专利名称：异山柑子萜醇合成相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及异山柑子萜醇合成相关蛋白及其编码基因与应用。
技术背景甾醇和皂苷类化合物具有重要的生理活性和生物学功能。甾醇是以环戊垸全氢 菲为骨架(又称甾核)的一种物质，可分为动物性甾醇、植物性甾醇和菌性甾醇。动物性甾醇以胆固醇为主。植物性甾醇主要包括谷甾醇(Sitosterol)、豆甾醇 (Stigmasterol)和菜油甾醇(Campestanol)等。菌类甾醇主要包括麦角甾醇。 植物甾醇能够抑制人体对胆固醇的吸收、促进胆固醇的降解代谢、抑制胆固醇的生 化合成，具有抑制心血管疾病、抗癌、抗肿瘤、消炎、提高免疫、调节生长、抗病 毒等作用，此外，植物甾醇还具有良好的抗氧化性，可用作食品抗氧化剂。"-谷 甾醇(^-Sitosterol)是细胞膜的重要组成部分，对于维持细胞膜的结构和功能 具有重要的作用。油菜素内酯(brassinolide)被称为第六大类植物激素，在植物生 长发育的调控中发挥重要的作用。皂苷是螺甾烷及其生源相似的甾族化合物的 低聚糖苷或三萜类化合物的低聚糖苷，广泛存在于单子叶和双子叶植物中。三 萜皂苷类代谢物在农业科学和医学等领域具有广阔的应用前景。齐墩果酸具有降低 转氨酶的功能，临床用于治疗急性黄疸肝炎；燕麦在根尖合成的燕麦苷(avenacins) 具有广谱的抗菌功能，能防止多种病原菌侵染根部，发挥抗病作用(Haralampidis et al. ， 98:13431-13436);人参根部合成的人参皂苷类化合物是重要中药的有效成分 (Shukla et al. ， Phytochemistry， 29: 239-241)。桦木酸具有抗肿瘤、抗艾滋病 病毒、抗炎和体外抗疟病等多种生物活性。目前，对植物甾醇和三萜类皂苷的生物合成途径已有初步认识。异戊二烯途径 是获得这些代谢产物的必由途径，其生物合成路线为甲羟戊酸(Mevalonic acid) 生成的异戊烯二磷酸(IPP)及其异构体二甲基丙烯二磷酸(DAPP)在香草二磷酸合 成酶(GPS)作用下首先形成香叶二磷酸(GPP)，接着利用法呢二磷酸合成酶(FPS)转 化成法呢二磷酸(FPP)，又在鲨烯合成酶(Squalene synthase, SQS)的作用下合成 鲨烯，然后经鲨烯环氧酶(Squalene印oxidase， SQE)催化转变为2， 3-氧化鲨烯(2， 3-oxidosqualene)，最后2， 3-氧化鲨烯经过2， 3-氧化鲨烯环化酶(OSCs)的环化作用得到植物甾醇和三萜类骨架。三萜类骨架依赖细胞色素P450单加氧酶、糖基转移 酶和酰基转移酶进行氧化、糖基化及酰基化等化学修饰，最终获得不同种类的三萜 类皂苷产物。2， 3-氧化鲨烯在氧化鲨烯环化酶(0SCs)的作用下环化形成甾醇和三路类产物 各自的前体物质，如环阿屯醇(Cycloartenol)、 P -香树素(P -Amyrin)等。目前 已经从不同植物中分离得到了约10种编码OSCs酶的基因，包括羽扇醇合成酶 (Lupeol synthas， LUP) 、 P-香树素合成酶(P-Amyrin synthase, P AS)、葫卢二 烯醇合成酶(cucurbitadienol， CPQ) 、 thalianol synthase (THA) 、 marneral synthase (MRN)、 camelliol synthase (CAMS)、 baruol synthase (BARS)、 isomultiflorenol synthase(IMS)以及羊毛甾醇合成酶(lanosterol synthase, LAS) 禾口环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synt|mse， CAS)(Philips et al. ， Current opinion in plant biology, 9:1-10)，其中前8种酶可能是合成各类三萜类产物的前体，第io种酶是甾醇的前体。e-香树素合成酶参与起始多数皂苷类物质的合成(》-amyrin synthases)，然后通过加氧、糖基化及酰基化等一系列反应产生三 萜皂苷(Qi et al. ，PNAS， 101:8233-8238)。羽扇豆醇合酶(lupeol synthases)参 与了桦木酸(Betulinic acid)的合成(Hayashi et al., Bio. Pharm. Bull, 27:1086-1092)。异山柑子萜醇广泛存在于高等植物中，其中禾本科植物例如白茅(//^^^^ c/h'/7o^'ra)的茎叶中含量较多，异山柑子萜醇甲基酯(白茅素，cylindrin)是甘 蔗(5"acc力ar咖0/"/yci朋r〃/z7)， 布迪椰子(^/"<3 c邵iz^ta)， 油棕(Z/aeis ^w7 e朋w^)等植物叶片蜡质的主要成分，而且异山柑子萜醇及白茅素存在于水稻 的叶片和根中(Yanagawa et al. ， phytochemistry, 11:1893-1897)，但目前为止， 还有没有从任何生物中分离到编码该酶的基因。 发明内容本发明的目的是提供异山柑子萜醇合成相关蛋白及其编码基因与应用。 本发明提供的异山柑子萜醇合成相关蛋白，名称为0s0SC12，来源于粳稻品种 中花ll号(&，j^a sa"ra Ljaponica)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列2的氨基酸序列经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与异山柑子萜醇合成相关的由序列2衍生的蛋白质。上述取代和/或缺失和/或添加具体可为1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加。序列表中的序列2由762个氨基酸残基组成。为了使(a)中的0s0SC12便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸 序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6 (通常为5个)RRRRRPoly-His2-10 (通常为6个)朋HH朋FLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述(b)中的0s0SC12可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表 达得到。上述(b)中的0s0SC12的编码基因可通过将序列表中序列1自5'端第1 至2289位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行 一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的 编码序列得到。所述蛋白的编码基因(&fl^6V》也属于本发明的保护范围。 所述蛋白的编码基因可为如下l)或2)或3)的DNA分子1) 其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3) 与l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且编码相同功能蛋白质 的DNA分子。所述严格条件为在O. 1XSSPE (或0. 1XSSC)、 0.1% SDS的溶液中，65。C条 件下杂交并洗膜。序列表中的序列1由2289个碱基组成，序列2中自5，端第1至2289位核苷 酸编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明还保护用于扩增所述基因(feasor)或所述基因(&osr")中的任一DNA片段的引物对。含有所述基因(&M^7力的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有^A5t72基因的重组表达载体。使用所述基因(0^ 5"67力构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加 上任何一种增强型启动子或组成型启动子；此外，还可使用增强子，包括翻译增强 子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号 和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可 以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入 可在细胞中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光 素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等) 或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从安全性考虑，可不加任何选择 性标记基因，直接以逆境筛选转化细胞。所述表达载体具体可为酵母表达载体，如毕赤酵母(pic力&)表达载体或酿酒 酵母(Saccharomyces) YES载体库中的载体。所述酵母表达载体还可以包括1) 用于蛋白分泌表达的a因子、pho; 2)用于产生融合蛋白的C末端和/或N末端的 6个HIS标签；3)用于制备抗体的c-myc表位；4)用于转化子筛选的Zeocin、 AMP、 杀稻瘟菌素抗性标记；5) URA3报告基因；6)用于诱导表达的A0X1、 GAP、 AUG1、 GAL1、 TEF1等诱导型启动子。所述重组表达载体具体可为图2所示的pPICZ-0SC12。所述转基因细胞系可通过将所述基因(&G5t7力导入细胞得到，具体可将所 述重组表达载体导入细胞得到，如将图2所示的pPICZ-0SC12导入酵母细胞得到。 所述酵母具体可为毕赤酵母或酿酒酵母。携带fl^5"a^基因的酵母表达载体可以通过任何常规分子生物学方法(如电击 法、热击法)导入酵母细胞，获得转化的单克隆酵母细胞系。本发明还保护一种生产异山柑子萜醇的方法，是培养所述转基因细胞，得到异 山柑子萜醇。本发明从粳稻中克隆得到了 0s0SC12蛋白及其编码基因，为首次获得异山柑子 萜醇合成酶的基因序列，该基因是水稻异山柑子萜醇及其下游产物合成途径的关键 步骤，将有利于解析水稻的异山柑子萜醇三萜途径代谢及阐述该途径的生物学功能。本发明通过将所述异山柑子蔽醇合成相关蛋白的编码基因导入酵母细胞，得到 了所述基因的酵母转化细胞，培养该细胞即可得到异山柑子萜醇，具有重要的应用 价值和深远的意义。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为^05t72基因扩增产物的电泳图。 图2为pPICZ-0SC12的物理图谱。 图3为^仍t7^酵母转化细胞发酵产物的鉴定。 图4为发酵^仍r72酵母转化细胞生产的异山柑子萜醇的色谱图。 图5为发酵^0St72酵母转化细胞生产的异山柑子萜醇的MS分析图。 图6为发酵flsflS^7i"酵母转化细胞生产的异山柑子萜醇的结构图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例l、 fls必Z^2基因的获得根据来源于燕麦的氧化鲨烯环化酶(0SC)基因As657 (GenBank Accession Number: AJ311790)和As力A5" (GenBank Accession Number: AJ311789)序列在NCBI 数据库中进行blastn检索，在水稻基因组中发现12个同源性较高的全长cDNA序 列，根据其中一个基因(&OST7力的核苷酸序列设计以下引物5，端引物5、-ATGTGGAGGCTGAAGGTGGC-3、；3，端引物5、-TCATGCACGCCTCGTGGAG-3、。以粳稻品种中花ll号(0ryza sativa L. s卯.japonica)幼苗总RNA为模板， 用上述引物对进行RT-PCR扩增，具体步骤如下1、 总RNA的提取用Trizol法(所用试剂购自Invitrogen公司)提取2周幼苗的总RNA，具体方 法为收集100mg水稻材料，立即置于液氮中研磨，加入lmL Trizol试剂，充分 混匀后，室温放置5分钟；加入0.2mL氯仿，剧烈振摇15秒，室温温育3分钟； 4°C, 12000g离心15分钟；将上清液转移到一个新的1. 5mL离心管中，加入0. 5mL 异丙醇沉淀RNA;最后将RNA沉淀用lmL 75%乙醇洗涤后溶于适量经DEPC处理过 的双蒸水中，-7(TC保存备用。2、 cDNA的合成应用S叩erscriptII RT试剂盒(Invitrogen)并按试剂盒说明书进行操作 取1-5 u g步骤1获得的水稻总RNA放入灭活了 RNase的PCR管中，加入1 U L Oligo(dT) 12-18(500mg/mL)和1 u L dNTP混合物(各10mM)，用DEPC处理后的双蒸 水补充至12uL，混匀后在65。C下加热5分钟，然后迅速置于冰上，l分钟。短暂 离心后再加入4 u L 5 X第一链合成缓冲液、2 u L 0. 1M DTT禾f] 1 u L RNaseOut (40U/u L)，轻轻混匀后，42。C温育2分钟，然后加入1 u L Superscript II 反转录酶(200U/yL)，混匀，42-C温育50分钟，70。C加热15分钟使酶失活，得 到第一链cDNA。 3、基因克隆取luL步骤2获得的反转录产物为模板，在5'端引物和3'端引物的引导下， 进行PCR。PCR反应体系为0. 5 u L proof start (Qiagen公司)、5 u L 10 X缓冲液(Qiagen 公司)、luLdNTP、 luL5，端引物(10uM/L)、 luL3，端引物(10uM/L)、 1 u L 模板、加双蒸水补充反应体系至50ixL。PCR反应条件为先95。C 5分钟；再94。C 45秒，60°C 45秒，72°C 5分钟， 共35个循环；最后72。C 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。 图1中，M: DNA标准分子量入DNAAfibc^7^/"^T/; 1: RT-PCR产物。结果表明， 得到了分子量约为2.2kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北 京天为时代公司)回收该片段，然后将该回收片段与pGEM-TEasy (Promega)进行 连接。连接体系为lpLT4DNA连接酶(3u/uL)、 5 u L 2X连接酶缓冲液、0.5uL pGEM-TEasy(50ng/ixL)和3. 5 u L PCR回收产物。连接反应条件为4。C反应12-24 小时。参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，将连接产物转化 大肠杆菌DH5a感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选 阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该质粒载体上的T7和SP6启动子序 列为引物对其进行核苷酸序列测定。测序结果表明扩增到的序列由2289个碱基组 成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列1的自5'末端第1-2289位脱氧核糖核苷 酸，编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。将序列1所示的DNA序列命名为 flsfl5t7么将序列2所示的氨基酸序列命名为OsOSC12，将在pGEM-T Easy中插入序 列1所示的核苷酸序列得到的重组载体命名为pTE-0^9^7么将OsG5TM和0s0SC12与^Z A5" (GenBank Accession Number: AJ311789)进 行同源性比较，核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为66. 67%和61. 44%。 实施例2、 &6>5^72酵母转化细胞系的获得及其鉴定一、 酵母表达载体pPICZ-0SC12的构建1) 用限制性内切酶^of I分别将pTE-fe(^"2和pPICZA载体(Invitrogen) 完全酶切。酶切体系为5ug pPICZA、 2.5ixL IOX酶切缓冲液、1"L I，加 ddH20补充反应体系至50nL。酶切反应条件为37'C酶切1小时。2) 用琼脂糖电泳对酶切产物进行分离，分别回收2.2kb左右的包含&仍t72 的片段和3kb左右的pPICZA载体片段，分别溶解于20uL ddH20中。3) 将步骤2)获得的两种片段进行连接反应。连接反应体系为2uL T4DNA 连接酶、2 p L IOX连接酶缓冲液、3 u L回收的包含0 61SZ7^基因的DNA片段、1 y L pPICZA载体片段。连接反应条件为4'C连接12小时。4) 将连接反应的产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有Zeocin的LB 平板(Zeocin浓度为50ug/ml)进行筛选。5) 将阳性克隆进行PCR鉴定，引物如下5' AOX引物5、- GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3、； 6^G502基因特异反向引物5、- TCGGGGAAGATGGGGTTGT-3、。 结果表明，^必r^基因插入了pPICZA，且方向正确，将该重组质粒命名为 pPICZ-0SC12，其物理图谱如图2所示。二、 fe仍t72酵母转化细胞系的获得及其鉴定 1、 ^^5t72酵母转化细胞系的获得应用电激仪(德国Eppendorf公司)并参照说明书进行操作。将质粒 pPICZ-0SC12用电激法转化野生型酵母X-33 (Invitrogen)，用含有Zeocin的LB 平板(Zeocin的浓度为400ug/ral)进行筛选。用0s0SC12基因特异引物对(5' A0X引物和3' A0X引物)鉴定阳性转化细胞， 具体步骤如下选取一个阳性转化细胞，重悬于10ul水；加入5ul5U/ul溶壁 酶(Sigma)溶液，30。C温浴10min， -80。C冰冻10min。 PCR体系:5u 1 10X buffer, 5u 1 25mMMgCl2， 1 u 125mM d證s， 1 u 1 10pmol/u 1 5' AOX弓|物，1 u 1 10pmo1/u 1 3' A0X引物，27ul蒸馏水，5ul上述细胞裂解液，混匀，加20ul石蜡油，置 于PCR仪，95°C 5min;加入5 y 1 0. 16U/ u 1 Taq (0. 8unit) 。 PCR程序30次(95。C lmin; 54°C lmin; 72°C lmin) ; 72°C 7min。 OsOSC12基因特异引物对如下 5' A0X引物5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'; 3' A0X引物5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。 电泳结果表明，得到了 &09672酵母转化细胞。
将质粒pPICZA电激导入野生型酵母X-33，得到作为对照的转空载体细胞。 实施例3、培养&G5t72酵母转化细胞生产异山柑子萜醇
1、 ^仍r72酵母转化细胞的培养
在250ml培养瓶加入25ml的MGY培养基(1. 34%酵母氮源，1%甘油，0. 00004% 生物素)，接种单个0 GSt72酵母转化细胞，28-30°C、 250-300rpm振荡培养，直 到达到对数生长期(0D6。。=2-6)，大约16-18小时。离心(1500-3000g、 5min)收 集细胞，弃上清，用MM培养基(1.34%酵母氮源，0.00004%生物素，0.5%甲醇) 重悬到0D6。。=1. 0，大约100-200ml。把培养物转到1L的长颈培养瓶，用2层无菌纱 布盖住培养72小时，每24小时添加一次100%的甲醇，使其甲醇的终浓度保持0. 5 %。试验设100个重复。
培养转空载体细胞，操作同上。
2、 异山柑子萜醇的鉴定 1)初步鉴定
① 裂解和提取酵母转化细胞和转空载体细胞的培养物
培养72小时后，分别收集25ml ^flSr7^酵母转化细胞和转空载体细胞的培养 物，室温下3000g离心2-3min。加入2ml含20%的KOH和50%乙醇的裂解液，95°C 处理15min。加入2ml正己垸进行萃取，重复萃取一次，合并2次萃取产物，挥干 后溶解于100ul的氯仿。
② 鉴定
取25-50 ul步骤①得到的溶液，点到硅胶板上，在正己烷乙醚的混合物(正 己烷乙醚=1: 1)中展开，在空气中干燥，用5ml染色液喷雾(4. 8ml冰乙酸，100ul 浓硫酸，100u lp-anisaldehyde) ， 130。C烘烤显色。结果见图3，图3中，1:转 空载体细胞的培养物；2:酵母转化细胞的培养物。
结果表明，在甲醇诱导表达以后，与转空载体细胞的酵母细胞相比，ttsG5t72 酵母转化细胞多了一条带，说明0s0SC12能在酵母中产生其催化产物。2) 进一步鉴定
① 裂解和提取酵母转化细胞和转空载体细胞的培养物 同上述步骤l)中的①。
② 鉴定
将50 u 1步骤①得到的溶液，用氮气吹干后用50 u 1 BSTFA禾n 25 u 1 pyridine 溶解，在8(TC衍生化1小时，取4叱用于GC-MS (Agilent 6890 Gas Chromatograph) 分析，毛细管柱为DB-5 (Hewlett-Packard HP5， 35 m length 3 0. 25 mm diameter 3 0.25 mm thickness)。结果见图4。
结果表明，携带水稻0^5^72的酵母细胞表达物比转化空载体的酵母细胞在 29. 6min多了一个色谱峰。
MS的检测器在70eV能量下，以30次/秒的速度扫描，扫描区间为30-700u。 将MS峰的数据和已知的三萜化合物数据库比对，见图5。图5中，图5中，a为本 实验获得OsOSC12产物的MS峰图，b为发表文献中isoarborinol的MS峰图。
3) 分别将5-10升as仍Z^2酵母转化细胞的培养产物，以上述步骤1)中相同的 方法裂解、提取、硅胶板层析后，刮取0s0SC12对应的层析带，用5ml氯仿洗脱3 次，收集上清，挥干后获得8mg产物，经'H- 、 13C- NMR (600MHz)和MS分析，确 定产物为异山柑子萜醇Isoarborinol，结构见图6。
OsOSC12无色细针状结晶(氯仿)，Liebermann-Burchard反应阳性。0s0SC12 结构鉴定数据如下EI-MS m/z: 498[M+Si(CH3)3] + ， 483， 393， 369， 331， 241， 191， 129， 73; !H-臓(CDC1" 600MHz) S: 0.72， 0.73， 0.75， 0.77， 0.84， 0.88， 0.98， 1.03 (各3H， 8XCH3) ， 3.20 (1H， dd， /=4.2， 12.0Hz， 3a—H) ， 5.23 (m， d， J=5.4Hz， H—11) 。 13C—羅R (CDC13， 125MHz) S: 14.00 (C-28) ， 15.28 (C-27) ， 15.62 (C-23) ， 17.02 (C-26) ， 20.17 (C-19) ， 21.43 (C-25) ， 22.13 (C-29) ， 22.13 (C-24) ， 22.70 (C-7) ， 23.00 (C-30) ， 26.68 6) , 27.82 (C-2) ， 28.22 (C-20) ， 29.65 (C-15) ， 30.77 (C-22) ， 35.93 (C-1) ， 36.01 (C—12) ， 36.06 (C—16) ， 36.78 (C—13) ， 38.19 (C—14) ， 39.07 (C—10) ， 39.63 (C-4) ， 40.97 (C-8) ， 42.85 (C-17) ， 52.08 (C-18) ， 52.34 (C-5) ， 59.65 (C—21) ， 78.95 (C-3) ， 114.32 (C—11) ， 148.87 (C—9)。序列表
〈110〉中国科学院植物研究所
〈120〉异山柑子萜醇合成相关蛋白及其编码基因与应用
<130〉 CGGNARY81567
<160> 2
<210> 1 <211> 2289 〈212〉 DNA
〈213〉稻属水稻(ftryz3 5vs"ra L. spp. japonica)
<400> 1
atgtggaggctg肌ggtggcccagggcggcggcgctttgttgcggtcgacga^cggcttc60
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cgcaacttattccctatctgggctcttggagagtactgtcgtcatcttca ctccacgagg2280
cgtgcatga2289
〈210> 2
<211> 762
<212> PRT
〈213〉稻属水禾舀(Oiyzs ss"ra L spp. japoniceO<400〉 2Met Trp
1
Thr
Asn
Gly Thr
Thr
Met
65
Pro
Asp
50
Gin
Arg
Gly
Pro
35
His
Thr Val Met
Gin Ala
lie
Thr145Asn
Met130Val
Asp115Pro
Gly Glu
lie
Ser210
Glu195His
Leu Lys Val Ala Gin Gly Gly Gly Ala Leu Leu
Phe20Glu
5
Ala
AspArg Leu
Phe Ala Arg
Pro Ala Val
Ala100Asp
Ser Thr Met
Phe180Pro
Asn
85
Ser
Gly
Arg
Arg
Glu
70
Lys
Leu
Gly HisVal Leu lie
lie Ser Ser
His Gin Asn
Glu165Ala
Glu150Asp
Thr
Ser Asn
Arg Ala
Ala
Arg
55
Asn
Gly Gly Ala
Asn
40
Pro
Trp
Phe135His
Gly
Cys
Glu
Thr215
Val
25
Val
10
Trp Glu Phe Asp
Glu Arg Val Arg45Leu
Glu Ser Ala
Asn His Gin
Leu Gly GluArg Arg
Pro120Ser
Arg
Gly
Leu
Gin200Leu
Ala105Gly
Lys
90
Leu
Arg
Trp
Asn185Leu
Arg
75
Glu
Asp60Arg
Gin
GlyVal
AspLeu Tyr Ala
Leu Ser
Glu
Gly170Tyr
lie155Met
Thr140Cys
Gly125Gly
Ala Arg Gly
Val Pro Gin
Trp220
His205Gly
Pro30Arg
Arg
15
Asp
Asp Glu Phe
Thr
Ser110Ala
Glu
95
Ser
Leu lie Leu
Val Thr Leu
Arg190Ala
Ser
His
Asp PheLeu Met ArgAsp Arg
lie80Glu
Leu
lie Phe
Ser Leu AspArg Tyr lie
Gly175Leu
Tyr160Ser
lie
Trp lieLys lie CysSer lie lie Gly Val Tyr Glu Trp Ser Gly Asn Asn Pro lie230
Ala Pro Gin Phe
Leu225
Pro Glu Leu Trp
Phe Trp Gly
Gly
Glu
Glu290Asn
Lys275lie
Ala
Pro260Phe
丁yr
Cys
Cys305
Gin Asn Val Val
Leu245Thr
Val
Thr
Ser
Gly235
Pro Phe His Pro
Arg Val ValGly ProAsp
Leu250
Val Pro Met Ala
Tyr265
Thr Pro Thr lie
lie280
Tyr His Thr lie
Tyr270Ala
Gly255Leu
Leu
Phe240Lys
Tyr
Arg
Pro295
Glu Asp Leu Val
l>eu285
Trp Ala Gin Ala
Lys310
Thr Ser Leu Tyr
Asp300
Pro Arg Thr Leu
Trp325
Met Asn Lys Leu
Cys315
Trp Val Glu Pro
Gly Ser Arg Pro340
lie His Tyr Glu
Lys330
Glu Arg Ala Leu
Met Glu His355
Val Asn Lys Ala
Arg345
Glu Asn Ser Gin
Val335Arg
Leu320Leu
Leu
Cys
Pro370
Asn Ser Asp Ser
Asp360
Asn Met Val Cys
Asp350
Leu Cys Leu
Pro385
Leu Trp Leu Ser
Gin Ser Trp Glu420Glu
Leu375
Lys Arg His Leu
Tyr365
Trp Val Glu Asp
Phe390
Asp Gly Met Lys
Glu405
Thr Ala Phe lie
Ala395Gin
Cys380
Arg lie Pro Asp
lie
Leu Val
Lys
Asn450
Asn435Ser
Gin
Tyr Gly Ser
lie M'et Arg455
lie425Val
Ala410
Gin Ala PheArg Arg Ala
TyrCys
Asp
Gly415Thr
Phe400Cys
Asp
Thr Val Arg Arg440
Asn His Pro Gly
Ala430
Glu Phe Met
Asp460
His445
Gin Ser Tyr TrpHis 465 Gly
Arg His Arg Ser Lys Gly Ser Trp Thr Leu Ser Ser Ala Trp Ala Val
Lys 470
Asp Thr Thr Ala
Ser 485
lie Ser Ser Asn
Leu 475
Ala Leu Lys Ala
Leu Leu Glu Lys 500
His Asp Ala Val
Glu 490
Val Gly Asp Pro
Glu Arg Leu 515
Thr Leu Ser Thr
Val 505
Cys Leu Leu Ser
Asp
Gly 530
Val Leu Ser Pro
Asp 520
Glu Cys Lys Arg
Glu 545
Pro Phe Pro Glu
Tyr 535
Glu Ser Phe Pro
Phe 525 Tyr
lie 510 Val
Thr
Cys 550
Thr Ser Ser Val
Thr 540
lie Val Val
Lys Gin Leu Arg Asn Trp
Cys 565
Pro Ser Tyr Arg
Asn 555
Gin Ala Leu Val
Val 625 lie
Gly
lie
Ala
Leu 610 Lys
Arg
Trp
Lys
Leu 690
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His 580
Ala Met Phe lie
Leu 570
Lys Glu lie Glu
lie 585
Ser Thr Gin Gly
Asp Asn 480 VaJ Leu 495
Glu lie
Asn Lys
Trp lie
Asp Tyr 560 Leu Phe 575
Cys Val
Gly Lys Gly
Thr
Leu
Ala
Trp lie
Gly
Ala 630 Asp
Val 615 Ala
Phe
Glu 600
Cys Phe Thr Tyr
Lys 590
Asp Gly Ser
Glu 605
Ala Phe Leu Ser
Cys 645
Ser Tyr Val Ser
Gly Arg Thr lie
Gly 620
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Leu
Tyr 635
Lys Gin Leu Asp
Glu 660
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Ser 650
lie Thr Lys Val
Asp 675
lie Cys Ala Gly
Asn 665
Val Asn Thr Ala
Ser Ser 640 Thr Gly 655
Val Asn
Gin 695
Ala 680
Met Glu Arg Asp
Tyr 670
Ala Met Leu
Pro 700
Trp 685
Ala Pro Leu HisArg Ala Ala Lys Glu Uu lie Asn Met Gin Leu Glu Thr Gly Glu Phe 705 710 715 720
Pro Gin Gin Glu His Val Gly Ala Phe Asn Ala Cys Leu Phe Phe Asn
725 730 735
Tyr Pro Asn Tyr Arg Asn Leu Phe Pro lie Trp Ala Leu Gly Glu Tyr
740 745 750
Cys Arg His Leu His Ser Thr Arg Arg Ala 755 760
权利要求
1、一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与异山柑子萜醇合成相关的由序列2衍生的蛋白质。
2、 权利要求l所述蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白编码基因为如下l)或2) 或3)的DNA分子1) 其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DM分子；3) 与l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。
4、 用于扩增权利要求2或3所述基因或所述基因中的任一 DNA片段的引物对。
5、 含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌。
6、 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体的出 发载体为酵母表达载体，优选毕赤酵母表达载体或酿酒酵母表达载体。
7、 根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为图2 所示的pPICZ-0SC12。
8、 根据权利要求5所述的转基因细胞系，其特征在于所述转基因细胞系是将 权利要求2或3所述基因导入酵母细胞得到的。
9、 根据权利要求8所述的转基因细胞系，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母或 酿酒酵母。
10、 一种生产异山柑子萜醇的方法，是培养权利要求8或9所述的转基因细胞， 得到异山柑子萜醇。
全文摘要
本发明公开了一种异山柑子萜醇合成相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的异山柑子萜醇合成相关蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与异山柑子萜醇合成相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明从粳稻中克隆得到的OsOSC12蛋白及其编码基因，为首次获得异山柑子萜醇合成酶的基因序列。本发明通过将所述异山柑子萜醇合成相关蛋白的编码基因导入酵母细胞，得到了所述基因的酵母转化细胞，培养该细胞即可得到异山柑子萜醇，具有重要的应用价值和深远的意义。
文档编号C12N9/00GK101633914SQ20081011722
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者段礼新, 漆小泉, 薛哲勇 申请人:中国科学院植物研究所