 受体)抗体的类浆细胞性DC2细胞的流式细胞术分析。(--):同种型对照；
(—);FITC/PE结合抗体。(B) MSC分别抑制TNF-a从活化DC1中分泌(主 要y-轴)并且增加IL-10从DC2中分泌(次要y-轴)。(C )与单独的MSC或 DC相比，与成熟DC1细胞一同培养的MSC抑制T细胞的IFN-y分泌(主要 y-轴)并且增加IL-4水平(次要y-轴)。在MSC存在下促炎性IFN-y产生的 减少和抗炎性IL-4产生的增加显示T细胞群体向抗炎性表型的移动。
图2 MSC抑制促炎性效应T细胞功能。(A)通过用FITC结合CD4 (x國 轴)和PE结合CD25 ( y-轴)抗体染色MSC+PBMC培养物中的PBMC或非 贴壁部分的TReg细胞数目(单位％)的流式细胞术分析。基于作为背景的同种 型对照抗体而设置门(Gate)。曲线图是5个独立实验的代表。(B)在MSC 存在下产生的TH1细胞在细胞培养上清液中分泌降低水平的IFN-y (主要y-轴)并且在MSC存在下产生的TH2细胞在细胞培养上清液中分泌增加量的IL-4
(次要y-轴)。(C) MSC抑制来自培养在24-孔平板中O小时、24小时或48
小时的纯化NK细胞中的IFN-y分泌。所示数据是在一个实验中的均值士SD细 胞因子分泌并且是3个独立实验的代表。
图3 MSC导致Treg细胞群体数目增加以及GITR表达增加。(A)来自 PBMC或MSC +PBMC ( MSC与PBMC比例1:10 )培养物(无任何其他刺激 下培养3日)的CD4+CD25+Treg细胞群体使用2步骤;兹性分离法分离。这些细 胞受到照射(以阻断任何进一步增殖)并且用作混合淋巴细胞反应(MLR) 中的刺激物，其中反应者是在植物血凝素(PHA) (2.5mg/ml)存在下的同种 异体PBMC (刺激物与反应者比例1:100 )。将细胞培养48小时，随后添加3H 胸苷，并且在24小时后计数掺入的放射性。结果显示在MSC存在下产生的
Treg群体(泳道1 )功能性地类似于在MSC存在下产生的Treg细胞(泳道2 )。
(B )将PBMC在MSC不存在(上图)或存在下(MSC与PBMC比例1:10) (下图)培养，随后收获非贴壁部分并且用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的
GITR及藻红蛋白(PE)标记的CD4进行免疫染色。结果显示GITR表达在
MSC存在下所培养的细胞中增加大于2倍。
图4MSC产生PGE2并且阻断PGE2逆转了 MSC介导的免疫调节作用。
(A) 从MSC中获得的培养上清液中的PGE2分泌(均值士SD),其中所述的 MSC在多种浓度的PGE2阻滞剂NS-398或吲哚美辛(Indometh.)存在或不存 在下培养。抑制物浓度是并且呈现的数据是在24小时培养后获得的值。
(B) 使用实时RT-PCR测得的MSC和PBMC中的COX-1和COX-2表达。 与PBMC相比，MSC表达显著较高水平的COX-2 ，并且当MSC在PBMC存 在下培养时，COX-2在MSC中的表达增加大于3倍。显示了来自3个独立实 验之一中的代表性数据。在trans-well室平板(chamber plate)中建立 MSC+PBMC培养物，其中MSC在底室上铺板而PBMC在顶室上铺板。(C) 如与对照相比，PGE2阻滞剂吲哚美辛(Ind.)或NS-398的存在增加了来自活 化DC ( □)的TNF-a分泌和来自TH1细胞(■)的IFN-y分泌。数据从MSC 和PGE2抑制物不存在下所产生培养物中计算为变化％。 ( C ) PGE2阻滞剂吲哚 美辛(Indo)和NS-398在MSC-PBMC共培养(1:10 )期间的存在逆转MSC 介导的对PHA所处理PBMC的抗增殖作用。所示数据来自 一个实验并且是3 个独立实验的代表。
图5组成型MSC细胞因子分泌在同种异体PBMC存在下升高。使用先
前表征的人MSC,分析了在PBMC存在(阴影柱)(MSC与PBMC比例1:10) 或不存在(空心柱)下培养24小时的MSC的培养上清液中细胞因子IL-6和 VEGF、脂质介质、PGE2和基质金属蛋白酶1 (原-MMP-l ) (pro-MMP-1 )的 水平。MSC组成性地产生IL-6、 VEGF和PGE2,并且这些因子的水平在与 PBMC共培养时增加，因而提示MSC可能在炎症环境下调节免疫功能中发挥 作用。
图6MSC以剂量依赖方式抑制促分裂原诱导的T细胞增殖。数目增加的 同种异体PBMC与恒定数目的在96-孔平板上铺板的MSC (2,000个细胞/孔) 在PHA (2.5 mg/ml)存在或不存在下温育72小时，并且测定掺入的^胸苷 (每分钟计数或cpm )。在MSC存在下具有对PHA所处理PBMC增殖的剂量 依赖性抑制。显示了来自3个独立实验之一中的代表性数据。类似结果由 LeBlanc等，Scand J. Immunol.,第57巻，第11页(2003)报道。 图7建i5C的MSC作用机理示意图
MSC影响来自天然免疫系统(DC-途径2-4;和NK-途径6 )和适应性(T-途径1和5和B-途径7)免疫系统的细胞而介导其免疫调节作用。在应答于侵 入的病原体时，不成熟的DC迁移至有效进入(potential entry)的部位、成熟 并获得激发天然T细胞(通过抗原特异性信号和共刺激信号)的能力，旨在 变成保护性效应T细胞(细胞介导的TH1或体液TH2免疫)。在MSC-DC相互 作用期间，通过T细胞-细胞直接接触或通过分泌性因子，MSC可以通过限制 DC细胞发动细胞介导应答(途径2)的能力或通过促进发动体液应答的能力
(途径4)而改变免疫应答结果。另外，当成熟的效应T细胞存在时，MSC 可以与其相互作用以使TH1 (途径1 )反应向TH2反应(途径5 )以及可能向 增加的IgE产生性B细胞活性(途径7 )倾斜，这是抑制GvHD和自身免疫病 症状希望的结果。MSC引起Treg群体生成增加的能力(途径3)可以产生耐受 表型并且可以通过在其局部微环境中减弱旁观者炎症而帮助受体宿主。虛线
(——)代表提出的机理。
本发明现在将参考以下实施例进行描述。然而将可以理解的是本发明的范 围不因而受限制。
实施例1 材料和方法
人MSC的培养
人MSC如Pittenger等，Science,第284巻，第143页(1999)所述进行培 养。简而言之，骨體样品由Poietics Technologies、 Div of Cambrex Biosciences 从告知同意后的匿名供体的髂峰中收集。MSC在含有1%抗生素-抗霉菌药溶 液(英杰，卡尔斯拜德，力口利福尼亚(Invitrogen, Carlsbad, California))和 10%胎牛血清(FBS, JRH生物科学，堪萨斯(JRH Biosciences), Lenexa， Kansas ) 的完全Dulbecco's改良Eagle's低葡萄糖培养基(生活科技学，卡尔斯巴德，加 利福尼亚(LifeTechnologies, Carlsbad, California))中培养。MSC长成汇合单 层并且用胰蛋白酶/EDTA (0.05%胰蛋白酶在37。C持续3分钟)分离。所用全 部MSC先前对多系潜能进行表征并且保留了分化呈间充质系(软骨性、生脂 性和成骨性)(Pittenger等，Science,第284巻，第143页(1999))的能力。
树突细胞的分离
外周血单核细胞(PBMC)由泊易提斯技术(Poietics Technologies )，康伯 司生物科学室(Div of Cambrex Biosciences) ( Walkersville, MD)获得。使用 根据Dzionek等，免疫学杂志(J. Immunol.),第165巻，第6037页(2000)的2 步骤分离法，从PBMC中正向选择出单核细胞系的树突细胞(DC)的前体 (CDlc+)。简而言之，使用磁珠使表达CDlc的B细胞^兹性地耗尽CD19+细 胞，随后用生物素-标记CDlc (BDCA1+)和抗生物素抗体标记耗尽B细胞的 部分并且使用磁柱，根据制造商说明书(美天旎生物技术有限公司，奥本，加 利福尼亚(Miltenyi Biotech, Aubum， California))将它们与未标记的细胞部分 分开。类浆细胞系的DC前体从PBMC中通过阳性标记抗体包被细胞的免疫-磁分选法(BDCA2+)(美天旎生物技术有限公司，奥本，加利福尼亚(Miltenyi Biotech, Aubum， California))。
MSC-DC培养
在大部分实验中，人MSC和DC以相等数目培养多个时间段并且收集细
胞培养上清液并将其贮存在-8(tc直至进一步评估。在选择的实验中，MSC与 成熟的DC1或DC2细胞(MSC:DC比例1:1 )培养3日，并且随后照射合并 的培养物(MSC和DC)以防止任何增殖。其次，抗体纯化的、原初的、同种 异体的T细胞(CD4+、 CD45RA+)添加至照射的MSC/DC并培养另外6日。 不贴壁的T细胞部分(纯化的T细胞)随后从该培养物中收集、洗涤两次并 用PHA再刺激24小时，随后收集细胞培养上清液并通过酶联免疫吸附测定法 (ELISA)分析分泌的IFN-y和IL-4。
NK细胞的分离
NK细胞的纯化群体通过耗尽用生物素结合的单克隆抗体(抗CD3、抗 CD14、抗CD19、抗CD36和抗IgE抗体)混合物作为一级试剂以及与磁珠结 合的抗生物素单克隆抗体作为第二标记试剂而磁性标记的非NK细胞而获得。 磁性标记的非NK细胞在磁场中滞留在MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, California)柱内，而NK细胞则通过并被收集。
TReg细胞群体的分离
TReg细胞群体使用2步骤分离法分离。首先，非CD4+T细胞间接地用生 物素标记抗体混合物和抗生物素微珠磁性进行标记。标记的细胞随后通过在 MACS柱(Miltenyi Biotech, Auburn, California)上分离而耗尽。其次， CD4+CD25+细胞用CD25微珠直接标记并通过正选择从预先富集的CD4+T细 胞部分中分离。磁性标记的CD4+CD25+T细胞滞留在该柱上并且在从磁场中 移出该柱后得到洗脱。
为了确定在MSC存在下所产生增加的CD4+CD25+群体是否本质上呈抑制 性，使用2步骤》兹性分离法从PBMC或MSC+PBMC( MSC与PBMC比例1:10) 培养物(无任何其他刺激下培养3日)中分离CD4+CD25+Treg细胞群体。照射 这些细胞以阻断任何进一步增殖并且将它们用作混合淋巴细胞反应(MLR) 中的刺激物，其中反应者是在PHA ( 2.5 pg/ml)存在下的同种异体PBMC (刺 激物与反应者比例1:100)。培养进行48小时，随后添加311胸苷。在24小时 后计数掺入的放射性。
在MSC不存在或存在下(MSC与PBMC比例1:10)培养PBMC,随后 收获非贴壁部分并且将其用FITC标记的糖皮质激素诱导的TNF受体、或 GITR和PE标记的CD4进4亍免疫染色。
TH1/TH2细胞的产生
外周血单核细胞(PBMC )以2xl(^个细胞/ml在37。C铺板45分钟以除去 单核细胞。非贴壁部分在平板结合性抗CD3( 5jig/ml)抗体及抗CD28( lpg/ml) 抗体存在下，在TH1 (IL-2(4ng/ml)+IL-12(5ng/ml)+抗IL-4(l)ig/ml))或TH2 (IL-2(4ng/ml)+IL-4(4ng/ml)+抗IFN，(lng/m1))条件下，在MSC存在或不存 在下温育3日。将细胞洗涤并且随后用PHA ( 2.5吗/ml)再刺激另外24或48 小时，随后通过ELISA(R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)测量培养上清液中的IFN-丫和IL-4水平。 MSC的培养上清液中VEGF、 PGE2和原-MMP-1水平的分析 使用先前表征的人MSC,分析在PBMC存在或不存在下(MSC与PBMC 比例1:10)培养24小时的MSC的培养上清液中白细胞介素-6 (IL-6 )、 VEGF、 脂质介质、前列腺素E2 (PGE2)和基质金属蛋白酶l (原-MMP-l)的水平。
户丽C ^潜遂
纯化的PBMC通过在聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque )(淋巴细胞分离 剂，奥斯陆，挪威(Lymphoprep, Oslo, Norway))上离心白细胞层(leukopack) (康伯司，沃克斯维尔，马里兰(Cambrex， Walkersville， Maryland))而制备。 分离的细胞在MSC (在添加PBMC前3-4小时铺板以允许MCS定居)存在或 不存在下，在促分裂原PHA(西格玛化学制品，圣路易斯，密苏里州(Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri))存在下(一式三份)培养48小时，在选择 的实验中，PBMC在含有PGE2抑制物吲哚美辛(Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri)或NS-938 (鳄鱼化学制品，安娜堡，密歇根州(Cayman Chemicals, Ann Arbor, Michigan)的培养基内重悬。添加(犯)-胸苷(200^1培养物中20|il) 并且细胞在额外23小时培养后使用自动收获仪收获。MSC或PGE2阻滞剂的 作为计算为对照应答(100%)在PHA存在下的百分数。
来自细胞沉淀的总RNA使用市售试剂盒(奇尔根，巴伦西亚，加利福尼 亚(Qiagen, Valencia, California))并根据制造商说明书制备。使用无DNA试 剂盒(生命单元，奥斯汀，德克萨斯州(Ambion, Austin, Texas)除去杂质基 因组DNA。定量RT-PCR在MJ Research Opticon检测系统(南圣弗朗西斯科， 加利福尼亚(South San Francisco, California))上，使用QuantiTect SYBR Green RT-PCR试剂盒(Qiagen， Valencia, California)用浓度0.5 M的引物进4亍。 使用p-肌动蛋白作为内对照，通过Ct值(交叉点)的差异计算表达水平在不 同浓度下所培养细胞中的相对改变。COX-1和COX-2特异性引物的序列是 COX-1: 5'-CCG GAT GCC AGT CAG GAT GAT G-3'(正向)，5'-CTA GAC AGC CAG ATG CTG ACA G-3'(反向)；COX-2: 5'-ATC TAC CCT CCT CAA GTC CC-3'(正向)，5'-TAC CAG AAG GGC AGG ATA CAG-3'(反向)。
个细胞/孔)在PHA ( 2.5 mg/ml)存在下温育72小时，并且测定掺入的3H胸 苷(每分钟计数，cpm)。 PBMC和MSC以MSC:PBMC比例1:1、 1:3、 1:10、 1:30和1:81进行培养。
结果
在本研究中，检验了人MSC与分离的免疫细胞群体(包括树突细胞(DCl 和DC2 )、效应T细胞(TH1和TH2 )和NK细胞)的相互作用。MSC与每种 免疫细胞类型的相互作用具有特异性结果，提示MSC可以调节免疫应答过程 中的几个步骤。调节并可能应答于MSC免疫调节作用的分泌因子产生得到评 估并且前列腺素合成是有作用的(was implicated )。
髓样(DC1)和类浆细胞性(DC2)前体树突细胞分别通过分别免疫磁性 分选BDCAl+和BDCA2+细细胞而分离，并且对于DC1细胞而言通过与 GM-CSF和IL-4 (分别是lxio3 IU/ml和lxl03 IU/ml)温育，或对DC2细胞 而言与IL-3( 10ng/ml)温育而成熟。使用流式细胞术，DC1细胞具有HLA-DR+ 和CDllc+,而DC2细胞具有HLA-DR+和CD123+ (图1A)。在延性试剂细菌 脂多糖(LPS, lng/ml)存在下，DC1细胞产生中等水平的TNF-a,当MSC
存在(检验的比例是1:1和1:10)时，发生>50%的TNF-a分泌减少(图1B )。 另一方面，DC2细胞在LPS存在下产生IL-10并且IL-10的水平在MSC:DC2 共培养(l:l)时增加大于2倍(图1B)。因此，MSC调整了培养中的活化DC 的细胞因子谱朝向耐受性(tolerogenic)更强的表型。另夕卜，活化的DC与MSC 一起培养时，能够降低原初CD4+T细胞所分泌的IFN-y水平并增加原初CD4+T 细胞所分泌的IL-4水平(图IC )，显示了 MSC介导的/人促炎性至抗炎性T细 胞表型的移动。
由于增加的IL-10分泌在调节性细胞的产生中发挥作用(Kingsley等，L Immunol.,第168巻，第1080页(2002))，通过流式细胞术在PBMC与MSC 的共培养中定量调节性T细胞(TReg)。在PBMC与MSC培养3-5日时，存在 如通过用抗CD4和抗CD25抗体对PBMC染色而确定的TReg细胞数目增力口(图 2A)，这进一步支持MSC诱导的耐受性应答。在MSC存在下产生的 CD4+CD25+TReg细胞群体表达增加水平的糖皮质诱导性TNF受体(GITR)( — 种在Ti^细胞表面s上表达的细胞表面受体)，并且本质上是异质性的，因为 它抑制同种异体T细胞增殖(图3A、图3B)。其次，研究MSC直接影响T 细胞分化的能力。使用抗体选择的纯化T细胞(CD4+Th细胞)，在MSC存在 或不存在下产生IFN-y生产TH1细胞和IL-4生产性TH2细胞。当MSC在分化 期间出现时，TH1细胞减少IFN-y分泌而TH2细胞增加IL-4分泌(图2B )。当 MSC在Th细胞已经分化(在3日)成效应TH1或TH2类型(数据未显示) 后添加至培养物时，未见到IFN-y或IL-4水平的显著改变。这些实验表明MSC 可以直接影响效应T细胞分化并且改变T细胞细胞因子分泌朝向体液表型。
类似地，当MSC与纯化的NK细胞(CD3-、 CD14-、 CD19-、 CD36-)以 比例1:1培养不同时间段(0-48小时)时，培养上清液中存在减少的IFN-y分 泌(图2C ),因而表明MSC也可以调节NK细胞功能。
先前工作已经表明MSC通过可溶性因子调节T细胞功能(LeBlanc等， Exp.Hematol.，第31巻，第8卯页(2003); Tse等，Transplantation,第75巻， 第389页(2003)。观察到MSC组成性地分泌几种因子(包括IL-6、前列腺素 E2、 VEGF和原MMP-1 )，并且每种因子的水平在与PBMC —起培养时增加 (图5 )。为了研究导致抑制DC产生TNF-a和增加DC产生IL-10的MSC衍生性因子，研究了前列腺素E2的潜在作用，因为已经证实前列腺素E2抑制 活化的DC产生TNF-a( Vassiliou等，Cell. Immunol.,第223巻，第120页(2003))。 来自MSC培养物(0.5xl(^个细胞/ml的24小时培养物)的条件培养基含有大 约1000 pg/ml的PGE2 (图4A)。培养上清液中不存在可检测的已知的PGE2 分泌诱导物例如TNF-a、 IFN-y或IL-16 (数据未显示)，表明MSC的PGE2 组成型分泌。hMSC的PGE2分泌在已知的PGE2生产抑制物NS-398 (5pM) 和吲哚美辛(4pM)存在下抑制60-卯％ (图4A)。由于释放PGE2分泌因组成 活性环加氧酶l( COX-l )和诱导性环加氧酶2( C0X-2 )的酶活性而出现(Harris 等，Trends Immunol.,第23巻，第144页(2002))，使用trans-well培养系统分 析MSC和PBMC中COX-l和COX-2的mRNA表达。如与PBMC相比，MSC 表达显著较高水平的COX-2并且表达水平在MSC与PBMCs (MSC与PBMC 比例1:10)共培养24小时下增加大于3倍(图4B )。观察到COX-l水平的适 度改变，表明当MSC-PBMC共培养(图5)时，PGE2分泌的增加由COX-2 上调而介导。为了研究MSC对DC和T细胞的免疫调节作用是否由PGE2介 导，MSC在PGE2抑制物NS-398或吲哚美辛存在下与活化的树突细胞(DC1 ) 或TH1细胞一起培养。NS-398或吲哚美辛的存在分别增加DC1的TNF-a分泌 以及来自TH1细胞的IFN-y分泌(图4C )，表明MSC对免疫细胞类型的作用 可以由分泌的PGE2介导。近来研究已经证实MSC抑制由多种刺激物诱导的T 细胞增殖(DeNicola等，Blood,第99巻，第3838页(2002 ); LeBlanc等，Scand. J. Immunol.,第57巻，第11页(2003))。还观察到MSC以剂量依赖方式抑制 促分裂原诱导的T细胞增殖(图6)并且当PGE2抑制物NS-398 (5(iM)或吲 哚美辛(4pM)存在时，在含有MSC的培养物中由PHA所处理PBMC所致 的(3勺胸苷掺入增加大于70%，如与无抑制物下的对照相比(图4D)。
总之，提出了 MSC与免疫细胞类型相互作用的模式(图7)。当成熟的T
细胞出现时，MSC可以与它们直接相互作用并抑制促炎性IFN-y产生(途径1 ), 并且可以促进调节性T细胞表型(途径3 )及抗炎性TH2细胞(途径5)。此 外，MSC可以经DC通过分泌PGE、抑制促炎性DC1细胞(途径2 )和促进 抗炎性DC2细胞(途径4 )或调节性DC (途径3 )而改变T细胞免疫应答的 结果。朝TH2免疫的移动反过来表明B细胞活性朝向增加生成IgE/IgGl亚型
抗体(途径7 )的改变。MSC通过抑制来自NK细胞的IFN-y分泌的能力而同 样调节NK细胞功能(途径6)。这种MSC:免疫细胞相互作用模型与在几个其 它实验室中进行的实验(LeBlanc等，Exp. Hematol.，第31巻，第8卯页(2003); Tse等，Transplantation,第75巻，第389页(2003); DiNicola等，Blood,第 99巻，第3838页(2002))相一致。对所提出机理的进一步检验正在进行并且 现在需要动物研究以检验MSC给药的体内作用。 实施例2
将间充质干细胞给予患有严重IV级胃肠道性移植物抗宿主病(GVHD) 的33岁女性患者。该患者抗拒全部其它GVHD治疗。患者结肠的内窥镜乂见察 显示了治疗前的溃疡及炎症区域。该患者结肠的组织学显示移植物抗宿主病在 治疗前已经摧毁该患者的绝大部分肠隐窝。
以3xl()S个细胞每公斤体重的量给予该患者静脉内输注在50 ml的Plasma LyteA中的同种异体间充质干细胞。
该患者在输注2周后进行评估。在输注两周后，患者结肠的内窥镜观察显 示治疗前可见的溃疡及炎症区域被消除。此外，患者结肠的活组织;险查显示肠 隐窝的显著再生。对该患者使用给药间充质干细胞导致胃肠道性移植物抗宿主 病的延性成分显著减少，并导致新的功能性肠组织的再生。
全部专利公开、出版物，包括出版的专利申请、保藏登录号和数据库登录 号因而完整地通过参考而相同程度地援引以至于每一专利、出版物、保藏登录 号和数据库登录号通过参考而具体和分别地加以援引。
然而将可以理解的是本发明的范围不限于以上所述的具体实施方案。本发明可以按照除具体所述之外的方式实施并且任然处于以下权利要求书的范围内。
权利要求
1. 促进动物的除心脏外的器官或组织中血管发生的方法，其包括:以有效促进所述动物的除心脏之外的器官或组织中血管发生的量，将间充质干细胞给药至该动物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述的哺乳动物是灵长类。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述灵长类是人。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，将所述间充质干细胞以约lxl05 个细胞/kg至约1 x l o7个细胞/kg的量给药。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中，将所述间充质干细胞以约1 x io6 个细胞/kg至约5 x 1(^个细胞/kg的量给药。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，将所述间充质干细胞全身性给药。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中，将所述间充质干细胞静脉内给药。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中，通过向所述动物的除心脏之外的 所述器官或组织直接注射给药所述间充质干细胞。
10.疾病的方法，其包括以有效治疗所述动物中所述疾病的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
11. 根据权利要求IO所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
13. 根据权利要求IO所述的方法，其中，所述疾病是多发性硬化。
14. 治疗动物中炎症反应的方法，其包括以有效治疗所述动物中所述炎症反应的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
17. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述炎症反应与银屑病相关。
18. 治疗动物中癌症的方法，其包括 以有效治疗所述动物中癌症的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
21. 治疗动物中变应性疾病或病症的方法，其包括 以有效治疗所述动物中所述变应性疾病或病症的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
24. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述变应性疾病或病症是关节炎。
25. 促进动物中伤口愈合的方法，其包括以有效促进所述动物中伤口愈合的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
28. 防止动物中纤维化的方法，其包括以有效防止所述动物中纤维化的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
29. 修复动物中上皮损伤的方法，其包括以有效修复所述动物中上皮损伤的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
32. 根据权利要求29所述的方法，其中，所述上皮损伤因移植物抗宿主 病所致。
全文摘要
通过向动物给药有效量的间充质干细胞而治疗此动物中自身免疫性疾病、变态反应、癌症或炎症疾病、促进伤口愈合、修复上皮损伤和促进动物器官或组织中血管发生的方法。
文档编号C12N5/00GK101384702SQ200780005860
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月26日 优先权日2004年3月22日
发明者苏地塔·阿加尔沃, 蒂莫西·瓦尼, 马克·皮滕格 申请人:奥西里斯治疗公司