专利名称：一种高效的小分子干扰rna设计的方法
技术领域：
本发明涉及的是分子生物学中所用的小分子干扰RNA设计的方法。特别是一种高效的小 分子干扰RNA设计的方法。适用于各种小分子干扰RNA的设计。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物学界过去20年中最令人兴奋的发现，它是一 种基因转录后水平调控基因表达的方式，19卯年，这种现象被首次发现后，就引起了人们的 研究兴趣。Fire等人提出RNAi现象这个概念后，更是极大地促进了人们对RNAi机制的探索。 RNAi是在mRNA水平上由内源性或外源性双链RNA ( double-stranded RNA, dsRNA)诱发的高 度特异的基因沉默机制。RNAi技术是理想的基因敲除的新技术，能高效特异性地抑制基因表 达。运用RNAi技术将dsRNA切割成21—23个核苷酸的干扰性小分子RNA(sma11 interfering RNA， siRNA )，转染至靶细胞后与细胞内的内切酶形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC), RISC以siRNA为模板特异地识别其同源性靶mRNA分子并对其进行递进式 剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异性的mRNA降解，从而导致该基因不表达。在 哺乳动物细胞中引发特异性基因沉默最有效的小分子干扰RNA (siRNA)是21个核苷酸。
早在19卯年，Napoli CD等在向紫色牵牛花转导色素合成基因时，观察到"共抑制" (cosuppresion)现象，不仅没有观察到花色的加深，反而发现花色变为白色或紫白相间，当时 人们认为造成这一现象的原因是导人的基因并未表达，而且使植物本身合成色素的基因失活。 而真正发现dsRNA能引起基因沉默，则是在20世纪末，1995年，Guo和Kemphues利用反义RNA 技术特异性阻断美丽新小杆线虫(C.elegans)中Par-l基因时，发现无论反义RNA还是对照的正 义RNA都对Par-l基因的表达产生抑制效应。直到1998年，Fire A， Melo CC等分别用反义、正 义和双链RNA分子研究表明双链RNA分子可以高效特异性的阻断相应基因的表达，而纯化的 单链RNA，即使是反义RNA的效果也很微弱。Fire A认为前面提到的单链RNA(single strand RNA, ssRNA)导致Par-l基因沉默是由于制备单联时混有微量的互补ssRNA所造成的，并将这 种有双链RNA分子介导的基因沉默现象，称为RNA干扰。
RNAi的作用机理 '
在RNAi的作用过程中，有多种酶参加，其中关键的是dsRNA特异性核酸内切酶 (dsRNA-specific endonuclease, Dicer)，是一种存在于细胞质中的具有RNase II样活性的核酸内 切酶。不同生物体的Dicer具有相似的结构与生物学功能。它包含4个开放阅读框架:DexH-DEAR盒螺旋酶，PAZ(pinwheel-argonau -zwille)， 2个RNase IU催化区以及双链RNA 结合区(DS-RBD )。它是促使dsRNA裂解为小干扰RNA (small or short interference RNA, siRNA) 的关键因子。BLAST分析证明人的Dicer包含在149kb的BAC克隆中，全长52.3kb，包括28个 外显子和27个内含子。另外，还有RNA依赖性RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP), ATP酶和解旋酶等参加。RdRP在复制和放大效应中起重要作用;而较长的dsRNA向 siRNA的转变需要ATP参与，ATP能维持dsRNA5'端磷酸化，尤其是要与耙mRNA互补配对的 反义链。
通过对线虫体内RNAi机制的研究，人们发现自然界中的siRNA分子是一个由5'磷酸末 端和具有两个碱基冗余的3'羟基末端构成的长约21 25nt的双链RNA (dsRNA)分子。它们 是从内源或外源长双链RNA分子上由Dicer酶切割而来，这是一个耗能过程，需要ATP的 参与。Dicer是RNaseIII核酸酶家族的成员，RNaseIII家族在进化中非常保守，广泛地存在于 线虫、果蝇、拟南芥、真菌以及哺乳动物等生物体内，其在各种生物体内的含量和种类也有 差异，Dicer含有一个特殊结构，包括一个螺旋酶区和两个RNaseIII催化区。此外，Dicer还
包括一个与其他RNAi相关蛋白如RDE1/QDE2/ AGRONAUTE相互作用的区域--PAZ
区]。Dicer能够产生两种功能不同的小RNA: microRNA (miRNA)和siRNA。 miRNA能干 扰mRNA的翻译，而siRNA能与沉默复合物(RISC)结合，介导RISC对靶mRNA的切割。 RISC对耙mRNA分子切割通常发生在与siRNA同源部分的中间，离siRNA反义链5'端10个 碱基处，并且需要靶mRNA含有与siRNA的反义链5'端的1 10个碱基完全互补。此外，如 果耙mRNA3'端含有两个以上的碱基不能与siRNA分子配对，那么这种siRNA分子介导的基 因沉默的功能将大大降低。RNAi不仅能导致mRNA的降解，而且通过对拟南芥、线虫以及 真菌的研究，人们发现RNAi相关机制也能对染色体的结构产生影响，并且能沉默靶基因的 转录]。此外，植物中RNAi能通过甲基化抑制基因的转录活性；而在纤毛虫中，RNAi还能 调节染色体重排。
RNAi的作用特征
(1) 特异性RNAi的最大特点就在于高特异性。dsRNA特异地抑制干扰RNA同源序列 的靶基因表达，而对不相关序列的表达无干扰作用，这是由siRNA的反义链与mRNA同源区 互补配对所决定的。siRNA除正义链3'端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单 个碱基改变就可能使RNAi失效，而针对同源基因共有序列的RNAi则导致同源基因共同失活。②以病毒为载体体内合成siRNA:尽管以质粒载体为模板体内合成siRNA有许多 优点，但仍存在一些不足，特别是在细胞内siRNA的表达是瞬时的，转染效率低。因此有研 究者建立了操作更简便、转染效率更高的病毒载体系统，主要包括腺病毒、腺相关病毒、逆 转录病毒、慢病毒(lentiviral)等载体，不仅可用于体外实验，更为重要的是可直接用于动物实 验。总之，以DNA为模板体内合成siRNA载体的成功应用，为RNAi的研究提供了更为简便、 实用、经济的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的小分子干扰RNA设计的方法，可以用来设计构高效的小 分子干扰RNA。
本发明是这样实现的，小分子干扰RNA设计的应避免选择5'和3'端非编码区(UTR)和 起始密码区；应根据基因的mRNA，选择其AUG起始密码子下游50-100nt区域处的编码序 列；在此区域，应寻找AA(N19)或TTAA(N21)样序列，GC含量应在30%-70%之间，最好为 50%;分析基因可能的二级结构，针对基因的保守区和二级结构松散区设计小分子干扰RNA, 并在国际基因组库中比对，确定它们的序列不干扰其它的基因。
本发明设计好的小分子干扰RNA末尾的核苷酸要进行脱氧修饰， 一方面使其合成成本更 低，稳定性更高，在体内更好得抵御核酶的攻击。这种方法既可以用来设计各种高效的小分 子干扰RNA。。
具体实施例方式
实施例1
以人survivin mRNA(GenBank登录号:NM— 001168)为标准，用RNADraw软件分析其可 能的二级结构。
对GenBank中所登录的人的所有survivin基因进行序列比对，分析它们的结构保守区和 非保守区。
按照下列原则在survivin基因编码区内的结构保守区和二级结构松散区选择若干对19nt 的序列作为RNA干涉的备选靶点，设计编码siRNA的寡核苷酸片段。
把备选靶点基因片段的cDNA在国际基因库(GenBank)中进行BLAST序列比对，限定 在人(HomoSapiens)的序列，干涉位点应选在基因的非相似区，避免同时干涉其它基因。
选定的干涉位点避免与mRNA的两端太近。把选定的N19序列再用BLAST比较，与无 关RNA —致的序列应少于17个碱基。GC含量约40-60%等。
耙向survivin基因的siRNA应选择在survivin基因的开放阅读框内的结构保守区，以便 于扩大siRNA的抗肿瘤谱；同时，siRNA应选最好在survivin基因二级结构松散区，方便siRNA 与靶标结合，从而最大限度地发挥RNA干涉作用。计算机模拟筛选得到的最优化的3个siRNA cpusiRNAl， cpusiRNA2， cpusiRNA3它们的靶标分别是5'-AAACTGGACAGAGAAAGA GCC-3' ， 5'-AAGAATTTGAGGAAACTGCGA-3' ， 5'-AAAGCATTCGTCCGGTTGCGC墨3'和5'-TTGT GGCAAGCTCTGAGCTTT-3'。
负对照siRNA序列是以筛选到siRNA序列碱基为基础，采用计算机随机打乱排序的方法 得到，并将它在国际基因库(GenBank)中进行BLAST序列比对，限定在人(Homo Sapiens) 的序列，干涉位点应选在基因的非相似区，避免干涉人类基因。
将计算机模拟筛选得到的最优化的3对siRNA cpusiRNAl, cpusiRNA2， cpusiRNA3和负 对照siRNAcpusiRNA4末尾的核苷酸进行脱氧修饰，这种修饰一方面使其合成成本更低，稳 定性更高，另一方面也有利于它们在体内更好得抵御核酶的攻击。 cpusiRNAl Sense siRNA strand: 5'- ACUGGACAGAGAAAGAGCCtt -3' cpusiRNAl Antisense siRNA strand: 3'- ttUGACCUGUCUCUUUCUCGG -5' cpusiRNA2 Sense siRNA strand: 5'- GAAUUUGAGGAAACUGCGAtt -3' cpusiRNA2 Antisense siRNA strand: 3'- ttCUUAAACUCCUUUGACGCU -5' cpusiRNA3 Sense siRNA strand: 5'-AGCAUUCGUCCGGUUGCGCtt -3' cpusiRNA3 Antisense siRNA strand: 3'- ttUCGUAAGCAGGCCAACGCG -5' Negative control cpusiRNA4:
Sense siRNA strand: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt陽3' Antisense siRNA strand:3' -ttAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5'.
实施例2
siRNA的合成
仪器 OligoPilot II DNA/RNA Synthesizer (瑞典Pharmacia公司)，HP-1100型高效液 相色谱仪(美国惠普公司)，DU2640紫外分光光度计(美国Backman公司)。
材料和试剂合成柱(6.3 mL )，分子筛(3A Sigma)， 30HL载体(批号256723)， RNA Pac PA 100分析柱(美国Dionex公司)，5种核苷酸单体(A，U，C,G,dT),乙腈，二氯乙酸，四唑，N2 甲基咪唑，除注明厂家外，其余为瑞典Pharmacia公司产品。
siRNA的化学合成用乙腈将5种单体(A,U，C，G， dT)配制成0.2 mol/L溶液，分别将5 种单体、乙腈、二氯乙酸、四唑安装到合成仪相应位置，其中单体、乙腈、四唑应加入适当 分子筛。合成步骤:(1)利用二氯乙酸处理结合于固相载体的核苷酸或寡核苷酸，脱去其5'羟 基官能团上的二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团，露出反应性的5，端；(2)偶联反应由四唑 催化完成，形成3，一5'磷酸酯链;(3)封闭反应将未反应5'羟基在N2甲基咪唑催化下由乙酸 酐来完成。RNA合成仪按照设计好的程序合成出CPUsiRNA2和负对照siRNA的单链RNA。 应用紫外分光光度计检测D260nm值，并计算产量。
合成粗产品的HPLC色谱分析色谱柱DNA 2Pac PA 2100 (4mm X250mm);样品20OD/m L ,进样的量20 u L;流动相A: 25 mmol/L Tris， 1 mmol/LEDTA , 10%乙腈，pH 8;流动 相B: 25 mmol/L Tris， 1 mmol/L EDTA , 3 mol/L NH4C1, pH 8;洗脱梯度流动相B在40 min 内从10%到70%;流速1 mL/min;检测波长260 nm;柱温50 °C。
合成的单链RNA的正义链和反义链后，退火成双链的CPUsiRNA2和负对照siRNA，之 后进行HPLC纯化的纯度大于97%的双链3对siRNA cpusiRNAl, cpusiRNA2， cpusiRNA3和 负对照siRNA cpusiRNA4。
实施例3
实验材料人非小细胞肺癌细胞株A549 主要试剂
GIBCO公司
GIBCO公司/杭州四季青公司 Fluka公司 Sigma公司
宜春学院天然药物研究江西省重点实验室 江苏森豪药业股份有限公司
RPMI1640培养基干粉 小牛血清
Trypsin 、 DMSO 、 MTT
青霉素、链霉素
Ursolic acid标准品 Cisplatin
培养基及常用溶液
肿瘤细胞培养基RPMI1640培养基加入10%的小牛血清。含2g/L NaHC03，青霉素 100U/ml和链霉素100U/ml，过滤除菌，4。C保存。
PBS: 800ml水中溶解0.2gKCl， 0.44gNa2HPO^Q 0.24gKH2PO4， HCl调节pH为7.4， 加水定容至1L，高压灭菌。
消化液EDTA/PBS(无Ca2+Mg2+)/胰蛋白酶缓冲液 主要仪器
C02培养箱
酶标仪
荧光倒置相差显微镜
高速冷冻离心机
超低温冰箱
微量高速离心机TGF-16G
恒温水浴锅
隔水式培养箱
高压灭菌锅
美国Thermo Forma公司
Bio Rad公司
德国Leica公司
日本HITACHI公司
日本SANYO公司
南京大学仪器厂 常州国华电器有限公司
上海福玛公司
上海三申医疗器械有限公司 8超净工作台 苏州净化设备厂 电子天平 上海民桥仪器有限公司 6孔、24孔及96孔细胞培养板 Corning Costar公司
实验方法
MTT法测定肿瘤细胞和正常生长的抑制作用
将细胞(活细胞率295%)接种于96孔培养板，每孔含3-5"03个细胞，空白孔不接种细胞， 置于37。C， 5%(202饱和湿度的细胞培养箱内培养。待细胞培养24hr贴壁后去掉培养基，加 入不同浓度的受试药物，阴性孔和空白孔均加入无血清培养基作为对照，每孔200W，细胞培 养44hr后吸去培养基，每孔加入5mg/ml MTT 20pl，温育4hr。弃上清，每孔加入DMSO 150^1， 酶标仪测定490nm值，按下式计算细胞生长抑制率并作图计算IC50[1]。每个剂量浓度设3个 平行孔，重复试验3次。
Inhibition Ratio(%)=(阴性孔OD值-试验孔OD值)/(阴性孔OD值-空白孔OD值>100% siRNA对肿瘤细胞和正常生长的抑制作用
cell line/siRNA/density 50nM 100nM 150nM 200nM 1C50
A549/cpusiRNAl(%) 74.6**±2.2 74.2**±2.0 77.6**±2.289.1**±1.3 U.6nM
A549/cpusiRNA2(0/o) 67.1**±2.8 72.5**±4.0 77.4**±1.992.3**±4.3 32.0nM
A549/cpusiRNA3(%) 53.8**±4.1 74.8**±3.8 76.9**±4.589.7**±4.4 45.8nM
n=10， mean士SD,重复3次，*为P<0.05 (有显著差异)**为P<0.01 (有极显著差异)。
权利要求
1、一种高效的小分子干扰RNA设计的方法，主要是应避免选择5’和3’端非编码区(UTR)和起始密码区；应根据基因的mRNA，选择其AUG起始密码子下游50--100nt区域处的编码序列；在此区域，应寻找AA(N19)或TTAA(N21)样序列，GC含量应在30％-70％之间，最好为50％。
2、 根据权利要求1所述的小分子干扰RNA设计的方法，分析基因可能的二级结构，针对基因 的保守区和二级结构松散区设计小分子干扰RNA，并在国际基因组库中比对，确定它们 的序列不干扰其它的基因。
3、 根据权利要求1或要求2所述的小分子干扰RNA设计的方法，对设计好的小分子干扰RNA 末尾的核苷酸进行脱氧修饰， 一方面使其合成成本更低，稳定性更高，在体内更好得抵御 核酶的攻击。
4、 根据权利要求1或要求2或要求3所述的小分子干扰RNA设计的方法，其特征在于该方法 可以用设计各种高效的小分子干扰RNA。
全文摘要
本发明提出一种高效的小分子干扰RNA设计的方法。主要是应避免选择5’和3’端非编码区(UTR)和起始密码区；应根据基因的mRNA，选择其AUG起始密码子下游50-100nt区域处的编码序列；在此区域，应寻找AA(N19)或TTAA(N21)样序列，GC含量应在30％-70％之间，最好为50％；分析基因可能的二级结构，针对基因的保守区和二级结构松散区设计小分子干扰RNA，并在国际基因组库中比对，确定它们的序列不干扰其它的基因。对设计好的小分子干扰RNA末尾的核苷酸进行脱氧修饰，一方面使其合成成本更低，稳定性更高，在体内更好得抵御核酶的攻击。该方法可以用来设计各种高效的小分子干扰RNA。
文档编号C12N15/11GK101451135SQ200810136608
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月24日 优先权日2008年12月24日
发明者陆云华 申请人:宜春学院