专利名称：草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中的基因克隆领域，尤其涉及草鱼胞质苹果酸脱氢酶基因的核苷酸及氨基酸序列。
背景技术：
苹果酸脱氢酶(MDH)广泛分布于生物体内，是一种活性非常强的酶，它催化草酰乙酸盐和苹果酸盐 的相互转化反应，与二核苷酸辅酶的氧化还原相关。草酰乙酸盐在许多代谢途径中都有重要作用，包括三 羧酸循环、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原异生等，并维持氧化还原平衡，还能促进胞质和亚细胞器代谢 物的交换。依生物体的功能不同、组织差异、细胞内定位的不同其表达种类不同，MDH具有多种同工酶 形式。胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)存在于细胞胞质内，担负着将NADH转入线粒体的重任，并且还对调 控三羧酸循环有作用，同时cMDH还是核酸通路(NACh)复合体的一个组成部分。但目前对cMDH的研 究相对较少，且主要的研究集中在植物上。硬骨鱼类通常会表达两种平行基因形式的胞质苹果酸脱氢酶 (cMDH-S和cMDH-L)，这与鸟类和哺乳动物类这些四足动物只表达一种是不同的，而cMDH-L与线粒 体苹果酸脱氢酶(mMDH)很相似。目前NCBI上只能査到较少种类鱼类的cMDH的全长cDNA，而在淡 水经济鲤科鱼类中克隆到苹果酸脱氢酶(MDH)尚属首次。
目前胞质苹果酸脱氢酶在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞 中的组成及基因结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能饲 料提供理论依据和新思路。
发明内容
本发明的目的是以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中胞质苹果酸脱氢酶EST序列为模版设计引物， 结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因的全表达序列。
上述目地是通过以下技术方案来实现的
取出新鲜草鱼肠道组织，采用TRIzol (Invitrogen Corporation) —步法提取总RNA,甲醛变性凝胶 电泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)检测总RNA质量。
本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)EST序列，经测序比对后发现该 EST序列具有胞质苹果酸脱氢酶cDNA的完整3'端，欠缺cDNA序列的5'端。利用cDNA末端快速扩增技术 (Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的基因的5端进行扩增。
根据己知EST序列设计外侧和内侧两个特异引物
5端特异引物1: 5'-AGAGCTTCCTGGCCTTGATGAC-3 ，
5端特异引物2: 5'-TGAGGAGTGATTTCCCCAGATAATC-3 ，
通用引物 Long:
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' Short: 5'—CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' 接头引物5'—AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3' 5端核心引物5'"(T)25V N-3' (N = A， C， G or T; V = A, G or C)
以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，上游引物使用通用引物， 下游引物使用5端特异引物1。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后用通用引物和5端特异引物2进行PCR验证。 将验证后的序列片段连接到pMD18-T质粒，转入f.Co/ZJM109菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测 序。扩增得到片段大小为681bp。再根据5端扩增片段和已知EST序列拼接所得结果设计引物对胞质苹果酸脱氢酶基因的开放阅读框进 行扩增，引物分别为
上游引物5 ，-CACATCTCAACCTGCACAATCAGAC-3 ， 下游引物5 ，-CAGAGGAGTAGACGCCCATAGACAC-3 ，
以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，使用上下游引物进行 PCR反应。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后连接到pMD18-T质粒，转入五.Coft'JM109菌株，经质粒酶 切验证后用M13通用引物测序。扩增得到片段大小为861bp。
利用vector NT对扩增所得开放阅读框序列和全cDNA序列进行比对，对全序列进行调整后获得了完 整的草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列，既目的基因。
草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因 结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能词料提供理论依据 和新思路。
具体实施例方式
下面通过以下具体实施方式
对本发明作进一步阐述，但本发明的内容完全不局限于此。
1. 总RNA的提取
挑选实验材料——健康雌性草鱼，体长570mm，约1.5冬龄(18个月)，2.4kg。取出新鲜草鱼肠道组 织，液氮迅速冷冻后保存于-80'C冰箱备用。采用TRIzol (Invitrogen Corporation) —步法提取总RNA，甲 醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)检测总RNA质量。
2. cDNA第一链的合成
取草鱼肠道细胞总RNA5ug与反转录引物(5端核心引物和接头引物)各lul(12uM)混合，70'C加 热2分钟，立即放置冰上，然后加入5 x buffer, 10mM dNTP混合液，20mM DTT， M-MLV反转录酶，反应体 系为10UL。反应过程为42。C l小时30分钟，之后加入90ul TE buffer (PH 8. 0) ， 72°C加热7分钟。最 后得到100ul草鱼肠道细胞cDNA模板，放入-20'C保存备用。
3. 引物设计依据和合成方法
在本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到含有胞质苹果酸脱氢酶EST序列的转化子，送交测序， 并将测序结果在GenBank中进行比对，比对结果显示该EST序列含有胞质苹果酸脱氢酶cDNA的完整3' 端，欠缺cDNA序列的5'端。以该EST序列为模版设计2个5端特异引物，其中引物1用于初步扩增胞质 苹果酸脱氢酶cDNA的5端序列，引物2用于对初步扩增序列进行验证。引物序列设计后送交Invitrogen Corporation进行合成。
5端特异引物1: 5'-AGAGCTTCCTGGCCTTGATGAC-3'
5端特异引物2: 5'-TGAGGAGTGATTTCCCCAGATAATC-3'
4. 草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因cDNA全序列的克隆
以草鱼肠道胞质苹果酸脱氢酶EST序列为模版设计的5端特异引物1和通用引物扩增片段约为681bp。 4.1用第一链cDNA末端快速扩增技术进行初步PCR扩增
以上述合成的第一链cDNA作为模板，根据已知EST序列设计特异性引物1，利用cDNA末端快速扩 增技术(RapidAmplifkationof cDNAends， RACE)对目的基因的5'末端进行扩增。
在5'RACE中，利用末端转移酶和接头引物在cDNA的5'末端加上CCC后，以加尾后的cDNA作为 模板，利用5端特异性引物l和通ffl引物进行PCR扩增，片段反应体系如下第一链cDNA模板1.5 uL，10xPCR反应缓冲液5uL， 25mmol/L MgCl2 3uL， 2.5 mmol/L dNTP 2uL， 10umoI/L5端特异引物1和通用 引物各luL， Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50uL。反应条件如下1个循环，94'C变性2min; 5个循环，94。C变性30s， 60。C退火30s， 72'C延伸2min; 5个循环，94。C变性30s， 57。C退火30s， 72°C 延伸2min; 25个循环，94。C变性30s， 54'C退火30s， 72。C延伸2min; 1个循环，72。C延伸10min; 4'C保 温。
所扩增的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，共得到3条清晰条带，大小分别为1000bp、 550bp、 500bp，将其分别从凝胶中纯化回收。
4.2用第一链cDNA末端快速扩增技术进行PCR验证扩增
分别以4.1中扩增得到的3个片段为模板，根据已知EST序列设计特异性引物2，利用cDNA末端快 速扩增技术(Rapid Amplification of cDNAends, RACE)对目的基因的5'末端进行验证扩增。
利用5端特异性引物1和通用引物进行PCR扩增，片段反应体系如下模板1.5 uL (分别以4.1中扩 增得到的3个片段为模板)，10xPCR反应缓冲液5uL， 25mmol/L MgCl2 3uL， 2.5 mmol/L dNTP 2uL， lOumol/L 5端特异引物2和通用引物各luL, Taq酶1.25U,用PCR水将反应体系补充至50uL。反应条件如下1 个循环，94'C变性2min; 5个循环，94'C变性30s， 59'C退火30s, 72'C延伸2min; 5个循环，94'C变性 30s， 56。C退火30s， 72。C延伸2min; 25个循环，94。C变性30s， 53。C退火30s， 72。C延伸2rain; 1个循环， 72'C延伸10min; 4'C保温。
所扩增的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，仅在以lOOObp片段为模板的反应体系中得到 大小为700bp左右的清晰条带，从凝胶中纯化回收该片段。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体 中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA,经EcoR I和Hind HI双酶切验证 后，将具有插入片段质粒DNA的转化子送交Invitrogen Corporation,利用M13通用引物进行双向测序。
4.3用第一链cDNA进行开放阅读框的PCR扩增
以上述合成的第一链cDNA作为模板，根据5端扩增片段和已知EST序列拼接所得结果设计上下游引 物对上述操作所的草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因的开放阅读框进行PCR扩增以验证所得序列的正 确性。
利用上下游引物进行PCR扩增，片段反应体系如下模板luL， 10xPCR反应缓冲液5uL， 25mmol/L MgCl23uL, 2.5 mmol/L dNTP 2uL， 10umol/L上游引物和下游引物各luL, Taq酶1.25U,用PCR水将反 应体系补充至50uL。反应条件如下1个循环，94'C变性2min; 30个循环，94'C变性30s, 57'C退火30s， 72。C延伸2min; 1个循环，72'C延伸10min; 4'C保温。
所扩增的PCR产物用l免的琼脂糖凝胶电泳进行检湖ij，得到大小为900bp左右的清晰条带，从凝胶中 纯化回收该片段。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞， 挑取阳性克隆，提取质粒DNA，经EcoRI和Hindm双酶切验证后，将具有插入片段质粒DNA的转化子 送交Invitrogen Corporation,利用M13通用引物进行双向测序。
将开放阅读框序列的测序结果与5端扩增片段和已知EST序列拼接所得序列进行比对，对全序列进行 调整后获得了完整的草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列，既目的基因。
5. 草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列的确定
将PCR反应所得5端扩增片段和开放阅读框片段分别克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109 感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA，经EcoR I和Hind III双酶切验证后，将具有插入片段质粒 DNA的转化子送交Invitrogen Corporation,利用M13通用引物进行双向测序。所得结果用vector NT 进行拼接，比对分析，获得 一 完整的cDNA序列。将该序列用BLAST软件 (http:〃ww.ncbi.nim.nih. gcw/blast)进行同源性测定，来确定为草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基 因同源序列。比对结果为<formula>formula see original document page 8</formula>
根据Ironl995年的报道，只要两个序列间用BLAST软件比对后E-Value值小于0.005，则两个序列之 间具有绝对的同源性，即证明序列为同一种基因序列。从比对结果看草鱼肠道目的基因序列BLAST比对 后，与其他物种的苹果酸脱氢酶基因的E值绝对小于0.005，所以证明所克隆的目的基因是苹果酸脱氢酶 基因的同源序列。
草鱼是我国特有鲤科大型经济鱼类，在本研究之前没有对其苹果酸脱氢酶的研究报道，也没有类似的 鲤科鱼类的苹果酸脱氢酶的研究报道。从草鱼胞质苹果酸脱氢酶与其它代表性物种的同源序列比对结果来 看，草鱼苹果酸脱氢酶的蛋白序列个与其他代表性动物的该酶相似度都极高，只在个别位点有特异性蛋白。 利用NCBI (/^p:/Avmv.wCW./iZ/ ."yi.gov)提供的蛋白序列保守区分析软件进行保守区分析，发现草鱼胞 质苹果酸脱氢酶具有典型的苹果酸脱氢酶功能区保守序列，包括一个NAD结合位点(NAD binding site), —个苹果酸结合位点(malate binding site)以及一个二聚化接触功能区(dimerization interface )。序列表
<110>通威股份有限公司
<120>草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列
<160>2
<210>1
<211>1391
<.212>RNA
<213>草鱼(CtewcpA。;ywgcwtora !'</e//us ) <220>
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<222> (1)…(62)
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<221>PolyAsite <222> (1350)... (1391) <220>
<221>PolyA signal <222>(1343)... (1349) <220>
<221>3，UTP
<222> (1062)... (1391)
<400>1
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LysValLeu Val Val 125
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Ala Pro Ser liePro Lys 145
Cys LeuThrArg Leu Asp 155
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Ga 1 d 1 u 1
A t- 3 、 3 L 权利要求
1、一种草鱼草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因，其特征在于具有以下RNA核苷酸及相应的氨基酸序列gctgagtggc agagcagcac atctttggcg cacatctcaa cctgcacaat cagacttgaa 60ac atg gcc gaa ccg atc cgt gtc ctg gtg act 92Met Ala Glu Pro Ile Arg Val Leu Val Thr 101 5 10ggc gca gcc gga cag atc gcc tat tct ctg 122Gly Ala Ala Gly Gln Ile Ala Tyr Ser Leu2011 1520ctc tac agc att gct aaa gga gat gtg ttc 152Leu Tyr Ser Ile Ala Lys Gly Asp Val Phe 3021 25 30ggc aag gac cag cca atc atc ttg gtg ctt 182Gly Lys Asp Gln Pro Ile Ile Leu Val Leu 4031 35 40ctg gac atc act ccc atg ctg cct gtg ctg 212Leu Asp Ile Thr Pro Met Leu Pro Val Leu 5041 45 50gat ggg gtc gtc atg gaa ctg cag gat tgt 242Asp Gly Val Val Met Glu Leu Gln Asp Cys 6051 55 60gct ctt cct ctt ctg agg gat gtg att cct 272Ala Leu Pro Leu Leu Arg Asp Val Ile Pro 7061 65 70act gat aag gtt gag gtg ggc ttc aag gac 302Thr Ala Lys Val Glu Val Gly Phe Lys Asp8071 75 80ctt gat gct gcc atc ttg gtg ggc tct atg 332Leu Asp Ala Ala Ile Leu Val Gly Ser Met 9081 85 90cca agg aaa gag ggc atg gag aga aag gac 362Pro Arg Lys Glu Gly Met Glu Arg Lys Asp 10091 95 100ctt ctg aag gcc aac gtg gcc att ttt aaa 392Leu Leu Lys Ala Asn Val Ala Ile Phe Lys110101105110acc caa ggt gaa gca ctg gag aag tac gcc 422Thr Gln Gly Glu Ala Leu Glu Lys Tyr Ala120111115120cag aag act gtc aag gtg cta gtt gtc ggg 452Gln Lys Thr Val Lys Val Leu Val Val Gly 130121125 130aat cca gcc aat acc aac tgt ttg atc gcc 482Asn Pro Ala Asn Thr Asn Cys Leu Ile Ala 140131 135140tcc aaa tct gct ccg tcc att cct aag gag 512Ser Lys Ser Ala Pro Ser Ile Pro Lys Glu 150141 145 150aac ttc tcc tgc ctg acc cgt ctg gac cat 542Asn Phe Ser Cys Leu Thr Arg Leu Asp His 160151 155 160aac agg gcc cgc tct cag gtg gcg atg cgt 572Asn Arg Ala Arg Ser Gln Val Ala Met Arg 170161 165 170gtt ggt gtg tcc tct gac aat gtg aag aat 602Val Gly Val Ser Ser Asp Asn Val Lys Asn 180171 175 180gtg att atc tgg gga aat cac tcc tca act 632Val Ile Ile Trp Gly Asn His Ser Ser Thr 190181 185 190cag tac cca gat gtg cac cac gct atc gtg 662Gln Tyr Pro Asp Val His His Ala Ile Val 200191 195 200aac cac cat ggg aag gag ttg gca gcc ttt 692Asn His His Gly Lys Glu Leu Ala Ala Phe 210201 205 210gac gcc gtg aat gat gaa agc tgg ctg aag 722Asp Ala Val Asn Asp Glu Ser Trp Leu Lys 220211 215 220ggc gac ttc atc tcc acg gtg cag cag aga 752Gly Asp Phe Ile Ser Thr Val Gln Gln Arg 230221 225 230ggt gca gct gtc atc aag gcc agg aag ctc 782Gly Ala Ala Val Ile Lys Ala Arg Lys Leu 240231 235 240tcc agc gca atg tct gct gcc aaa gcc atc 812Ser Ser Ala Met Ser Ala Ala Lys Ala Ile 250241 245 250tgt gac cac atg agg gac atc tgg ttc ggc 842Cys Asp His Met Arg Asp Ile Trp Phe Gly 260251 255 260act cct gat ggt gag tgg gtg tct atg ggc 872Thr Pro Asp Gly Glu Trp Val Ser Met Gly 270261 265 270gtc tac tcc tct ggt aat tcc tat gga gtt 902Val Tyr Ser Ser Gly Asn Ser Tyr Gly Val 280271 275 280cct gat gat ctc atg tac tcc ttc cct gtt 932Pro Asp Asp Leu Met Tyr Ser Phe Pro Val 290281 285 290aag att aag aac aag acc tgg aag gtg gtt 962Lys Ile Lys Asn Lys Thr Trp Lys Val Val 300291 295 300gac gga ctc tcc atc aac gat ttc tcc cgc 992Asp Gly Leu Ser Ile Asn Asp Phe Ser Arg 310301 305 310gct aag atg gac gcc acc tcc gct gag ctg 1022Ala Lys Met Asp Ala Thr Ser Ala Glu Leu 320311 315 320gta gag gag aga gac acg gca gtc acc ttc 1052Val Glu Glu Arg Asp Thr Ala Val Thr Phe 330321 325 330ctt gga gcg 1061Leu Gly Ala 333331 333tgactcgact ccacgacaac accgcagcag ttagaccctt caaagggccc aaatccccga 1121ctgtagaatt cacagctgac cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtggata ttcatgtatc 1181ttaacgtatg cgtgtgtgcg tgtgtaactt ctcaagaaac gtttgcaatg taacttactc 1241tgcttggagt gtccggggca acacctgaag gagaaccttt ccaattataa ccgttacgca 1301catggttgtc ctgaccaaaa tgatgatcat ctgtcataca acaataaaag tacatgggaa 1361aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactcga139全文摘要
本发明公开了一种草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶的基因，以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中胞质苹果酸脱氢酶EST序列为模版设计引物，结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因的全表达序列。对于研究草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因结构组成，探讨其在草鱼肠道代谢调控中的作用和功能区域位置，以及与其他物种的区别都提供了重要的理论依据。本发明对探索建立草鱼基因组计划与功能饲料产业化之间纽带的方法具有开创性作用。
文档编号C12N9/04GK101434961SQ200810147928
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者江 吴, 恒 徐, 朱文漓, 娟 王, 辜文博, 顾继锐 申请人:通威股份有限公司;四川大学