专利名称：一种简单快速筛选溶栓酶的方法
技术领域：
本发明涉及的是简单快速的溶栓酶筛选的方法。它是一种低成本，高效率的用于微生物筛 选的培养基。特别是筛选溶栓酶的培养基。
背景技术：
血栓栓塞性疾病是涉及到血液和循环系统的疾病，其病残率和病死率均比较高。常见的
有冠状动脉疾病形成血栓而引起心肌梗塞或心胶痛;心血管疾病形成血栓，即脑血栓中风:肺动 脉栓塞引起肺梗塞或急性肺原心脏病;肢体动脉血栓形成和栓塞引起肢端疼痛或坏死;肢体静 脉血栓形成引起局部水肿和疼痛:其他脏器的动脉栓塞引起各该脏器的梗塞等:全身毛细血管 内发生弥漫性血栓，形成独特的疾病即播散性血管内凝血。
血栓是指人体内血液成分(血小板、凝血因子)在血管或心脏腔内形成的凝块，栓塞是指 在心或心血管内形成的血栓，全部或部分脱落，随血液流向远端，堵塞血管腔，从形态上看， 血栓分为白色、红色和红白混合三种，白色血栓主要由血小板组成，多发生在血流急速的部 位如动脉和心腔内，也见于静脉血栓的起始部位:红色血栓由纤维蛋白和红细胞组成，多发生 于血流缓慢或停滞的部位，见于静脉血栓;红、白血栓相间的血栓称为混合血栓。
血栓形成的原因，简单地说是，随着人年龄的增长，体内纤溶系统功能逐渐降低，血液 中凝血与抗凝血功能失去平衡而出现凝血，即血栓(Z]。随着人类的生活条件和医疗条件的 提高和改善，人类的寿命也逐渐延长，因此作为老年性常见病一血栓栓塞性疾病具有增多的 趋势，据统计，全世界血栓栓塞性病人约1500万人，心脑血管血栓病己跃居人类死因的第一 位。
体内纤维蛋白溶解的过程，纤溶酶原在纤溶酶原活化素等物质的作用下变为纤溶酶，纤 溶酶是一种蛋白水解酶，可以水解纤维蛋白原和纤维蛋白。纤维蛋白是血栓的主要组成成分， 非溶性纤维蛋白转变为可溶性碎片，也即血栓溶解。
不同溶血栓剂的作用位点是不同的。尿激酶(UK)，组织纤溶酶原活化剂(t-PA)等直接作用 于纤溶酶原，使之转化为纤溶酶;而链激酶(SK)的激活作用分为两个阶段:先将血浆中的前活化 素转变为活化素，然后再由活化素将纤溶酶原转变为纤溶酶发挥作用。实验证明，用不同的 纤溶酶原活化素所激活的纤溶酶原，其产生的纤溶酶有不同的分子结构，但都具有纤溶活性。
除了纤溶酶可以直接作用于纤维蛋白和纤维蛋白原外，蛇毒、东菱克栓酶等也可以直接
作用于纤维蛋白原，而纳豆激酶(NK)， CK和蛇毒等溶栓剂可以直接水解纤维蛋白。近年来，溶栓药物的发展很快，根据溶栓药物的疗效及副作用的大小，可将溶栓药物分 为三代。
第一代溶栓药物以链激酶(SK)和尿激酶(UK)为代表，此类药物溶栓力强，但缺乏溶栓特 异性，在溶解纤维蛋白时又将血中的纤维蛋白原降解，而导致出血等严重不良反应。
第二代溶栓药物以组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)为代表，包括重组人组织型纤溶酶激活 剂、甲氧苯甲酞纤溶酶原链激酶激活剂复合物简称APSAC以及尿激酶原争pro — UK,又称单 链纤溶酶原激活剂scu-PA。此类药物具有一定程度的溶栓特异性，与抗凝剂、抗血小板药物 等联合作用治疗血栓是今后临床研究的主要方向，而如何减少第二代溶栓药物的副作用仍是 今后研究的重点。
第三代溶栓药物是应用现代分子生物学对第一代和第二代溶栓药物进行改造，在特异性、 半衰期、溶栓效率等方面进行改进和提高，但目前大多处于实验阶段。值得注意的是，溶栓 药物的分子结构的改变势必会或多或少地引起整个分子空间构象的改变，进而打破此类重要 生理病理调节分子多种功能的自然平衡，影响其自身的调节功能，这类问题需要在实际应用 中不断地进行探索。
第一代溶栓药物具有自身难以克服的缺陷，如出血、副作用大等，在临床的应用逐年下 降;第二代溶栓药物虽有改进，但也不十分理想。因此，近年来溶栓药物的开发呈现出两种趋 势:一种是寻找一些安全性好、疗效好、副作用小的天然来源的溶栓药物，并将其转化为基因 工程产品;另一种则是运用分子生物学论和基因工程技术对现有的溶栓剂分子进行重组和修 饰，研制新型溶栓剂即第三代溶性药物。
葡激酶(SAK)是金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外蛋白质，作用机理与链激酶相似，但在 临床试验中未见过敏反应。山于天然SAK来源少且制剂纯度不高，人们克隆了SAh丛因， 并在大肠杆菌中获得表达。
SAK作为溶栓药物有如下优点:(1)重组SAK对纤维蛋白特异性高，溶栓效果好，特别是 对富含血小板的动脉血栓，是治疗急性心肌梗塞的潜在药物;(2)有一定免疫原性，但不引起变 态反应，也无其它副作用，其突变体免疫原性降低，而它的溶栓效力不变;(3)重组SAK易于 大量制备，由于其不含二硫键，所以容易复性;(4)不激活系统性纤溶，无出血危险。
溶纤酶是从铜头腹蛇毒液中纯化得到的溶栓药物，由203个氨基酸组成，分子量22981 D， 能直接降解纤维蛋白和纤维蛋白原，人们将它与单克隆抗体相连接，在狗领动脉栓塞模型中， 这种药物有快速而持久的溶纤效果。
纳豆激酶(NK)是纳豆中存在的一种具有强烈纤溶活性的酶。该酶能显著地溶解体内外血 栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间，并能激活静脉内皮细胞产生纤获得NK的传统方法是从纳豆中提取，但此法不适用于大规摸的生产。采用控制调节基因，利用转基因技术组建基因 工程菌的方法可大幅度提高产量。黑龙江应用微生物月f从分泌NK的枯草杆菌基因组的DNA 中克隆到了NK基因，并在大肠杆菌中进行了表达，表达量占菌体总蛋白的15.2%。
NK作为溶血栓药物具有以下几个优点:(1)来源于食品，安全性能好;(2)分子量小，是一个 单链蛋白质，更易被人体消化吸收;(3)可由消化道吸收;(4)NK可直接作用于纤维蛋白，同时 还可激活体内的t-PA; (5)可用细菌进行液体发酵生产，造价低廉。
受日本研究人员从纳豆中分离筛选得到产纳豆激酶的菌种的启发，我国科学工作者从豆 豉中分离出几株产豆豉激酶的菌种。大量的实验表明，豆豉激酶是一种高效的可直接溶解纤 维蛋白的纤溶酶，不仅溶解能力强，而且无毒副作用，不引起内出血，半衰期长。豆豉纤溶 酶是从传统食品中发现的新型纤溶酶，无论作为抗血栓药物或是预防血.栓病的保健食品，都 具有十分重要的开发价值，因此，开发豆豉纤溶酶制剂具有极为诱人的广阔前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于快速的溶栓酶筛选的方法。它是一种低成本，高效率的用 于溶栓酶的微生物培养基。
本发明是这样实现的。溶栓酶筛选培养基，它包括1-4%猪血粉，0.5—3%蛋白胨，0.5—1.5 %NaCl， 1一3%琼脂粉，调pH7—8，其余为水，其特征在于添加14 %猪血粉。
本发明的原理是用猪血粉替代纤维蛋白，使其筛选成本大大降低，同时猪血粉中又带有 色素，这样有利于观察猪血粉中纤维蛋白被水解，有利于提高筛选效率和筛选灵敏度。
具体实施例方式
下面实施例对本发明进一步说明。
实施例1
. 将121。C高温灭菌20分钟的溶栓酶筛选培养基(2%猪血粉，1%蛋白胨，0.7%NaCl， 2%琼脂粉，调pH7.2)和传统的溶栓酶筛选培养基(2%纤维蛋白，1%蛋白胨，0.7%NaCl， 2%琼脂粉，调pH 7.2)各lOmL均匀倒在培养皿中，在37。C倒置12小时，用于筛选产豆豉 纤溶酶、纳豆激酶、葡激酶和链激酶的微生物，结果本发明的溶栓酶筛选培养基培养基无论 筛选灵敏度还是成本都明显优于传统的溶栓酶筛选培养基。
实施例2
将12rc高温灭菌20分钟的溶栓酶筛选培养基(2%猪血粉，1%蛋白胨，0.7%NaCl，2%琼脂粉，调pH7.2)和传统的溶栓酶筛选培养基(2%纤维蛋白，1%蛋白胨，0.7%NaCl， 2%琼脂粉，调pH7.2) lOmL均匀倒在培养皿中，在37'C倒置12小时，用于筛选产蚓激酶、 尿激酶、人体纤溶酶原激活剂的基因工程菌，结果本发明的溶栓酶筛选培养基培养基无论筛 选灵敏度还是成本都明显优于传统的溶栓酶筛选培养基。
权利要求
1、一种简单快速的筛选溶栓酶方法，主要是发明了一种低成本，高效率的溶栓酶筛选培养基，它包括1-4％猪血粉，0.5—3％蛋白胨，0.5—1.5％ NaCl，1—3％琼脂粉，调pH7—8，其余为水，其特征在于添加1—4％猪血粉。
2、 根据权利要求1所述的溶栓酶筛选培养基，其特征在于其组成为2%猪血粉，1%蛋白胨， 0.7%NaCl， 2%琼脂粉，调pH7.2。
3、 根据权利要求1或要求2所述的培养基可用于溶栓酶的筛选，其特征在于所述的溶栓酶包 括豆豉纤溶酶、纳豆激酶、葡激酶、链激酶、蚓激酶、尿激酶、人体纤溶酶原激活剂的任 何一种。
全文摘要
本发明提出一种简单快速的筛选溶栓酶方法。它是将传统的溶栓酶筛选培养基[2％纤维蛋白，1％蛋白胨，0.7％NaCl，2％琼脂粉，调pH 7.2]中的2％的纤维蛋白改为2％猪血粉。这样不仅筛选成本大大降低，而且筛选灵敏度也大为提高，还不用添加色素。上述筛选方法适用于各种溶栓酶的筛选。
文档编号C12Q1/37GK101451160SQ200810136609
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月24日 优先权日2008年12月24日
发明者陆云华 申请人:宜春学院