肾源细胞及在组织修复和再生中的使用方法

专利名称：肾源细胞及在组织修复和再生中的使用方法
肾源细胞及在组织修复和再生中的使用方法 相关申请的交叉参考 推定的人祖细胞分离自尸体肾脏的肾组织。这些细胞的 分离基于针对表面标记CD133的磁珠细胞分离。进一步的实验表明， 肾源CD133+细胞有能力在培养物中扩增，并在体外分化为上皮细胞 或内皮细胞。在植入SCID小鼠中时，CD133+细胞形成表达肾上皮标 记的管状结构。另外，静脉内注射到具有甘油诱导的肾小管坏死的小 鼠中的CD133+细胞迁移并整合到受伤的肾脏组织中。Bussolati等, 0/尸W/2o/ogy, 166: 545-555, 2005。这些数据表明，祖细胞 存在于人肾脏组织中，它们可能在肾修复中起作用。然而，在成人肾 脏组织中驻留的CD133+细胞群非常低，因此对基于异种的细胞疗法 是不切实际的。最近鉴定器官特异性干细胞的方法利用基于祖细胞流 出Hoechst 33342染料的能力的分离方法。表现出该能力的细胞被称 为SP(侧群)细胞，已显示出可变程度的干细胞特征。研究已表明，啮 齿动物肾脏的肾间质含有SP细胞。另夕卜，将肾SP细胞输注入患有急 性肾衰竭的小鼠中。Hishikawa等人，J. o/CW/169: 921-928, 2005。这些细胞似乎迁移到胞间隙，并在受损的肾组织修复中起作用。
然而，仍要确定在人肾脏组织中存在SP细胞。在本领域需要改善的 哺乳动物或人肾源细胞源用于细胞疗法，该细胞源可分离自正常哺乳
动物或人肾脏组织，并在细胞培养物中生长。 发明概述 本发明提供得自哺乳动物肾脏组织的分离或纯化的哺 乳动物肾源细胞群。提供用于分离和純化哺乳动物肾源细胞群的方 法。独特的哺乳动物肾源细胞群的特征在于表型特征，例如形态、生 长潜力、表面标记表型、早期发育基因表达和肾发育基因表达。表面 标记和基因表达表型在哺乳动物肾源细胞群于培养物中多次传代后仍被保留。
0007]在本发明的一个方面，4是供分离或纯化的哺乳动物肾源
细胞群，所述细胞群能够在培养物中自我更新和扩增，其中所述细胞
群对Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、钩粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一种的表达 为阳性，且对Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少 一种的表达为阴性。在一个实施方案中，所述细胞对Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一种的表达为 阳性，且对Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一种的表达为阴性。 本发明的又 一 方面涉及选择性富集或分离哺乳动物肾 源细胞群的方法。该方法包括由哺乳动物肾脏的包膜下区、皮质或髓 质获得组织，在金属蛋白酶、中性蛋白酶或粘多糖酶存在下温育组织， 将细胞接种在组织培养容器中，鉴定对Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、钓粘素 -11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一种的表达为阳性并对Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一种的表达为阴性的细胞群，并分离 哺乳动物肾源细胞群。在又一方面，细胞群对细胞表面标记HLAI、 CD24、 CD29、 CD44、 CD49c、 CD73、 CD166或SSEA-4中的至少一 种为阳性，且对细胞表面标记HLAII、 CD31、 CD34、 CD45、 CD56、 CD80、 CD86、 CD104、 CD105、 CD117、 CD133、 CD138、 CD141 或E-钙粘素中的至少 一种为阴性。 提供分离的或纯化的哺乳动物肾源细胞群，所述细胞群 能够在培养物中自我更新和扩增，其中所述细胞群对Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、钙粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC誦R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一种的表达为阳性，并对Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一种的表达为阴性。 分离的或纯化的哺乳动物肾源细胞群是稳定的，并能够在细胞培养物 中自我更新和扩增。在一个实施方案中，细胞对Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一种的表达为阳性，并 对Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一种的表达为阴性。所述细胞 群对于哺乳动物患者的同种异体移植为非免疫原性的，证据是发现分 离或纯化的哺乳动物肾源细胞群对细胞表面标记HLAI为阳性，并对 细胞表面标记HLAII、 CD80或CD86中的至少一种为阴性。
0018哺乳动物肾源细胞群可以分泌营养因子FGF2、 HGF、 TGFa、 TIMP-1、 TIMP-2、 MMP-2或VEGF中的至少一种，且不分 泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。所述细胞群可来源于 人、灵长类动物或啮齿类动物的肾包膜下区、肾皮质或肾髓质。哺乳 动物肾源细胞群可以包括肾祖细胞。肾祖细胞能够分化为不同的细胞 谱系，例如脂肪细胞或成骨细胞。
来源于哺乳动物肾源细胞群的分化细胞还可以用于治 疗疾病，例如急性肾衰竭、急性肾炎综合征、镇痛剂肾病、动脉粥样 硬化栓塞性肾病、慢性肾衰竭、慢性肾炎、先天性肾病综合征、晚期 肾病、Goodpasture综合征、IgM肾小5求膜增殖性肾小球肾炎、间质性 肾炎、肾脏癌症、肾癌、肾上腺样瘤；肾细胞腺癌、肾脏损伤、肾脏 感染、肾脏伤害、肾结石、狼疮肾炎、膜增生性GNI、膜增生性GN II、膜性肾病、微小病变肾病、坏死性肾小球肾炎、肾胚细胞瘤、肾 钙质沉着症、肾原性尿崩症、肾病-IgA、肾变病(肾变病综合征)、多 嚢性肾脏疾病、链球菌感染后GN、反流性肾病、肾动脉栓塞、肾动 脉狭窄、肾障碍、肾乳头坏死、肾小管酸中毒I型、肾小管酸中毒II 型、肾低灌注或肾静脉血栓症。0064] 哺乳动物肾源细胞群可用于将细胞移植到哺乳动物中， 包括给予自体、同种异体或异体细胞，以恢复或修正哺乳动物的组织 特异性代谢、酶、结构或其它功能。所述细胞可用于将细胞移植到哺 乳动物中，引起细胞类型的体内分化，以及可用于将哺乳动物肾源细 胞给予到哺乳动物中。.细胞或其体外或体内的分化子代，可用于修正 遗传疾病、退化性疾病或癌症疾病过程。
用于制备本文所述的载体装置、支架或基质的聚合物为 生物可降解的和生物可相容的。生物可降解的聚合物在接触湿润的机 体组织时易于分裂为小片段。然后这些片段被机体吸收，或者透过机 体。更具体地说，生物降解性片段不激发长期慢性外源性机体反应， 因为它们^皮机体吸收或由机体排除，使得没有永久性的痕量或残留片 段一皮机体保 留。
就涉及分泌性蛋白(如激素、酶、细胞因子、生长因子等) 缺陷的疾病而言，可通过使用含有哺乳动物肾源细胞群的扩增的细胞 制备物，治疗涉及肾脏系统的疾病之外的疾病。将编码靶蛋白的基因 转移到哺乳动物肾源细胞群中，处于适宜的启动子控制之下，可诱导 和表达缺陷蛋白。可控制蛋白的表达，以获得与体内天然表达所获的 活性相同的活性。
可使用众多载体中的任一种工程改造本发明的哺乳动 物肾源细胞群，所述载体包括但不限于整合病毒载体，例如逆转录病 毒载体或腺相关病毒载体；非整合复制载体，例如乳头瘤病毒载体、 SV40载体、腺病毒载体；或复制缺陷型病毒载体。将DNA导入细胞 中的其它方法包括使用脂质体、电穿孔、粒子枪或直接DNA注射。
在导入外源DNA之后，可使工程改造的细胞在富集培 养基中生长，然后转换至选择培养基。在外源DNA中的选择标记赋 予对选择的抗性，使细胞将例如质粒上的外源DNA稳定整合入其染 色体中，并培养至形成基因座(foci),其又可被克隆和扩增入细胞系中。 该方法可有利地用于工程改造表达基因产物的细胞系。10080任何启动子均可用于驱动插入基因的表达。例如，病毒启动子包括但不限于CMV启动子/增强子、SV40、乳头瘤病毒、EB 病毒或弹性蛋白基因启动子。优选地，用于控制目标基因表达的控制 元件应允许调节基因表达，使得仅在需要时在体内合成产物。如果需 要瞬时表达，则优选在非整合栽体和/或复制缺陷型载体中使用组成型 启动子。或者，可在需要时用诱导型启动子驱动摻入基因的表达。0081] 诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白和热激蛋白 相关的那些启动子。已描述了表现出组织特异性的转录控制区的实 例。例如，促红细胞生成素启动子是肾脏组织特异性的；大容量(2型) NaV葡萄糖协同运输基因(Sg/G)，该基因是仅在肾脏的早期近端小管 中表达的基因；人有机阴离子转运体3 (hOAT3/SLC22A8)主要在肾脏 的近端小管中表达。00821 本发明的细胞可4皮基因工程改造，以"敲除"在植入部 位促进炎症或排斥的因子的表达。下文论述了降低目标基因表达水平 或目标基因产物活性水平的负调节技术。本文使用的"负调节"是指 在没有调节性治疗的情况下，目标基因产物的水平和/或活性相对于该 目标基因产物的水平和/或活性的下降。可使用众多技术降低或敲除哺 乳动物肾源细胞的天然基因表达，所述技术包括例如使用同源重组技 术通过完全失活基因(通常称为"敲除，，)抑制表达。通常，编码蛋白 的重要区域的外显子被正选择标记如neo中断，阻止由耙基因产生正 常mRNA，并导致该基因失活。还可以通过产生部分基因缺失或通过 缺失整个基因失活基因。使用具有和靶基因同源的、在基因组中离得 很远的两个区域的构建体，可以缺失插入两个区域的序列(Mombaerts 等人，1991, P亂淑.Jcad. 88:3084)。|0083抑制耙基因表达的反义的DNA酶和核酶分子也可以按 照本发明用于降低輩巴基因活性水平。例如，反义RNA分子抑制主要 组织相容性基因复合物(HLA)的表达，已表明其对免疫应答最通用。 反义RNA分子包括但不限于SiRNA寡核苷酸或产生SiRNA寡核苷 酸的cDNA。更进一步，三股螺旋分子可用于降低耙基因活性水平。280084] 这些技术详述于L.G. Davis等人(编著)，1994,万oy/c A/"/70(is z力A/o/ecw/ar S/o/ogy,第2版,Appleton & Lange, Norwalk， Conn.，其整体在此引入作为参考。
哺乳动物肾源细胞群可用于治疗导致发病或降低平均 寿命的疾病或慢性病症。这些病症和疾病包括但不限于急性肾衰竭、 急性肾脏综合征、镇痛剂肾病、镇痛剂肾病、动脉粥样硬化栓塞性肾 病、慢性肾病、慢性肾炎、先天性肾病综合征、晚期肾病、Goodpasture 综合征、IgM肾小球膜增殖性肾小球肾炎、间质性肾炎、肾脏癌症、 肾癌、肾上腺样瘤；肾细胞腺癌、肾脏损伤、肾脏感染、肾脏伤害、 肾结石、狼疮肾炎、膜增生性GNI、膜增生性GNII、膜性肾病、微 小病变肾病、坏死性肾小球肾炎、肾胚细胞瘤、肾钙质沉着症、肾原 性尿崩症、糖尿病视网膜病、肾病-IgA、肾变病(肾变病综合征)、多 嚢性肾脏疾病、链球菌感染后GN、反流性肾病、肾动脉栓塞、肾动 脉狭窄、肾障碍、肾乳头坏死、肾小管酸中毒I型、肾小管酸中毒II 型、肾低灌注或肾静脉血栓症。临床管理策略经常集中于预防进一步 的损伤或伤害，而不是置换或修复受损组织(例如肾小管、肾小球、神 经元、胶质细胞、心肌)。临床管理策略包括用外源类固醇类和合成的 非细胞药物治疗，成功的程度不定，可取决于类固醇或合成药物的持 续给药。
同样，任选地通过重复过程可以修饰分化细胞的人白细 胞抗原(HLA)谱，其中分化细胞接触正常的同种异体淋巴细胞，并选 择存活细胞。或者，使用定向诱变方法消除分化细胞表面的HLA标 记，将由此产生的修饰的分化细胞植入需要此植入的受体哺乳动物 中。
本发明的细胞和组织可以用作研究生理学或病理学状况的^^型系统。例如，本发明的哺乳动物肾源细胞群可用于研究疾病 状态，例如急性肾衰竭、'隄性肾衰竭、肾脏癌症、肾癌、肾上腙j羊瘤； 肾细胞腺癌、肾脏损伤、肾脏感染、肾脏伤害、肾结石、狼疮肾炎、 多嚢性肾脏疾病或肾静脉血栓症。
基本上，随着新鲜培养基通过三维培养物，生物产物从 培养物洗出，然后可以如上由流出物分离。
依据本说明书，将细胞给予患者的多种方法对本领域技 术人员是显而易见的。这些方法包括将细胞注射入患者的靶部位。可 将细胞插入传递装置中，该装置有利于通过注射入或植入患者中导 入。这类传递装置可以包括用于将细胞或流体注射入受体患者机体中 的管，例如导管。在优选的实施方案中，所述管另外具有针头，例如 注射器，通过其可将本发明的细胞导入到患者的目标位置。在优选的35实施方案中，哺乳动物肾源细胞群配制用于经导管给予到血管中(其中 术语"导管"意在包括多种管样系统中的任一种，用于将物质传递至 血管)。或者，可将细胞插入支架中或插在支架上，所述支架包括但不 限于纺织物，如梭织、针织、编织、筛，和非纺织物、打孔胶片、海 绵和泡沫材料，以及珠，例如固体或多孔珠、微粒、纳粒等。细胞可 被制备用于以多种不同形式传递。例如，细胞可以悬浮在溶液或凝胶 中。细胞可与本发明的细胞在其中保持存活的药学上可接受的载体或 稀释剂混合。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性緩冲溶液、 溶剂和/或分散介质。这些载体和稀释剂的用途在本领域众所周知。溶 液优选为无菌的和液体，并经常是等渗的。优选地，溶液在生产和储 存条件下是稳定的，并通过使用例如尼泊金酯、氯丁醇、苯酚、抗坏 血酸、硫柳汞等防腐，以对抗微生物如细菌和真菌的污染作用。
给予哺乳动物肾源细胞群(例如对Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一种的表达为阳性且对 Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一种的表达为阴性的细月包)的方式 包括但不限于系统、肾脏内、静脉内或动脉内注射和直接注射入组织 中的预期作用部位。制备物可通过任何常规途径给予，例如通过输注 或浓注，并可以与其它生物活性药物一起给予。给药优选是系统的。 最优选地，给药部位接近或最接近预期作用部位。就患者罹患全身缺 血时的情况而言，优选系统给药，例如静脉内给药。无意受机制束缚， 含有哺乳动物肾源细胞群的组^^物在给予时，响应于由于伤害产生的 趋化因子而迁移或归巢至缺血组织，例如肾脏中的缺血组织。可通过 本发明方法治疗的缺血组织包括但不限于肾缺血。
本文描述的方法提供了连同细胞给予 一起给予患者的 重组多肽或药物。多肽或药物可在给予细胞之前、同时或之后给予患 者。在一个优选的实施方案中，重组多肽或药物促进血管新生、血管 发生或这二者。在另一个实施方案中，重组多肽或药物促进哺乳动物 肾源细胞群的增殖或分化。在一个实施方案中，重组多肽为VEGF、FGF2、 SDF、 CXCR-4或CXCR-5，或其保留了对缺血组织的治疗活 性的片段。
本发明的一个方面进一步提供一种药学制剂，其包含(a) 哺乳动物肾源细胞群，例如对Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一种的表达为阳性且对Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一种的表达为阴性的细胞，和药学上可接受的 载体。在某些实施方案中，所述制剂包含104至109个哺乳动物肾源细 胞。在又一个实施方案中，所述制剂准备通过导管给药。
在适宜的情况下和除非另有说明，否则将使用常规的细胞生物学技术、细胞培养技术、分子生物学技术、转基因生物学技术、微生物学技术、病毒学技术、重组DNA技术和免疫学技术实施本发 明，这些技术在本领域的知识范围内。这些技术在文献中描述。参见 例3口 A/o/ecw/ar C7om力gv j Z/<ar6<9rdto/7 A/orwwa/，第3片反,Sambrook和 Russell编著(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001);论文她^挂 5"拜膨/ogy (Academic Press, Inc., N.Y.); 版wgy4油力Ofifes,第2版， Harlow and Lane， Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; CWm^ 尸rotoc0/5 z'w Ce〃 5/o/ogy， 由Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford和Yamada编著，John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999。
将消化物以150 x g离心5分钟，吸出上清液。将产生 的细胞沉淀重悬浮在20 ml REGM或MSCGM中。细胞悬浮液通过40-微米尼龙BD FALCON细胞滤网(BD Biosciences, San Jose, CA)过滤。 将滤过液重悬浮在培养基(总体积50 ml)中，并以150 x g离心5分钟。 吸出上清液，将细胞沉淀重悬浮在50 ml新鲜培养基中。再重复该过 程2次。
总之，肾源细胞在培养物中具有强壮的生长潜力。这些 数据可用于估计由1个完整人肾脏产生的细胞总数。如果所有的肾脏 组织都被处理，且产生的细胞培养达31次群体倍增，则1个完整人 肾脏应产生估计1.89><1016个总细胞。因此，考虑到细胞的1个治疗剂 量为lxl()S个细胞/人，分离自单个肾脏的肾源细胞将足以治疗1.89亿 名患者。最后，这些细胞是用于基于同种异体的细胞疗法的高度可扩 增的细胞来源。实施例4肾源细胞表面标记表型0129对肾源细胞进行流式细胞术分析，以确定表面标记表 型。得自实施例1的9个分离林的细胞在T75烧瓶上的REGM中于 37°C和5%二氧化碳中被扩增至第4代和第10代。用PBS洗涤粘附 细胞，并用TrypLE Select (Gibco, Grand Island, NY)解离。收获、离心细胞，并以2xl()S个细胞/ml的浓度重悬浮在3% (v/v) FBS的PBS溶 液中。将特异性抗体加至100pl细胞悬浮液，并将混合物在黑暗中于 4°C温育30-45分钟。在温育后，用PBS洗涤细胞，并离心以除去过 量的抗体。将细胞重悬浮在500 ^1PBS中，并通过流式细胞术分析。 用Guavai殳备4义器(Guava Technologies, Hayward, CA)进4亍流式细』包术 分析。用于表征表面标记表型的抗体示于表3。表3:用于表征肾源细胞的细胞表面标记表型的抗体。抗体生产商目录号CD34BD Pharmingen555821CD44BD Pharmingen555478CD45RBD Pharmingen555489CD117BD Pharmingen340529CD141BD Pharmingen559781CD31BD Pharmingen555446CD49cBD Pharmingen556025CD73BD Pharmingen550257CD90BD Pharmingen555596HLA-IBD Pharmingen555553HLA-IIBD Pharmingen555558CD133Miltenyi Biotech120-001-243SSEA4R&D SystemsFAB1435PCD105SantaCruz BiotechSC-21787CD104BD Pharmingen555720CD166BD. Pharmingen559263CD29BD Pharmingen555442CD24BD Pharmingen555428CD56AbCAMMEM188CD138BD Pharmingen550805CD80BD Pharmingen55722643CD86BD Pharmingen555659E-钙粘素BD Pharmingen612130IgG-FITCBD Pharmingen555748IgG-PEBD Pharmingen555749
表4显示了所有表面标记表型数据的汇总。所测试的所 有分离抹都显示出对CD24、 CD29、 CD44、 CD49c、 CD73、 CD166、 SSEA-4和HLAI正染色和对CD31、 CD34、 CD45、 CD56、 CD80、 CD86、 CD104、 CD105、 CD117、 CD133、 CD138、 CD141、 E4丐粘 素和HLAII负染色。另外，所分析的所有分离抹都扩增多代(10代)， 仍保留其表面标记表型。
总之，这些数据证实，可在多个条件(表l)下由多个供 体分离肾源细胞，但仍保留其表面标记表型。另外，它们表达推定的 祖细月包标记，如CD24和SSEA-4， ^旦不表达成熟的谱系-定向标记， 如E-钙粘素。最后，肾源细胞是非免疫原性的，因此是用于同种异体 细胞治疗的有吸引力的细胞来源。表4:表面标记分析的汇总。未测定(ND)。正染色(+)。负染色(-)。分离抹表面标记又名12 17 18 19 20 21 22 23 24CD29Bl-整联蛋白+++++++++CD44HCAM+++++++++CD49Ca3-整联蛋白NDND+++++++CD166ALCAM+++++++++CD24热激抗原-1ND+++++++CD73SH3NDND+++++++CD90Thy-lNDND+++++++SSEA4无+++++++++CD31PECAM画1CD34gpl05CD45Ly5CD56NCAMNDNDCD104b4-整联蛋白CD138Syndecan-lNDCD141血栓调节蛋白E-钙粘素无CD105内皮糖蛋白CD117c-KitCD 133AC133CD80B7画lNDNDNDNDNDCD86B7-2NDNDNDNDNDNDNDHLAIMHC-a,b,cNDNDNDNDNPND++HLAII固C-DP ,DQ, DRNDNDNDNDND实施例545肾源细胞基因表达
总之，这些数据证实，肾源细胞是推定的肾祖细胞源， 其可用于基于细胞的疗法，以保护或修复受损的肾脏组织。实施例6营养因子分泌分析01391已表明肾源细胞始终生产保护和修复肾脏的营养因子。 因此，这些细胞可用作治疗肾脏疾病的治疗剂。01401 将得自分离抹17-21的第3代细胞以5,000个细胞/cm2、 1个T75烧弁fl/分离抹接种，每个烧瓶含有15 ml REGM。将细胞在5% 二氧化碳中于37°C培养。在过夜培养后，将培养基改变为无血清培 养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco), 0.1% (w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青 霉素(50单位/ml)和链霉素(50 pg/ml)(Oibco)),并进一步培养8小时。 在温育结束时以14,000 x g离心5分钟收集条件化的无血清培养基， 并储存于-20。C。0141!用PBS洗涤细胞，使用4 ml TrypLE Select (Gibco)解离， 并用Guava4义器(Guava Technologies, Hayward, CA)i十数，以4古^十每个49烧瓶中的细胞数。然后使用Searchlight蛋白质组阵列(Pierce Biotechnology Inc)通过ELISA测定样品的以下营养因子金属蛋白酶 组织抑制剂-1 (TIMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)、血小板 衍生的上皮生长因子bb (PDGF-bb)、角化细胞生长因子(KGF)、千细 胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、血管内皮生长 因子(VEGF)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、转化生长因子oc(TGFoc)、 脑衍生神经营养因子(BDNF)、基质衍生因子lb(SDFlb)、睫状神经营 养因子(CNTF)、碱性神经生长因子(b-NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、 生长相关的致癌基因-oc (GRO-a)、白介素-lb (IL-lb)、白介素-12p40 (IL-12p40)、白介素-12p70 (IL-12p70)、白介素-11 (IL-ll)、白介素-15 (IL-15)、基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、 促血管生成素-2 (ANG-2)和人生长激素(HGH)。营养因子生产的分析
尽管为了透彻理解目的已通过阐述和实施例相当详细 地描述了上文的发明，但对本领域一般技术人员显而易见的是，根据 本发明的讲述，可在不偏离随.附权利要求的精神或范围的情况下，对 本发明实施某些改变和修改。
权利要求
1.一种分离或纯化的哺乳动物肾源细胞群，所述细胞群能够在培养物中自我更新和扩增，其中所述细胞群阳性表达Oct-4、Rex-1、Pax-2、钙粘素-11、FoxD1、WT1、Eya1、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或GDF5中的至少一种，且阴性表达Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2或GATA-4中的至少一种。
2. 权利要求1的细胞群，所述细胞群阳性表达Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中的至少一种，且阴 性表达Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中的至少一种。
3. 权利要求1的细胞群，所述细胞群对细胞表面标记HLA I、 CD24、 CD29、 CD44、 CD49c、 CD73、 CD166或SSEA國4中的至少一 种为阳性，且对细胞表面标记HLAII、 CD31、 CD34、 CD45、 CD56、 CD80、 CD86、 CD104、 CD105、 CD117、 CD133、 CD138、 CD141 或E-钩粘素中的至少一种为阴性。
4. 权利要求l的细胞群，所述细胞群对表面标记HLAI、 CD166 或SSEA-4中的至少一种为阳性，且对细胞表面标记HLAII、 CD80、 CD86、 CD133、 CD141或E4丐粘素中的至少一种为阴性。
5. 权利要求1的细胞群，所述细胞群对细胞表面标记HLA I为 阳性，且对细胞表面标记HLA II、 CD80或CD86中的至少一种为阴 性。
6. 权利要求5的细胞群，其中对于哺乳动物患者的同种异体移 植，所述细胞群为非免疫原性的。
7. 权利要求l的细胞群，其中所述细胞来源于肾皮质。
8. 权利要求1的细胞群，其中所述细胞来源于肾髓质。
9. 权利要求l的细胞群，其中所述细胞来源于肾包膜下区。
10. 权利要求l的细胞群，其中所述细胞群分泌营养因子FGF2、 HGF、 TGFa、 TEMP-1、 TIMP-2、 MMP-2或VEGF中的至少一种，且不分泌营养因子PDGF-bb或IL12p70中的至少一种。
11. 权利要求l的细胞群，其中所述细胞群包括人细胞、灵长类 动物细力包或啮齿类动物细月包。
12. 权利要求l的细胞群，其中所述细胞群包括肾祖细胞。
13. 权利要求12的细胞群，其中所述肾祖细胞能够分化为脂肪细 胞或成骨细胞。
14. 一种治疗哺乳动物患者的缺血性肾脏疾病的方法，该方法包 括给予哺乳动物患者治疗有效量的权利要求1-13中任一项的细胞群， 由此减轻或消除哺乳动物患者的缺血性肾脏组织疾病。
15. 权利要求14的方法，其中给予所述细胞群诱导选自以下的作 用(a)形成向缺血组织供应血液的血管；(b)血液流向缺血组织；(c) 向缺血组织供应氧；和(d)它们的组合。
16. 权利要求14的方法，其中给予所述细胞群诱导形成肾包膜下 区组织、肾皮质组织或肾髓质组织。
17. 权利要求14的方法，其中所述哺乳动物患者为人、灵长类动 物或啮齿类动物。
18. —种替代哺乳动物患者由于外伤、衰老、代谢性或毒性伤害、疾病或特发性病症而损伤的肾组织、器官、组分或结构的方法，该方法包括给予哺乳动物患者治疗有效量的权利要求1-13中任一项的细胞群，由此减轻或消除哺乳动物患者的受损组织或器官并恢复肾功 沙R匕。
19. 权利要求18的方法，其中给予所述细胞群诱导选自以下的作 用(a)形成向肾脏组织供应血液的血管；(b)血液流向肾脏组织；(c) 向肾脏组织供应氧；和(d)它们的组合。
20. 权利要求18的方法，其中给予所述细胞群诱导形成肾包膜下 区组织、肾皮质组织或肾髓质组织。
21. 权利要求18的方法，其中所述哺乳动物患者为人、灵长类动 物或啮齿类动物。
22. —种制备分离的哺乳动物肾源细胞群的方法，该方法包括 由哺乳动物肾脏的包膜下区、皮质或髓质获得组织， 在一种或多种金属蛋白酶、中性蛋白酶或粘多糖酶存在下温育组织，以将至少一部分组织解离成单个细胞， 将细胞铺在基底支持物上，鉴定所述细胞中以下特征的细胞亚类阳性表达Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、钓粘素画ll、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2 、BMP7或GDF5中的至少 一种并且阴性表达Sox2 、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中的至少一种，和分离所述细胞亚类，以提供所述哺乳动物肾源细胞群。
23. 权利要求22的方法，其中所述细胞群阳性表达Eyal、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中的至少一种，且阴 性表达Sox2 、 FGF4 、 hTert或Wnt-4中的至少 一种。
24. 权利要求22的方法，还包括鉴定细胞表面标记HLA I为阳 性且细胞表面标记HLA II、 CD80或CD86中的至少一种为阴性的细 胞亚类的步骤。
25. 权利要求24的方法，其中对于哺乳动物患者的同种异体移 植，所述细胞群为非免疫原性的。
26. 权利要求22的方法，其中所述组织来自哺乳动物肾脏的皮质。
27. 权利要求22的方法，其中所述组织来自哺乳动物肾脏的髓质。
28. 权利要求22的方法，其中所述组织来自哺乳动物肾脏的包膜 下区。
29. 权利要求22的方法，其中所述基底支持物为组织培养瓶、支 架或中空纤维型装置。
30. 权利要求22的方法，还包括通过有限稀释和扩增细胞培养物 中的单个细胞从而分离单个哺乳动物肾源细胞。
31. 权利要求22的方法，其中所述组织来自人肾脏。
32. —种用基因疗法治疗哺乳动物患者的疾病的方法，该方法包括获得能够在培养物中自我更新和扩增的分离或纯化的哺乳动物 肾源细胞群，其中所述细胞群对Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、钙粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox-17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一种的表达为阳性，并对Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一种的表达为阴性，遗传改变分离或纯化的哺乳动物肾源细胞群的至少 一种细胞，以 产生治疗性基因产物，扩增培养物中遗传改变的细胞，和给予哺乳动物患者遗传改变的细胞，以减轻或消除哺乳动物患者 的所述疾病。
33. 权利要求32的方法，其中所述细胞群对Eyal 、 WT1、 FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一种的表达为阳性，并 对Sox2、 FGF4、 hTert或Wnt-4中至少一种的表达为阴性。
34. 权利要求32的方法，其中所述细胞群对细胞表面标记HLAI 为阳性，并对细胞表面标记HLA II、 CD80或CD86中的至少一种为 阴性。
35. 权利要求34的方法，其中所述细胞群对哺乳动物患者的同种 异体移植是非免疫原性的。
36. 权利要求32的方法，其中将遗传改变的细胞给予哺乳动物患 者的肾膝，以治疗哺乳动物患者的肾脏疾病、肾脏伤害、肾脏缺血或 遗传缺陷。
37. 权利要求32的方法，其中所述哺乳动物患者为人、灵长类动 物或啮齿类动物。
38. 权利要求32的方法，其中所迷哺乳动物肾源细胞群来源于 人、灵长类动物或啮齿类动物的肾脏。
39. 权利要求38的方法，其中所述哺乳动物肾源细胞群来源于人 的肾脏，并且将所述细胞进行子宫内移植，从而在移植后在出生前或 出生后的人患者中产生人肾细胞，其中所述细胞在人或动物中产生治 疗产物，以减轻或消除人患者的所述疾病。
40. —种筛选治疗涉及哺乳动物患者肾细胞的疾病的药物候选物 的方法，该方法包括以下步骤(a) 提供分离或纯化的哺乳动物肾源细胞群，所述细胞群能够在培 养物中自我更新和扩增，其中所述细胞群对Oct-4、 Rex-l、 Pax-2、 4丐 粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、 HNF3B、 CXC-R4、 Sox誦17、 EpoR、 BMP2、 BMP7或GDF5中至少一种的表达为阳性，并对Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一种的表达为阴性；(b) 在增殖条件下培养哺乳动物肾源细胞群，以获得细胞组合物， 其包含具有体外自我更新和扩增潜力或该潜力增加的细胞；(c) 使得自步骤(a)或(b)的培养细胞接触药物候选物；和(d) 检测是否存在药物候选物对细胞存活或所述细胞的形态、功能 或生理特征和/或分子生物学特性的作用，由此改变细胞存活、细胞的 形态、功能或生理特征和/或细胞的分子生物学特性的作用表明所述药 物候选物具有治疗肾细胞疾病的活性。
41. 权利要求40的方法，其中所述细胞群对Eyal、 WTl、FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一种的表达为阳性，且 对Sox2 、 FGF4 、 hTert或Wnt-4中至少 一种的表达为阴性。
42. 权利要求40的方法，其中细胞的形态、功能或生理特征是肾 小管形成增加或BMP或BMP受体表达增加。
43. 权利要求40的方法，其中细胞的形态、功能或生理特征是营 养因子FGF2、 HGF、 TGFa、 TIMP-1、 TIMP-2、 VEGF或MMP-2中 至少一种或多种的分泌增加。
44. 权利要求40的方法，其中所述疾病为哺乳动物患者的缺血性 肾病或由于外伤、衰老、代谢性或毒性伤害、疾病或特发性病症而引起的肾脏组织、器官、组分或結构的损伤。
45. —种测定测试物影响肾细胞功能的毒性的方法，其包括以下 步骤(a) 提供能够在培养物中自我更新和扩增的分离或纯化的哺乳动 物肾源细胞群，其中所述细胞群对Oct-4、 Rex誦l、 Pax-2、钙粘素-11、 FoxDl、 WT1、 Eyal、丽F3B、 CXC画R4、 Sox-17、 EpoR、 B證2、 BMP7或GDF5中至少一种的表达为阳性，并对Sox2、 FGF4、 hTert、 Wnt-4、 SIX2或GATA-4中至少一种的表达为阴性；(b) 使所述细胞群与测试物接触；和(c) 检测是否存在测试物对细胞群中的细胞存活或细胞群中的细 胞的形态、功能或生理特征和/或分子生物学特性的作用，由此改变细 胞群中的细胞存活、细胞的形态、功能或生理特征和/或细胞的分子生 物学特性的作用表明测试物对肾细胞功能具有毒性。
46. 权利要求45的方法，其中所述细胞群对Eyal、 WTl、FoxDl、 BMP7、 BMP2、 GDF5、 EpoR或Rex-l中至少一种的表达为阳性，并 对Sox2 、 FGF4 、 hTert或Wnt-4中至少 一种的表达为阴性。
47. 权利要求45的方法，其中细胞的形态、功能或生理特征是肾 小管形成或者BMP或BMP受体表达。
48. 权利要求47的方法，其中检测到增加的测试物毒性为肾小管 形成减少或者BMP或BMP受体表达降低。
49. 权利要求45的方法，其中细胞的形态、功能或生理特征是营 养因子FGF2、 HGF、 TGFot、 TIMP-1、 TIMP-2、 VEGF或MMP-2中 至少一种或多种的分泌。
全文摘要
本发明提供得自哺乳动物肾脏组织的分离或纯化的哺乳动物肾源细胞群。提供分离和纯化哺乳动物肾源细胞群的方法。提供通过给予哺乳动物患者分离或纯化的哺乳动物肾源细胞群治疗肾病的方法。
文档编号C12N5/071GK101595212SQ200780045631
公开日2009年12月2日 申请日期2007年10月11日 优先权日2006年10月12日
发明者A·戈塞夫斯卡, A·西达, C·S·比恩苏西索, D·C·科尔特 申请人:伊西康公司