专利名称：用Candida sp.CZMWL-3菌生产核黄素的制作方法
技术领域：
生物技术
背景技术：
核黄素(riboflavin)又名维生素B2，化学名称为6， 7-二甲基-9-(r-D-ribityl)-异咯嗪，是人和动物自身不 能合成的低分子有饥化合物，其分子式为C17H2QN406，相对分子质量为376。核黄素是维持机体正常代谢 所必需的营养物质，是机体内许多酶系统的重要辅基--黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)与黄素单核苷酸(FMN) 的组成成分，参与机体的能量代谢和各种物质代谢。目前核黄素的生产方法主要有两种 一种为化学合成 法，另一种微生物发酵法。由于化学合成法反应步骤多、工艺长、回收率低、成本高(要用到较贵的起始反 应物D-核糖)、耗能大，因此远不能满足工业需求，正逐渐被微生物合成法所取代。方尚玲等以阿舒假囊 酵母(^柳o^d鹏^ 一0为出发菌株，用蜗牛酶和纤维素酶处理，制备的原生质体用紫外线诱变后，得 到1株高产菌株，核黄素发酵由2040u g/mL提高到3360 u g/mL。李建国利用重组枯草芽孢杆菌24 / pMX45 发酵生产核黄素，以酵母粉为氮源时核黄素产量可达3200mg/L。 P. Buzzini利用藻酸钙固定化的热带假丝 酵母连续发酵生产核黄素，第5天核黄素产量可达576mg/L。
这些核黄素发酵工艺所用的菌株均来自于陆地，而没有利用从海洋环境分离到的酵母菌作为生产核黄 素的菌株，而且需要利用有机氮源如酵母提取物、蛋白胨等配制培养基，成本较高，培养往往需要去铁， 匸艺复杂。
发明内容
本发明的目的是提供来源于海洋的酵母菌株Ow^'^ sp. CZMWL-3，并利用该菌株生产核黄素的方法。 本发明分离纯化出一株来源f海洋的酵母菌株Ca"&c^sp.CZMWL-3，其具有产生核黄素的特性，保 藏单位简称CGMCC，保藏号为CGMCCNo.2332，保藏日期为2008年01月10日。
本发明的特点是首次从海洋环境中分离出产核黄素的Ca"c/Wasp.CZMWL-3菌株。经鉴定为假丝酵 母酵母(Caw/Wasp.)，经优化核黄素生产工艺，生产的核黄素可达21mg/L。所用的培养基为,4)2504 0.5%, KH2P04 0.1%, MgS04 7H20 0.05%, CaCl2 2H20 0.01%, NaCl 0.01%,蔗糖2%，酵母粉0.02%。温 度为28。C，发酵时间为48小时。本发明所用的菌株CZMWL-3具有营养要求简单，发酵周期短，培养基 不用出去铁离子的特点，因此用该菌株生产核黄素具有很高的成本优势和广泛的应用前景。
具体实施例方式
1、 从东海表层海水采集样品，选取在核黄素初筛液体培养基中产黄色物质的单菌落，通过测定 其核黄素产量进行复筛，得到具有高产核黄素的一株酵母菌株。该菌株通过形态观察和生理 生化鉴定为Ca/7力'A sp.。菌株编号CZMWL-3。生产核黄素的液体培养基的组成为(NH4)2S04 0. 5%, KH2P04 0. 1%, MgS04 7H20 0. 05%, CaCl2 2H20 0. 01%, NaCl 0. 01%,蔗糖2%，酵母粉0. 02%。
么 核黄素的生产将菌株CZMWL-3接入上述的液体培养基中，170rpm, 28。C振荡培养48h，将
培养基离心收集上清液，即为核黄素粗提液。 J、 核黄素产量的测定利用分光光度计测定上述粗提液在440nm的吸收值，参照标准曲线即可
计算出核黄素的含量。
4、 核黄素的纯化和鉴定:将50ml0.1M的盐酸加入50ml核黄素粗提液中，溶液混合均匀后100 。C 水浴30min。冷却后用2.5M乙酸钠溶液调节pH值至4.5，定容至100ml,过滤，滤液用MT 型样品净化富集柱(C18)富集，用甲醇洗脱即得核黄素纯品，富集柱可反复使用。核黄素纯 品经HPLC验证纯度高。利用标准品核黄素进行HPLC测定，根据标准品核黄素和纯化的核 黄素相同的出峰时间进行鉴定。
权利要求
1、一种酵母菌Candida sp.CZMWL-3菌生产核黄素，其保藏号为CGMCCNo.2332。
2、 一种使用权利要求1所述的菌株制备核黄素的方法。
全文摘要
首次从海洋环境中分离出产核黄素的Candida sp.CZMWL-3菌株。经鉴定为假丝酵母(Candida sp.)，经优化核黄素生产工艺，生产的核黄素可达21mg/L。所用的培养基为(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 0.5％，KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.1％，MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.05％，CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.01％，NaCl 0.01％，蔗糖2％，酵母粉0.02％。温度为28℃，发酵时间为48小时。冷却后用2.5M乙酸钠溶液调节pH值至4.5，定容至100ml，过滤，滤液用MT型样品净化富集柱(C18)富集，用甲醇洗脱即得核黄素纯品，富集柱可反复使用。核黄素纯品经HPLC验证纯度高。本发明所用的菌株CZMWL-3具有营养要求简单，发酵周期短，培养基不用除去铁离子的特点，因此用该菌株生产核黄素具有很高的成本优势和广泛的应用前景。
文档编号C12N1/16GK101633895SQ20081013419
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月22日 优先权日2008年7月22日
发明者岳礼溪, 静 李, 哲 池, 池振明, 麟 王, 王祥红 申请人:中国海洋大学