专利名称：一种多食鞘氨醇杆菌及其转化有效霉素的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种多食鞘氨醇杆菌 (i5>/ //2^^<3C"r2',^//〃ra/7/y77)及其转化有效霉素的方法，具体涉及从土壤中筛选并分离出一株能够降解有效霉素的鞘氨醇杆菌属(的多食鞘氨醇杆菌，及利用该菌株转化有效霉素为有效霉胺和有效霉烯胺的方法，以及有效霉胺和有效霉烯胺的分离及检测方法。
背景技术：
本发明涉及有效霉胺(validamine)及有效霉烯胺(val iednmine )， 结构式如下HO OH HO OH有效霉胺(validamine) 有效霉烯胺(val ienamine ) 有效霉胺，分子式为C孔5N04,重要的基团有 一个伯氨基(-冊2), — 个羟甲基(-CH20H),三个羟基(-OH),其盐酸盐(C7H15N04 . HCI )的[ocL23 + 57.4° (IN - HCI )，熔点为229°C-232°C, [a]D21 + 60.6。
( H20 ),遇茚三酮显色。有效霉烯胺，分子式为(MN04，重要的基团有: 一个伯氨基(-丽2), 一个碳碳双键(C=C)，一个羟甲基(-CH20H),三个羟基(-OH),其盐酸盐 (C7H13N04 . HCI )的[a]D" + 68.6。
(IN - HCI ),五乙酸盐的熔点为95 °C, [a]D21 + 30.2° ( CHCh ),遇茚三酮显色。—有效霉胺和有效霉烯胺属假氨基糖，对糖苷酶有竞争性抑制作用，同 时也是很多其它糖苷酶抑制剂的核心结构，可用于合成伏格列波糖 (vogl ibose )。有关有效霉胺和有效霉烯胺的生产方法的研究已经有30多年的历史， 曰本龟田等人曾经釆用过的转化有效霉素为有效霉胺及有效霉烯胺的菌包 括—.假单胞菌属(尸^ewo^/z 。/ 叫1个种,/^ewoW /7a5" de/7/fW/7ca叫反 硝化假单胞菌)、黄杆菌(/^ra&"er/"/7z， 3个种)、嗜纤维菌属(6yro/ 力a^， 1个种，3个菌株)、土壤菌属(J^ro&Cer/腿，2个种， 其中 ^ro6a"eri咖 rao7o6ac,er 有 5 个菌株, /^ro6s"er/鹏 z^/z e/acye/^， 1个种)、气单胞菌属(Jero/ro/7M, 5个种)。内芽孢杆菌属(Ae/7/^c/7/^)。浙江工业大学筛选出的转化有效霉素为有效胺及有效 霉胺的菌株包括嗜麦芽寡氧单胞菌(We/^"^/ ,^^/^/"^/ //":^ 粪产碱菌(尸aeca/2's )、 荧光假单胞菌 (/^e油卿加i1/7"ore"e/7")。并未发现用多食鞘氨醇杆菌转化有效霉素为有效霉胺和有效霉烯胺。
发明内容
本发明提供一种能够转化有效霉素为有效霉胺和有效霉烯胺的菌株，以 及利用该微生物裂解有效霉素生产有效霉胺和有效霉烯胺的方法，和产物 有效霉胺和有效霉烯胺的分离及检测方法。本发明提供的新的微生物菌株属于鞘氨醇杆菌属(6^力//2^^^"/"/咖) 的多食鞘氨醇杆菌(^力M^/^"er/鹏/Z7W/〃F(9iT/7Z7)。本发明筛选到的菌株基本特征如下细胞形态短杆状。菌落形态在LB培养基37。C培养2天，菌落粘液状，乳白色。 生理生化特征革兰氏阴性，硝酸盐还原反应阳性，亚硝酸盐还原反应 阳性，不产生吲哚，精氨酸水解酶阴性，尿酶阳性，(3糖苷酶阳性，液化 明胶，P半乳糖苷酶阳性，不发酵D-葡萄糖，能利用L-阿拉伯糖、D-甘露 糖、D-甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、D-麦芽糖、葡萄糖酸钾、癸酸、柠檬酸 钠,..不能利用D-葡萄糖、己二酸、羟基丁二酸、苯乙酸。根据以上细菌学特征及16s rDNA序列对比，鉴定该菌为多食鞘氨醇杆 菌(i^W/^o&Wer/w/z /zw"/pw7//z7)。该菌具有转化有效霉素产生有效霉 胺和有效霉烯胺的作用。本发明所用到的转化底物是有效霉素，有效霉素目前在我国大量使用， 因其高效、无毒、价格低，已成为使用最广泛的一类农用抗生素。有效霉 素是氨基糖苷类农用抗生素，成分包括A、 B、 C、 D、 E、 F等，主要成份是 A,结构式如下本发明的种子培养基配方如下(g/L):葡萄糖IO.O，酵母粉IO, K2HP04 7.0 , KH2P04 3.0 , MgS04 0.01，自来水配制，121。C灭菌30分钟。转化 培养基配方如下(g/L):有效霉素20. 0,酵母粉IO. 0, K2HP04 7.0 ， KH2P04 3.0 , MgS04 0.01,自来水配制，12rC灭菌30分钟。固体培养基即种子 培养基加入2%的琼脂。种子培养基接入微生物CGMCCNO. 2341进行培养，培养温度25°C — 37°C, pH6. 8-7. 2,培养24小时得到种子液，种子液按5%转种量接入转化培养基中，培养温度"。C 一 37°C, pH6. 8-7.2,在通风搅拌条件下培养,培养时间48-168小时。在种子培养基中接入微生物CGMCC N0 . 2341进行培养，培养温度25 °C 一 37°C， pH6. 8-7. 2,培养菌体到对数生长期，然后离心分离，得到菌 体；将分离得到的菌体，加入含底物有效霉素的浓度为1.0% — 10. 0%的 溶液中进行反应，反应温度25°C — 37°C ,反应时间24h — 168h 。本发明的培养方法如下菌种CGMCCNO. 2341,经过固体培养基活化， 接入种子培养基，在通风搅拌条件下培养，培养时间24小时，培养后的种 子培养基转入至转化培养基中，在通风搅拌条件下培养。本发明的产物检测方法如下HPLC法检测，用离子对试剂和磷酸盐作 为流动相。本发明的产物分离方法如下培养液去除菌体，根据其水溶性强及含有 氨基的性质，用离子树脂法分离并做脱色处理，最后用有机溶剂脱水的方 法将产物以结晶的形式沉淀。本发明使用的菌种多食鞘氨醇杆菌(5>力//^<^3""/咖M7/〃p^r歴) 在含有有效霉素的培养基上生长良好，液体培养转化效果较好，培养基碳 源即为有效霉素，氮源可使用多种无机或有机氮源如蛋白胨、酵母粉、 牛肉膏、硫酸铵、醋酸铵等，且该菌株具有无毒、无致病性、性能稳定、 不易染菌等优点。本发明所用的多食鞘氨醇杆菌Y07B-0134已保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. : 2341，保藏曰为2008 年l月15曰。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何 方式限制本发明。 实施例1种子培养基配方如下(g/L):葡萄糖IO. 0,酵母粉IO. 0, K2HP04 7.0 , KH2P04 3.0 ， MgS04 0.001,自来水配制，121。C灭菌30分钟。转化培养基 配方如下(g/L):有效霉素20. 0,酵母粉IO. 0， K2HP04 7.0 , KH2P04 3. 0 ， MgS04 0.01，自来水配制，121。C灭菌30分钟。固体培养基即种子培养基 加入2%的琼脂。培养方法菌种CGMCCNO. 2341，经过固体培养基37。C培养2天活化， 接入种子培养基，培养温度25°C — 37°C, pH6. 8-7. 2,在通风搅拌条件 下培养，培养时间24小时，培养后的种子培养基按5%的转种量转入至转 化培养基中，温度25'C — 37°C°C, pH6. 8-7.2，在通风搅拌条件下培养， 培桌时间48-168小时。产物检测方法HPLC法检测，流动相0. 05mol/LSDS, 1%磷酸钠，pH2. 8, 流速0. 5ml/min,检测波长210nm。产物分离方法培养液经离心或过滤除去菌体，调节pH为6. 0上721 型强酸性阳离子树脂，用水冲洗杂质，用1%的氨水洗脱，分步收集流出液， 收集含有效霉胺和有效霉烯胺的洗脱液升温减压浓缩，再上732型阴离子 树脂，升温减压浓缩，加入5倍体积的乙醇，再加总体积3倍体积的丙酮 析出结晶，将结晶过滤干燥得成品。该菌株或该菌株菌体经种子培养基培养后接入含底物有效霉素的转化 培养基中进行分解底物，或种子培养基培养后分离得到菌体，将得到的菌 体加入有效霉素的溶液中进行反应分解底物；转化结束后，离心去除菌体， 将转化液上阳离子交换树脂，用氨水洗脱，再用阴离子树脂脱色，加入有 机溶剂沉淀，得到有效霉胺和有效霉烯胺。
权利要求
1. 一种多食鞘氨醇杆菌，其特征在于菌株属于鞘氨醇杆菌属的多食鞘氨醇杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2341，保藏日为2008年1月15日，该菌株能够转化有效霉素为有效霉胺和有效霉烯胺。该菌株或该菌株菌体具有裂解底物有效霉素为有效霉胺和有效霉烯胺的能力。
2、 一种多食鞘氨醇杆菌转化有效霉素的方法，其特征在于该菌株 或该菌株菌体经种子培养基培养后接入含底物有效霉素的转化培养基中 进行分解底物，或种子培养基培养后分离得到菌体，将得到的菌体加入有 效霉素的溶液中进行反应分解底物；转化结束后，离心去除菌体，将转化 液上阳离子交换树脂，用氨水洗脱，再用阴离子树脂脱色，加入有机溶剂 沉淀，得到有效霉胺和有效霉烯胺。
3、 根据权利要求2所述的一种多食鞘氨醇杆菌转化有效霉素的方 法,—其特征在于种子培养基的配方为(g/L):葡萄糖IO. 0,酵母粉IO. 0， K2HP04 7.0 , KH2P04 3. 0 ， MgS04 0. 01，自来水配制，121。C灭菌30分钟。
4、 根据权利要求2所述的一种多食鞘氨醇杆菌转化有效霉素的方 法，其特征在于所述的转化培养基的配方为(g/L):有效霉素20.0, 酵母粉IO. 0， K2,4 7.0 ， KH2P04 3. 0 ， MgS04 0. 01,自来水配制，121 X:灭菌30分钟。
5、根据权利要求2或3或4所述的一种多食鞘氨醇杆菌转化有效霉 素的方法，其特征在于种子培养基接入微生物CGMCC NO . 2341进行培 养，培养温度25°C -37°C, pH6.8-7.2,培养24小时得到种子液，种子 液按5%转种量接入转化培养基中，培养温度25。C-37。C, pH6. 8-7. 2,在 通风搅拌条件下培养，培养时间48-168小时。
6、 根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征是在种子培养基中 接入微生物CGMCC NO . 2341进行培养，培养温度25°C — 37°C , pH6. 8-7. 2， 培养菌体到对数生长期，然后离心分离，得到菌体；将分离得到的菌体， 加入含底物有效霉素的浓度为1.0% — 10. 0%的溶液中进行反应，反应温 度25°C- 37°C ,反应时间24h - 168h 。
7、 根据权利要求2所述的一种多食鞘氨醇杆菌转化有效霉素的方法， 其特征在于将转化液离心去除菌体，将转化液上阳离子交换树脂，用氨 水洗脱，再用阴离子树脂脱色，加入有机溶剂沉淀。
8、 根据权利要求l所述的一种多食鞘氨醇杆菌，其特征在于所述 的有效霉胺和有效霉烯胺产物用HPLC法检测。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)及其转化有效霉素的方法。该菌株或该菌株菌体可以转化有效霉素为有效霉胺和有效霉烯胺将该菌株或该菌株菌体经种子培养基培养后接入含底物有效霉素的转化培养基中进行分解底物，或种子培养基培养后分离得到菌体，将得到的菌体加入有效霉素的溶液中进行分解底物，然后对分解液进行分离、提纯，得到有效霉胺和有效霉烯胺。本发明还公开了有效霉胺和有效霉烯胺的检测和分离方法。菌种多食鞘氨醇杆菌在含有有效霉素的培养基上生长良好，液体培养转化效果较好，且该菌株具有无毒、无致病性、性能稳定、不易染菌等优点。
文档编号C12P13/00GK101260374SQ20081001114
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月22日 优先权日2008年4月22日
发明者吴春福, 张怡轩 申请人:沈阳药科大学