一种天龙多肽衍生物及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一种天龙多肽衍生物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的合成抗菌肽及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
(一) 多耐药结核病现状
结核病是对人类健康威胁最大的传染性疾病之一。据WHO统计，目前全球约有20亿人口感染结核 杆菌，每年新发病例达800万左右，死亡人数约3百万，占人口死亡率的7%。结核病发病率及死亡率上 升的最主要原因之一就是结核杆齒耐药株的出现和传播。据报道，全球结核病人中约有36%感染了耐药菌， 这种现象在发展中国家及AIDS病人中尤为重要。此外，全球五大洲35个国家和地区报告的各常用抗结核 药原发耐药率为异烟肼(7,3%),链霉素(7.3%),利福平(1.8%),乙胺丁醇(1.0%)，而获得性耐药 率还原高于此值。因此，制备一种新型的治疗多耐药结核杆菌感染的药物有着十分重要的意义。
(二) 抗菌肽的应用
抗菌肽(antimicrobial p印tides)是生物体中经诱导而合成的一种内源性多肽，迄今为止，已在多种动 物、植物、微生物和人体中发现有抗菌肽。这种小分子多肽在机体抵抗病原的入俊方面起着重要的作用， 能快速杀灭已侵入的病菌，并能阻止病菌的继续侵染。抗菌ft^的作用机理与常用的抗生素明显不同，它主 要通过在细胞膜表面形成离子通道来杀死细菌，现在被广泛研究应用于抗菌、抗病毒、抗癌。在目前结核 菌的耐药性明显增强，而寻找新的抗生素又极为困难的情况下，制备一种新的抗结核菌多肽药物具有非常 重要意义。
(三) 两栖类动物药物的研究现状 两柄类动物在中国属于传统中药和民族药而广泛应用，如中华蟾蜍、大蹼铃蟾、黑斑蛙、沼蛙和
泽蛙。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，己报道的有广谱抗微生物作用、抗 肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、心血管系统作用。
在国外，从两栖类动物寻求药理活性单体化合物已是新药发明的热点，国外报道，从爪蟾皮肤分泌液 获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，； Magainin制药公司宣布，他们生产的爪蟾皮肤抗菌肽Magainin类似物MSI-78用于治疗糖尿病患者足部溃 疡与ofloxacin有同样的效果，但产生更小的副作用。国外学者也己报道从东方铃蟾和花铃蟾中分离出若干 具广谱抗微生物活性的多肽类物质，如Bombinin和BLP-like多肽。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机 小分子多肽类物质的研究还较少。天龙属爬行纲，蜥蝎目，壁虎科，其又名守宫、壁虎等，现代医药书籍或杂志上收载品种为无蹼壁 虎(GekkoswinhonisGimther)和多痣壁虎(多疣壁虎Gjaponicus)及其它几种壁虎的干燥全体。壁虎，咸寒 有小毒，入心、肝经，具有补肺肾、养精血、止咳平喘、祛风定惊、解毒通络散结等功效。早在1978年， 骆和生等人经实验证明天龙对结核杆菌有抑制作用，对致病性真菌有抑制作用，此后关于天龙在临床结核 病的应用日渐增多，并显示出很好的疗效。主要用于肺结核、脊柱结核、胸腰椎结核、淋巴结核、颈淋巴 结核或肿大以及骨与关节结核(骨痨)等。如焦起周等用回生膏外敷加服复方中药汤剂治疗结核病355例； 李守信等用攻瘰丹、化离散加消核膏埋入或外贴治疗淋巴结核1239:例，治愈率98.3%总有效率99.9%。于 立君等人的专利申请"治疗结核病的中药及其制作方法"(专利号03132605.6)报道了天龙用于治疗瘰疬 结核，虽然天龙治疗结核有效，但是关于天龙抗结核的药理活性成分未有相关的文献报道。因此，从天 龙中提取天然多肽，进而通过基因T程表达高效制备一种合成多肽，应用丁治疗包括多耐药结核杆菌在内 的结核杆菌感染引起的疾病的药物的制备中有着重要的意义。

发明内容
本发明目的之一在于提供一种新的对包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌有强的抑菌活性的合成抗 菌肽。
本发明目的之二是一种新的抗菌肽的制备方法。
本发明目的之二是公开所述合成抗菌肽在制药中的应用。
本发明提供的合成抗菌肽是在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成的，它们的序列如下
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Val Cys Lys Ala Lys Cys Lys Thr Arg Trg Arg Asp Leu Cys Lys Thr Thr Met His Lys Trp Asn Cys Arg
对合成抗菌肽进行空间结构分析，显示其中包括的a—螺旋结构，其与抗菌机理密切相关。
本发明提供的合成抗菌肽，其制备方法包括将天龙干药材溶胀，离心去除沉淀，冻干后经固相萃取柱 层析、凝胶过滤柱层析和反相高压液相分离纯化得到天然多肽，将其测定氨基酸测序和结构分析后设计出 一种新的合成抗菌肽，并且可以通过基因丄程表达髙效制备，即将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后 在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一中，宿主细胞可以是原核真核细胞、包 括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明提供的一种新的合成抗菌肽，对结核杆菌.尤其是耐药结核杆菌有很强的杀伤活性。通过该抗 菌肽对结核杆菌的抑制试验显示合成抗菌肽对结核分枝杆菌标准株的最小抑菌浓度仅为1.25g/ml，对于耐 耐异烟肼结核杆菌株和耐利福平结核杆菌株亦有明显的抑制作用，最小抑菌浓度仅为2.5ug/ml，对于多耐 药结核杆菌最小抑菌浓度仅为5.0ug/ml。而目前尚未发现有较此最小抑菌浓度低的抗耐药结核杆菌的化学 药物。因此本发明合成抗菌肽可以用于制备治疗包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌感染疾病的药物。
本发明所述抗菌肽用于但不限于结核分枝杆菌的抑制。
本发明所述抗菌肽用于但不限于用于制备治疗包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌感染疾病的药物。
4本发明所述天龙抗菌肽全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。 本发明所述的抗菌肽、多耐药结核病、结核分枝杆菌，是本领域的技术人员所熟知的，现代的医学书 籍中有其准确的定义。
通过以下实施例对本发明的天龙抗菌肽的制备和应用进行描述。需说明的是，下述实施例只是用来说 明而非限制本发明，本领域技术人员所熟知的其他常用制备方法及其他引起结核病的分支杆菌均在本发明 的范围内。


图1是合成抗菌肽的空间构象图。
具体实施例方式
实施例一天龙抗菌肽的制备方法
将天龙千药材粉碎过80目筛，称取2500g药粉，用4500ml蒸馏水泡匀泡胀，4度冰箱静置24h,低 温高速离心得上清液800ml, 0.45um微孔滤膜过滤即得到粗提液，将粗提液上样T固相萃取柱ODS -SPE (C18),分别用水和甲醇洗脱，洗脱液冻千得到水溶部分和醇溶部分，醇溶部分经凝胶过滤柱层析收集活 性成分所在峰，，透析脱盐和反相高压液相色谱分离纯化即得天然多肽。 其中
凝胶过滤柱层析为将收集的天龙冻十粉溶于蒸馏水后上样于SephadexG-50凝胶过滤柱，凝胶过滤柱 长500mm,直径26mm，用0. lMNa2HP04—NaH2P04 pH6.5缓冲液洗脱，收集40分钟以后的活性成分峰。
反相高压液相色谱为:将凝胶过滤柱层析得到的活性成分上样于经含0.1%三氟醋酸的超纯水平衡的 C18反相柱(0DSC18柱，SHIMADZU 150mm*4.6mm),用含0.1 %三氟醋酸的甲醇从10%到100%的梯
度洗脱,收集时间为16.2分钟处的活性峰。
然后收集的上述活性成分用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列 结构。在制备所得的天然提取抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成一种新的合成抗菌肽，肽一级全 序列结构为赖氨酸一赖氨酸一赖氨酸一赖氨酸一赖氨酸一赖氨酸一缬氨酸一半胱氨酸一赖氨酸一丙氨酸 一赖氨酸一半胱氨酸一赖氨酸一酪氨酸一精氨酸一色氨酸一精氨酸一天冬氨酸一色氨酸一亮氨酸一半胱 氨酸一赖氨酸一苏氮酸一酪氨酸一甲硫氨酸一组氨酸一赖氨酸一色氨酸一天冬酰胺一半胱氨酸一精氨酸。 KKKKKKVCKAKCKYRWRDLCKTYMH KWNCR。
天然抗菌肽衍生物的基因工程制备过程包括首先利用美国应用系统生物工程公司生产的Pioneer多 肽合成仪制备上述编码抗菌肽基因，将抗菌肽的编码基因克隆到表达载体pPIC9中，然后转化毕氏酵母菌 株，甲醇诱导表达蛋白。有关的DNA分离、纯化、PCR扩增、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子 克隆操作均按照J.沙穆克鲁克等编著的《分子克隆试验指南》进行。
实施例二合成抗菌肽对结核分支杆菌的最低抑菌浓度的测定
1.培养基7H9琼脂半流体培养基Middlebrook 7H9干粉(SIGMA M0178) 4. 7g，丙三醇4ml，琼脂粉0. 5g,加蒸馏水至900ml, 15磅12rC高压灭菌IO分钟，冷却后加入0ADC至1000ml,待用。 苏通半流体培养基称取谷氨酸钠4. 0g,枸櫞酸lg， K2HP040. 25g, MgS04 *7H20 0. 25g，枸橼酸铁铵0. 025 g,甘油15ml，琼脂粉0.25g,加入蒸馏水后加热使其完全溶解，冷却后以8% NaOH调pH至7.2,用 蒸馏水定容至500ml，分装，12rC高压灭菌20分钟，待用。
2. 药物对照药品为异烟肼；测试药品为合成抗菌肽。
3. 菌株结核分枝杆菌标准株C^co6a"e/"2'咖tw6arc^o5^sH37Rv, ATCC 27294);金色分枝杆菌保aw咖, Zf7TC i^J5W ;耐异烟肼结核杆菌株；多耐药结核杆菌株；耐利福平结核杆菌株。
4. 药效评价标准肉眼观察各个培养管屮分支杆菌的生长，并同麦氏比浊管1号、2号、3号、4号比 浊，无分支杆菌生长表示"；有分支杆菌生长并同1号比浊管相近表示"+":同2号比浊管相近表 示"++"，依次类推，其中+号的多少反映出分支杆菌相对生长的多少，以""时抗菌肽的浓度作为该 菌的最低抑菌浓度(minimal bactericides concentration, MBC)。
5. 操作步骤将药液倍比稀释为3个梯度，分别为20/ig/ml ， 10/ig/ml ，5pg/ml， 2.5Mg/ml， 1.25/ig/m。 接种菌株取分枝杆菌新鲜分支杆菌，加0.5%Tween-80生理盐水磨菌稀释，与1号麦氏比浊管比浊，制 成lmg/ml菌液上述新鲜菌落，稀释成10 3mg/ml菌液，每管培养基接种0. lml，最终接种量为10—4mg。 37°C 温箱孵育15大观察结核菌生长。
实验为双管平行操作，每次实验重复三次，取平均值，结果如表l所示。
表l:天龙抗菌肽抑制结核菌生长的作用菌株合成抗菌肽最小抑菌浓度(ug/ml)
结核分枝杆菌标准株H37Rv1. 25
金色分枝杆菌10
耐异烟肼结核杆菌株2.5
耐利福平结核杆菌株2. 5
多耐药结核杆菌株5. 0
实施例三合成抗菌肽的临床观察疗效
女，41岁，2000年时因咳嗽、咳痰，拍片检査诊断为肺结核，用异烟肼、利复T、吡嗪酰胺、乙 胺丁醇治疗后病情无明显好转，药敏试验为多耐药难治性结核(耐异烟肼、利复平)，咳嗽、咳痰，痰菌 阳件，且肺上有空洞。口服所述抗菌肽20mg， bid,维持3周，空洞闭合，痰菌阴转，临床症状消失，遂 停药。
男，59岁。2001年时因咳嗽、咳痰、乏力不适，拍片检査发现患空洞型肺结核，用异烟肼、利福平、 乙胺丁醇等抗结核治疗，病情无明显好转.经常咳嗽、咳痰、盗汗、纳差，痰菌3(+)，药敏试验显示为多耐
6药难治性结核，胸片显示两肺继发型肺结核伴空洞。2004年用天龙抗菌肽30mg， tid'治疗4周，患者无 不适症状，痰菌阴转，空洞闭合，胸片上病灶稳定，遂停药。<110>王辰
<120>—种天龙多肽衍生物及其制备方法和应用
<160> 1 <210> 1
<211〉 30
<212〉 PRT
<213>人工序列
<■〉 1
Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 Trg Arg Asp Leu Cys
20
Lys Val Cys Lys Ala 10
Lys Thr Thr Met His
25
Lys Cys Lys Thr Arg
15
Lys Tip Asn Cys Arg
30
8
权利要求
1. 一种新的合成抗菌肽，其特征在于该抗菌肽是依据从天龙中天然分离多肽而衍生合成得到的一种单链多肽。
2. 根据权利要求1所述的合成抗菌肽，其特征在于多肽全序列结构为赖氨酸一赖氨酸一赖氨酸一赖氨 酸一赖氨酸一赖氨酸一缬氨酸一半胱氨酸一赖氨酸一丙氨酸一赖氨酸一半胱氨酸一赖氨酸一酪氨酸 一精氨酸一色氨酸一精氨酸一天冬氨酸一色氨酸一亮氨酸一半胱氨酸一赖氨酸一苏氨酸一酪氨酸一 甲硫氨酸一组氨酸一赖氨酸一色氨酸一天冬酰胺一半胱氨酸一精氨酸。(KKKKKKVCKAKCKYRWRDLCKTYMH KWNCR)。
3. —种如权利要求1所述的合成抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述及的制备方法为将天龙干药材溶 胀，离心去除沉淀，冻干后经固相萃取柱层析、凝胶过滤柱层析和反相高压液相分离纯化得到天然多 肽，将其测定氨基酸测序和结构分析后设计出一种新的合成抗菌肽，通过基因工程表达获得。
4. 一种如权利要求1所述的合成抗菌肽的应用，其特征在于所述及的合成抗菌肽在制备治疗包括多耐药 结核杆菌在内的结核杆菌感染疾病的药物中的应用。
5. 根据权利要求5所述及的合成抗菌肽的应ffi，其特征在于所述的药物包括权利要求1所述的抗菌肽， 并混合有一种或一种以卜.医药卜.能接受的载体和添加剂。
全文摘要
本发明涉及一种新的合成抗菌肽及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。该抗菌肽为天龙天然抗菌肽的衍生物，是依据从我国两栖类动物天龙中分离得到的天然多肽，进而合成的一种单链多肽。制备方法是将天龙干药材溶胀，离心去除沉淀，冻干后经固相萃取柱层析、凝胶过滤柱层析和反相高压液相分离纯化得到天然多肽，将其测定氨基酸测序和结构分析后设计出一种新的合成抗菌肽，通过基因工程表达获得。该合成抗菌肽可以显著抑制包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌生长，可以用于制备治疗包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌感染引起的疾病的药物。
文档编号C12N15/12GK101497661SQ200810006750
公开日2009年8月5日 申请日期2008年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者孔繁翠, 辰 王, 王鹤尧 申请人:辰 王