专利名称：苹果花叶病毒的检测方法、检测用引物组及检测用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及苹果花叶病毒的检测方法、检测用引物组及检测用试剂盒。
背景技术：
苹果花叶病毒是属于雀麦花叶病毒(Bromovirus)属的植物病原性病毒，广泛地感染啤酒花(^/z/w7ws 7w/w7ws L.)和苹果Q/a7^ i/o/Be"i'c3 Malus)。苹果花叶病毒一旦感染啤酒花和苹果，感染灾情主要通过机械接触传播而扩大。
在德国、美国、英国和捷克等啤酒花的主要生产国以及日本，为了防止苹果花叶病毒引发的感染灾情，使用通过茎尖培养生产的无病毒苗来进行啤酒花的栽培。
在栽培啤酒花的农场，定期地进行苹果花叶病毒的感染调查，防止苹果花叶病毒的二次感染。苹果花叶病毒的感染调查中， 一般通过ELISA法检测感染了啤酒花的苹果花叶病毒。
采用ELISA法的苹果花叶病毒的检测方法由以下的步骤构成在固相化
有特异性地识别苹果花叶病毒的一级抗体的微孔板中，使检查标本中所含的苹果花叶病毒粒子和一级抗体反应的步骤；清洗未与一级抗体结合的检
查标本中的成分的步骤；使与一级抗体结合的苹果花叶病毒粒子和经酶标且特异性地识别苹果花叶病毒的二级抗体反应的步骤；清洗未与苹果花叶病毒粒子结合的二级抗体的步骤；使酶标于二级抗体的酶和化学显色底物或化学发光底物进行酶反应的步骤；根据通过酶反应得到的显色或发光的强度，估计苹果花叶病毒粒子的量的步骤。
非专利文献l:Pethybridge等，2004年，澳大利亚农业研究期刊(Australian journal of agricultural research), 55巻，765-770页发明的揭示
然而，ELISA法中使用的识别苹果花叶病毒的抗体的效价或特异性不足时，由于受到存在于检查标本中的除苹果花叶病毒以外的成分的影响，因此发生将表示苹果花叶病毒的存在的信号评价为背景的信号或将非特异性的结合评价为表示苹果花叶病毒的存在的信号等情况。
此外，采用ELISA法的苹果花叶病毒的检测方法如上所述由多个步骤构成，各步骤必须在实验室中确定反应时间和清洗次数等，于相同的条件下进行操作，检查标本数量增加时，各步骤中的操作变得烦杂，存在给正确的评价带来障碍的倾向。
另外，ELISA法是以病毒粒子本身作为目标进行检测的方法，因此无法
检出病毒基因组或整合于宿主基因组的原病毒，例如在已知苹果花叶病毒粒子的含量因高温而显著下降的夏季，即使是感染了苹果花叶病毒的啤酒花也可能被判断为可疑阳性或未检出。
于是，鉴于上述的问题，本发明的目的在于提供不限定检测苹果花叶病毒的抗体的性能(效价和特异性)、检查标本数和进行评价的场所，在栽培时、收获时、保存时等所有季节，都可特异性且高灵敏度地检测苹果花叶病毒的方法。本发明的目的还在于提供用于该方法的苹果花叶病毒的检测用引物组及检测用试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供苹果花叶病毒的检测方法，该检测方法包括从检查标本提取苹果花叶病毒的RNA的提取步骤；使用包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组，以所述RNA为模板，通过反转录环介导等温扩增(Reverse transcription-Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)法进行cDNA的扩增反应的扩增步骤；在扩增步骤中发现包含序列表的序列编号8中所示的碱基序列的cDNA的扩增的情况下，判断为存在苹果花叶病毒的判断步骤。
本发明人发现，通过利用作为等温的基因扩增反应的反转录环介导等温扩增法(以下记作RT-LAMP法)来扩增苹果花叶病毒的编码蛋白质基因的特定区域，可以简便且高灵敏度地进行苹果花叶病毒的检测。在这里，"RT-LAMP法"是指组合反转录反应和采用LAMP法的等温基因扩增反应，以RNA为模板扩增与之互补的CDNA的方法。对于原理的详细部分，记载于国际公
开第00/28082号文本。
如果按照上述检测方法，从欲调查是否感染苹果花叶病毒的啤酒花的组织提取RNA，在其提取液中加入包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组，进行采用RT-L雄P法的cDNA的扩增反应，则可以简便且高灵敏度地检测苹果花叶病毒的基因组RNA的部分序列的cDNA，能够判断是否感染苹果花叶病毒。
此外，与序列表的序列编号8中所示的碱基序列互补的苹果花叶病毒的基因组RNA的碱基序列以及由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸分别退火结合的苹果花叶病毒的基因组RNA的碱基序列为苹果花叶病毒的编码蛋白质基因的部分序列，包含这些碱基序列的苹果花叶病毒的基因组RNA的区域适合作为用于通过RT-LAMP法扩增cDNA的靶区域。因此，通过确认是否有被扩增的cDNA，可以特异性地检测苹果花叶病毒的有无。
上述扩增步骤较好是使用包含由序列表的序列编号1 6中所示的碱基序列构成的6种寡核苷酸的引物组，以所述RNA为模板，通过反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)法进行cDNA的扩增反应的步骤。
如果在由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的基础上增加由序列表的序列编号5和6中所示的碱基序列构成的2种寡核苷酸作为环引物来进行cDNA的扩增反应，则可以增加DNA合成的起点，因此能够縮短扩增时间，可实现更高效的苹果花叶病毒的检测。
此外，本发明提供包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸或由序列表的序列编号1 6中所示的碱基序列构成的6种
寡核苷酸的苹果花叶病毒的检测用引物组。
如果从欲调查是否感染苹果花叶病毒的啤酒花的组织提取RNA，在其提取液中加入上述引物组，进行采用RT-LAMP法的cDNA的扩增反应，则可以简便且高灵敏度地检测苹果花叶病毒的基因组RNA的部分序列的cDNA，能够判断是否感染苹果花叶病毒。
此外，本发明提供苹果花叶病毒的检测用试剂盒，所述试剂盒包括包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸或由
序列表的序列编号1 6中所示的碱基序列构成的6种寡核苷酸的苹果花叶病毒的检测用引物组、反转录酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。
如果有上述检测用试剂盒，则可以同时获得采用RT-LAMP法的苹果花叶病毒的检测所需的试剂，例如在野外进行苹果花叶病毒的检测时，也不需要试剂的浓度调整等烦杂的操作，可以简便地进行苹果花叶病毒的检测。
如果采用本发明，则不限定检查标本数和进行评价的场所，在栽培时、收获时、保存时等所有季节，都可特异性且高灵敏度地检测苹果花叶病毒。此外，本发明的苹果花叶病毒的检测用引物组和检测用试剂盒可良好地用于RT-LAMP法，能够实现苹果花叶病毒的简便且高灵敏度的检测。
附图的简单说明
图1是表示包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组和苹果花叶病毒的基因组RNA的靶区域的位置关系的图。
图2是表示将使用苹果花叶病毒检测用检査标本的RNA稀释试样通过RT-LAMP法扩增而得的cDNA用限制性酶Alu I或Taq I消化，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后的条带图案的凝胶照片。
实施发明的最佳方式
以下，对本发明的优选的实施方式进行详细说明。
本发明的苹果花叶病毒的检测方法的特征在于，包括从检查标本提
取苹果花叶病毒的RNA的提取步骤；使用包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组，以所述RNA为模板，通过反转录环介导等温扩增法进行cDNA的扩增反应的扩增步骤；在扩增步骤中发现包含序列表的序列编号8中所示的碱基序列的cDNA的扩增的情况下，判断为存在苹果花叶病毒的判断步骤。
"苹果花叶病毒"是指Apple Mosaic Ilarvirus，是属于雀麦花叶病毒属的RNA病毒。已知苹果花叶病毒的宿主主要是啤酒花和苹果，感染了苹果花叶病毒的啤酒花的球花产量减少，导致作为啤酒酿造所需的苦味物质
6的a酸的含量下降。
作为上述检测方法中使用的"检査标本"，可以例举例如植物的叶、茎、根和果实等，因采样容易而优选叶和果实，更优选叶。作为采集检查标本的时间，可以例举例如栽培时、收获时和保存时等。
上述提取步骤中，提取存在于被细胞壁包围的植物细胞中的苹果花叶
病毒的RNA，例如可以通过在蒸馏水或具有弱碱性附近的pH的缓冲液中将检查标本以物理方式匀浆，从而提取苹果花叶病毒的RNA。
使用的缓冲液的pH较好是例如pH8.0 pH9. 5附近，作为使用的缓冲液，可以例举例如Tris/盐酸缓冲液、Tris/醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓
冲液、硼酸缓冲液等。此外，为了更高效地从检查标本提取苹果花叶病毒的RNA，适合采用从植物提取RNA的方法和提取基因组DNA的方法，这些方法记载于例如《分子克隆(Molecular cloning)》(Maniatis等，1989年，冷泉港实验室出版社)等基因工程实验方案中。提取RNA的方法中更优选使用含异硫氰酸胍的缓冲液，提取基因组DNA的方法中更优选使用含十六烷基三甲基溴化铵(以下记作CTAB)的提取缓冲液。
匀浆只要可以破坏检査标本的细胞壁而提取存在于植物细胞中的苹果花叶病毒的RNA即可，可以使用例如宝创(Polytron)匀浆器、特富龙(Teflon)
匀浆器、研钵等进行。此外，如果在冻结的状态下对检查标本进行匀浆，则可以更高效地破坏检查标本的细胞壁，容易地提取存在于细胞中的苹果花叶病毒的RNA。此外，使用上述的含异硫氰酸胍的RNA提取缓冲液或含CTAB
的基因组DNA提取缓冲液时，仅通过用旋涡搅拌器等反复进行搅拌，就可以提取存在于细胞中的苹果花叶病毒的基因组RNA。
提取步骤中所提取的苹果花叶病毒的基因组RNA可以通过进行醇沉淀而作为沉淀回收，置换为适合于RT-LAMP法的缓冲液，在蒸馏水或具有弱碱性附近的pH的缓冲液中提取苹果花叶病毒的RNA时，也可以直接在以下的扩增步骤中使用。
扩增步骤中，使用由序列表的序列编号2和4中所示的碱基序列构成的2种寡核苷酸作为引物，以提取步骤中所提取的苹果花叶病毒的RNA为模板，进行反转录反应，紧接着使用包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组，以反转录反应中所得的CDNA为模板，反
复进行采用环介导等温扩增法(以下记作LAMP法)的等温基因扩增反应。
扩增步骤中所实施的cDNA的扩增方法被称为RT-LAMP法，通过同时在等
温条件下进行由RNA合成cDNA的反转录反应和采用LAMP法的等温基因扩增
反应，可以扩增苹果花叶病毒的基因组RNA的耙区域的部分序列的cDNA。图1是表示包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种
寡核苷酸的引物组和苹果花叶病毒的基因组RNA的靶区域的位置关系的图。序列表的序列编号7表示苹果花叶病毒的基因组RNA的靶区域的cDNA的
碱基序列。
由序列表的序列编号l中所示的碱基序列构成的寡核苷酸(以下记作ApMV-FIP引物)为FIP引物，可以如下进行设计在3，末端侧具有作为与F2c区域互补的序列的F2区域，在5'末端侧具有与Flc区域相同的序列。
由序列表的序列编号2中所示的碱基序列构成的寡核苷酸(以下记作ApMV-BIP引物)为BIP引物，可以如下进行设计在3'末端侧具有作为与B2c区域互补的序列的B2区域，在5'末端侧具有与Blc区域相同的序列。
由序列表的序列编号3中所示的碱基序列构成的寡核苷酸(以下记作ApMV-F3引物)为F3引物，可以如下进行设计具有作为与F3c区域互补的序列的F3区域。
由序列表的序列编号4中所示的碱基序列构成的寡核苷酸(以下记作ApMV-B3引物)为B3引物，可以如下进行设计具有作为与B3c区域互补的序列的B3区域。
采用RT-LAMP法的cDNA的扩增反应如下进行即可将含有提取步骤中所提取的苹果花叶病毒的RNA、包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组、反转录酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs(dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP)和缓冲液的反应液在等温条件下静置一定时间。
温度较好是5(TC 75t:，更好是60。C 65'C，进一步更好为65'C。静置时间在15分钟以上就可检出cDNA的扩增，但较好是15分钟 1小时，更好是20分钟 40分钟。作为反转录酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液，可以使用例如Loopamp RNA扩增试剂盒(荣研化学株式会社(栄研化学社)制)中所包括的各试剂。
此外，扩增步骤中，较好是使用增加了由序列表的序列编号5和6中所示的碱基序列构成的2种寡核苷酸所构成的引物的由序列表的序列编号1 6中所示的碱基序列构成的6种寡核苷酸的引物组来代替包含由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组。
由序列表的序列编号5中所示的碱基序列构成的寡核苷酸(以下记作ApMV-环F引物)和由序列表的序列编号6中所示的碱基序列构成的寡核苷酸(以下记作ApMV-环B引物)是具有与成为扩增反应的起点的哑铃结构的5，末端侧的环的单链部分互补的序列的环引物。ApMV-环F可以如下进行设计具有与图中的F1区域和F2区域之间的序列互补的序列；ApMV-环B可以如下进行设计具有与图中的B1区域和B2区域之间的序列互补的序列。通过使用ApMV-环F和ApMV-环B，可以增加DNA合成的起点，扩增效率提高，能够将扩增所需的时间縮短至1/3 1/2。
判断步骤中，在上述扩增步骤中发现重复包含序列表的序列编号8中所示的碱基序列的cDNA的扩增的情况下，可以判断为存在苹果花叶病毒。
序列表的序列编号8中所示的碱基序列是苹果花叶病毒的基因组RNA的靶区域的部分序列的cDNA,是通过采用上述引物组的RT-L細P法被反复扩增的核心序列。与该核心序列互补的苹果花叶病毒的基因组RNA的碱基序列以及由序列表的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸分别退火结合的苹果花叶病毒的基因组RNA的碱基序列为苹果花叶病毒的编码蛋白质基因的部分序列，包含这些碱基序列的苹果花叶病毒的基因组RNA的区域适合作为用于通过RT-LAMP法扩增cDNA的靶区域。因此，通过确认是否有被扩增的cDNA，可以特异性地检测苹果花叶病毒的有无。
苹果花叶病毒的有无的判断例如可如下进行通过肉眼观察进行采用RT-LAMP法的cDNA的扩增反应后的反应液，发现反应液产生白浊的情况下，判断为存在苹果花叶病毒。此外，可如下进行在该反应液中加入荧光嵌入剂，在UV照射下发现表示cDNA扩增的发光的情况下，判断为存在苹果花叶病毒。
更细致地判断苹果花叶病毒的有无时，例如可如下进行将所扩增的
cDNA用存在于序列表的序列编号8中所示的碱基序列中的限制性酶Alu I或 Taql消化并进行电泳，在分别发现134bp和75bp的2个DNA片段或发现209bp 的DNA片段的情况下，判断为存在苹果花叶病毒。
本发明的苹果花叶病毒的检测用引物组的特征在于，包含由序列表的 序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸，或包含由序列表的序 列编号1 6中所示的碱基序列构成的6种寡核苷酸。
上述的引物组可以基于序列表的序列编号1 6各自的碱基序列信息通 过DNA合成机合成。
此外，使用本发明的苹果花叶病毒的检测方法所需的各种试剂类可以 预先封装而试剂盒化。具体来说，能够以试剂盒的形式提供包含由序列表 的序列编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸或由序列表的序列 编号1 6中所示的碱基序列构成的6种寡核苷酸的引物组、作为核酸合成的 底物的4种dNTPs(dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP)、由RNA合成cDNA的反转录酶、 具有链置换活性的链置换型DNA聚合酶、提供适于酶反应的条件的缓冲液、 作为辅助因子的盐类(镁盐或锰盐等)、使酶和模板稳定的保护剂以及根据 需要采用的反应生成物的检测所需的试剂类。
试剂盒中可以包含用于确认RT-LAMP反应通过本发明的引物正常地进 行的阳性对照。作为阳性对照，可以例举例如包含被本发明的引物扩增的 区域的DNA。
实施例
以下，例举实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不受到这 些实施例的限定。
(实施例l)采用RT-LAMP法的苹果花叶病毒的检测 l)苹果花叶病毒的检测中使用的啤酒花组织样品的制备 将从来源于感染了苹果花叶病毒的啤酒花的腋芽的啤酒花试管苗除去 根而得的样品作为苹果花叶病毒检测用检查标本，将从无病毒的啤酒花试 管苗除去根而得的样品作为对照检査标本，由这些检查标本分别制备啤酒花组织样品。
苹果花叶病毒检测用检查标本和对照检查标本分别用液氮冷冻，用研 钵粉碎至组织形成粉末状，向其中加入相对于检查标本重量5倍量的蒸馏水 而悬浮。这样得到的苹果花叶病毒检测用检査标本和对照检査标本的悬浮 液分别作为啤酒花组织样品用于以下的实验。
2) RNA试样的制备
向各啤酒花组织样品(各40u L)分别加入160ixL的2XCTAB溶液(2X十 六垸基三甲基溴化铵、20mMEDTA、 1. 4MNaCl、 5% 0 -巯基乙醇、0. lMTris， pH 9.5)，在65。C保温20分钟。然后，以15000转离心分离IO分钟，将残渣 作为沉淀除去，将其上清移至新的微量离心管。向其中加入200ixL的异丙 醇混合，以15000转离心分离10分钟，从而将RNA作为沉淀回收，用70%乙 醇清洗后风干，用40uL灭菌水溶解而制成RNA试样。
这样得到的苹果花叶病毒检测用检查标本的RNA试样和对照检査标本 的RNA试样分别用灭菌水梯度稀释至103倍、104倍、105倍、106倍和107倍，将 其中的2n L作为RNA稀释试样供于采用RT-LAMP法的cDNA的扩增反应。RNA稀 释试样分别相当于啤酒花组织样品的2X1()4分之一、2X105分之一、2X106 分之一、2X1()7分之一和2X108分之一。
3) RT-LAMP法中使用的引物
引物采用作为FIP引物的ApMV-FIP引物(序列编号l)、作为BIP引物的 ApMV-BIP引物(序列编号2)、作为F3引物的ApMV-F3引物(序列编号3)、作为 B3引物的ApMV-B3引物(序列编号4)、作为环引物的ApMV-环F(序列编号5)和 ApMV-环B(序列编号6)。通过使用这6种引物进行采用RT-LAMP法的cDNA的扩 增反应，可以扩增重复包含作为苹果花叶病毒的编码蛋白质基因的cDNA的 部分序列的序列表的序列编号8中所示的碱基序列的cDNA。
4) 采用RT-LAMP法的cDNA的扩增
采用RT-LAMP法的cDNA的扩增使用Lo叩amp RNA扩增试剂盒(荣研化学 株式会社制)进行。具体来说，按照制造商的实验方案，向反应液中分别加 入经梯度稀释的上述RNA稀释试样(2u 1)，向其中加入上述的6种引物、反 转录酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液，在65'C静置50分钟。5)经扩增的cDNA的检测
确认采用RT-LAMP法的cDNA的扩增的情况下，游离的焦磷酸与镁离子反 应而形成焦磷酸镁，因此反应液产生白浊时可判定为发现cDNA的扩增。通 过上述的采用RT-LAMP法的cDNA的扩增所扩增的cDNA是相当于苹果花叶病 毒的编码蛋白质基因的cDNA的部分序列的序列表的序列编号8中所示的碱 基序列，因此反应液产生白浊时判断为存在苹果花叶病毒。
表1为使用苹果花叶病毒检测用检查标本的RNA稀释试样和对照检查标 本的RNA稀释试样通过RT-LAMP法进行苹果花叶病毒的检测的结果。
自啤酒花组织样品 的稀释倍数2X1042X1052X1062X1072X108
啤酒花潜隐病毒检 测用检查标本白浊白浊白浊白浊ND
对照检查标本NDNDNDNDND
ND:表示未发现白浊
其结果为，对照检查标本的RNA稀释试样都未检出苹果花叶病毒，但对 于苹果花叶病毒检测用检査标本的RNA稀释试样，即使将啤酒花组织样品稀 释2X10'倍也可以检出苹果花叶病毒。根据以上的结果，明确采用RT-LAMP 法的检测中，仅感染了苹果花叶病毒的苹果花叶病毒检测用检查标本检出 了苹果花叶病毒，示意检测灵敏度远远高于后述的采用ELISA法的检测。
然而，RT-LAMP法中，即使在cDNA被非特异性地扩增的情况下也发现反 应液的白浊，因此通过以下的实验进行确认试验。具体来说，使用苹果花 叶病毒检测用检查标本的RNA稀释试样的采用RT-L認P法的cDNA的扩增反应 中，将luL发现了cDNA的扩增的各反应液用限制性酶AluI或TaqI消化， 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分别确认是否检出134bp和75bp的2个DNA片段 或209bp的DNA片段。Alu I禾BTaq I存在于序列表的序列编号8中所示的碱基 序列中，因此通过用限制性酶Alu I或Taq I消化，可以将通过RT-LAMP法扩 增了的cDNA分别作为134bp和75bp的2个DNA片段或209bp的DNA片段检出。电 泳后的凝胶通过在溴化乙啶中浸渍10分钟而将被分离的DNA片段染色，通过 照射紫外线，可以观察到DNA条带。
12图2是表示将使用苹果花叶病毒检测用检査标本的RNA稀释试样通过 RT-LAMP法扩增而得的cDNA用限制性酶Alu I或Taq I消化，进行聚丙烯酰胺 凝胶电泳后的条带图案的凝胶照片。
其结果为，采用RT-LAMP法的cDNA的扩增反应中发现白浊，表l中检出 了苹果花叶病毒的各反应液中的cDNA通过用限制性酶AluI或Taq I消化都 分别检出134bp和75bp的2个DNA片段或209bp的DNA片段的条带。将用Taq I 消化了的cDNA进行电泳而得的泳道的凝胶中，除了209bp的主条带之外，还 发现155bp、 98bp、 53bp的次条带，由于采用LAMP法的cDNA的扩增反应中， 靶区域的部分序列的cDNA在相连的状态下被扩增，因此除了209bp的主条带 之外还发现155bp、 98bp、 53bp的次条带的结果可以说是正确的结果。
根据以上的结果，上述的实施例l中，证明通过RT-LAMP法发现了表示 cDNA的扩增的白浊的情况下，并不是发生了非特异性的cDNA的扩增，而是 苹果花叶病毒的编码蛋白质基因的一部分特异性地扩增，明确苹果花叶病 毒的检测是取决于苹果花叶病毒的存在的结果。
因此，示意实施例1中所示的采用RT-LAMP法的苹果花叶病毒的检测方 法是灵敏度远远高于后述的釆用ELISA法的苹果花叶病毒的检测的方法，是 仅通过视觉上判断反应液的白浊就可以容易地判定苹果花叶病毒的有无的 方法。
(比较例l)采用ELISA法的苹果花叶病毒的检测
1) 苹果花叶病毒的检测用ELISA用板的制作
将特异性地识别苹果花叶病毒的抗苹果花叶病毒抗体(阿格利雅公司 (7夕、、U了社)，美国)用O. 05MSCB缓冲液(1. 59g/LNa2C03、 2. 93g/L NaHCO" pH9.6)稀释至lu g/mL，以每孔O. 2mL注入96孔微孔板，在37"C静置4小时。 然后，用O. 02MPBS-T(8. Og/LNaCl、 0. 2g/L歸04、 2. 9g/L Na2HP04 12H20、 0.2g/L KC1、 0.5mL/L吐温-20， pH7. 4)以5分钟的间隔清洗5次，将这样得 到的抗体固相板作为苹果花叶病毒的检测用ELISA用板用于以下的试验。
2) 采用ELISA法的检测
向实施例l中记载的由苹果花叶病毒检测用检查标本和对照检查标本 的悬浮液制成的各啤酒花组织样品(各40uL)加入160uL蒸馏水，再加入20L的PBS-T/PVP溶液(16. 0g/L NaCl、 0. 4g/L KH2P04、 5. 8g/L Na2HP04 1 2H20、 0. 4g/L KC1、 1. OmL/L吐温-20、 40g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH7.4)混合， 以15000转离心分离10分钟，回收其上清作为蛋白质试样(200nL)。
然后，苹果花叶病毒检测用检査标本和对照检查标本的蛋白质试样分 别用PBS-T/PVP溶液梯度稀释至10倍、102倍、103倍，分别取200uL作为蛋 白质稀释试样供于ELISA。未稀释的蛋白质试样相当于啤酒花组织样品的二 分之一，梯度稀释至10倍、102倍、103倍的蛋白质稀释试样分别相当于啤酒 花组织样品的20分之一、2X1()2分之一、2X103分之一。
接着，将蛋白质试样和各蛋白质稀释试样(各200 u L)分别添加至上述 的ELISA用板，静置一晚。用0.02M PBS-T以5分钟的间隔清洗5次，以每孔2 OOwL加入将碱性磷酸酶标记的抗苹果花叶病毒抗体(阿格利雅公司，美国) 用0. 02M PBS-T稀释1000倍而得的试剂，在37t:静置3小时。然后，将ELISA 用板的各孔用0.02M PBS-T以5分钟的间隔清洗5次，加入200 u L的底物溶液 (10%二乙醇胺、lg/L对硝基苯磷酸二钠)，在室温下使其反应一定时间， 测定405nm的吸光度。
表2为使用苹果花叶病毒检测用检查标本的蛋白质试样及各蛋白质稀 释试样以及对照检查标本的蛋白质试样及各蛋白质稀释试样通过ELISA法 进行苹果花叶病毒的检测的结果。
自啤酒花组织样品 的稀释倍数2202X1022X103
啤酒花潜隐病毒检 测用检查标本白浊白浊NDND
对照检查标本NDNDNDND
ND:表示未发现白浊
其结果为，对照检査标本的RNA稀释试样都未检出苹果花叶病毒，但对
于苹果花叶病毒检测用检查标本的蛋白质试样及各蛋白质稀释试样，至将 啤酒花组织样品稀释20倍而得的试样为止，都可以检出苹果花叶病毒。根 据以上的结果，可以确认采用ELISA法的检测中，仅感染了苹果花叶病毒的 苹果花叶病毒检测用检査标本检出了苹果花叶病毒，正常地检出了苹果花
14叶病毒，但明确与上述的采用RT-LAMP法的检测相比，检测灵敏度至少低106 倍(100万倍)。
产业上利用的可能性
如果采用本发明，则不限定检查标本数和进行评价的场所，在栽培时、 收获时、保存时等所有季节，都可特异性且高灵敏度地检测苹果花叶病毒。 此外，本发明的苹果花叶病毒的检测用引物组及检测用试剂盒可良好地用于
RT-LAMP法，能够实现苹果花叶病毒的简便且高灵敏度的检测。
权利要求
1.苹果花叶病毒的检测方法，其特征在于，包括从检查标本提取苹果花叶病毒的RNA的提取步骤；使用包含由序列表的序列编号1～4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组，以所述RNA为模板，通过反转录环介导等温扩增法进行cDNA的扩增反应的扩增步骤；在所述扩增步骤中发现包含序列表的序列编号8中所示的碱基序列的cDNA的扩增的情况下，判断为存在苹果花叶病毒的判断步骤。
2. 如权利要求l所述的检测方法，其特征在于，所述扩增步骤是使用 包含由序列表的序列编号1 6中所示的碱基序列构成的6种寡核苷酸的引 物组，以所述RNA为模板，通过反转录环介导等温扩增法进行cDNA的扩增反 应的步骤。
3. 苹果花叶病毒的检测用引物组，其特征在于，包含由序列表的序列 编号1 4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸。
4. 苹果花叶病毒的检测用引物组，其特征在于，包含由序列表的序列 编号1 6中所示的碱基序列构成的6种寡核苷酸。
5. 苹果花叶病毒的检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求3或4 所述的引物组、反转录酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。
全文摘要
本发明提供苹果花叶病毒的检测方法，该检测方法包括从检查标本提取苹果花叶病毒的RNA的提取步骤；使用包含由序列表的序列编号1～4中所示的碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组，以所述RNA为模板，通过RT-LAMP法进行cDNA的扩增反应的扩增步骤；在扩增步骤中发现包含序列表的序列编号8中所示的碱基序列的cDNA的扩增的情况下，判断为存在苹果花叶病毒的判断步骤。
文档编号C12N15/09GK101563452SQ20078004424
公开日2009年10月21日 申请日期2007年11月26日 优先权日2006年11月30日
发明者冈田行夫, 糸贺裕 申请人:札幌啤酒株式会社