专利名称：腌制用壳聚糖粉末、使用其的腌制物及使用其制成的泡菜的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种腌制用壳聚糖粉末、使用该壳聚糖粉末的腌制物及使用该壳聚糖粉末制成的泡菜。
背景技术：
壳聚糖是将螃蟹、小龙虾、墨鱼及虾的外壳中含有的甲壳质脱乙酰化而制成的物质，是一种带有(+)电荷的动物性膳食纤维(dietary fiber)。壳聚糖的结构是根据脱乙酰度由N-乙酰-葡萄糖胺(甲壳质的单分子)与葡萄糖胺(壳聚糖的单分子)的共聚物构成。壳聚糖被认为可以使已老化的细胞活化而抑制衰老、加强免疫力而预防疾病、增强人体的自然治愈能力、调节生理节奏，但人们还没有完全探明其机理。目前已了解到的壳聚糖的功效包括抗癌作用、抗菌作用、免疫增强作用、肝功能增强作用、胆固醇抑制作用、增加肠内有益菌、抑制有害菌、调节血压、吸附并排出重金属与有害成份、抑制血糖值及活化细胞等。壳聚糖虽然具备了各种生理活性，但由于其分子量非常大而且人体内部没有可以分解壳聚糖的酶，因此其应用范围受到了很多限制，而且直接摄取的话，大部分壳聚糖无法被人体吸收，而被排出体外。
一般来说，作为甲壳类的雪蟹/红蟹类是庆尚北道清净海域的代表性特产物，其产量占全国生产量的30％。甲壳质及壳聚糖是一种年产量达一千亿吨的资源，其产量可与植物所生产的纤维素匹敌。壳聚糖主要是被作为凝集剂应用于废水处理或作为土壤改良剂应用于农业领域，近年来逐渐把应用范围扩展到了生理性合成洗涤剂、医药品、化妆品及食品等领域。然而高分子壳聚糖在中性pH条件下对水呈非溶性，虽然可以溶于低浓度有机酸溶液，但由于具有较强的涩味和苦味而较难应用于食品。壳聚糖产品的进口量以年增10％的速度稳定地生长，但国内生产却在2003年以后正在退潮。
作为韩国民族固有传统发酵食品的泡菜，是各种无机质与维生素的供应源，摄取后有助于肠道内有益细菌的增殖，是一种闻名于世的健康食品。泡菜是韩国人的日常饭桌上不可或缺的家常菜，通过在萝卜、白菜及黄瓜等材料上撒上食盐腌一段时间，添加辣椒、大蒜、葱、生姜、鱼露等作料并加以揉拌，随着生成乳酸而进行熟成过程，这样在低温发酵而制成。腌制泡菜是一种为了长时间储存蔬菜的手段，以前韩国人为了长时间储存泡菜而把装有泡菜的泡菜缸埋到地底下。然而近年来常常出现因为受到居住环境变化的影响而无法把泡菜缸埋到地底下的情形，而且即使在土里长时间储存泡菜，只要储存时间太长就会发出熟成泡菜特有的味道。因此人们积极地研究着既能维持泡菜固有口味，又能长时间储存的方法。作为这种研究中的一种，人们发现了将壳聚糖作为泡菜的天然添加剂来添加的方法。壳聚糖可以溶解于弱酸，分子内具有(+)电荷，尤其是被认为具有优异的抗菌性，因此作为天然保存剂被广泛地应用在一般食品。
作为利用壳聚糖提高泡菜保存性的现有技术，有大韩民国专利申请第10-1999-23848号及第10-1999-23849号“延迟酸败的改良泡菜的制备法”，第10-1998-20451号“延长保存性的泡菜的制备法”、大韩民国专利申请第10-1999-25417号“含有壳聚糖及矿物质的泡菜的制备法”、第10-2003-26731号“使用含壳聚糖黄土水性萃取液剂的泡菜制备法”、第10-2001-42866号“以神仙草为主要材料的泡菜制造方法″等。另外，作为在泡菜作料中含有壳聚糖的现有技术，有大韩民国专利申请第10-1994-34463号“速成泡菜内的天然作料组成物及其制造方法”、大韩民国专利申请第10-1997-24877号“甲壳质壳聚糖泡菜”等；作为把壳聚糖应用于已制成的泡菜本身的现有技术，有大韩民国专利申请第10-1997-81996号“泡菜的熟成延迟方法”、大韩民国专利申请第10-1996-33362号“延迟酸败的泡菜制造方法”、大韩民国专利申请第10-1997-66558号“泡菜鲜度维持方法”等。
如前所述，人们已经对如何提高泡菜的保存性、在泡菜作料中以及泡菜本身适用壳聚糖的技术进行了多样化的研究与开发工作，但是迄今为止还没有人针对以获得最佳条件为目的而把壳聚糖加以规格化并应用于泡菜的技术进行任何研究与开发工作。
因此，如果能利用规格化的壳聚糖针对特定食品制作定制型壳聚糖，不仅可以延长食品保存期限、减少食品废弃物并防止食中毒等而对国民健康作出贡献，还能凭借着生产添加有壳聚糖的功能性泡菜而在庞大的泡菜市场确保竞争力。
发明内容
发明要解决的技术问题 本发明人们在研究如何把具有各种生理活性的壳聚糖加以规格化后应用到泡菜的课题时，根据脱乙酰度与粘度的差异而对壳聚糖进行了规格化，并得知利用规格化壳聚糖制成的泡菜具备了优于壳聚糖本身的抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性，而且储存稳定性与质构也非常良好，从而完成了本发明。
解决问题的技术方案 本发明的目的是提供一种根据脱乙酰度与粘度的差异而加以规格化的腌制用壳聚糖粉末、使用该壳聚糖粉末的腌制物及使用该壳聚糖粉末制成的泡菜。
图1是水溶性壳聚糖对于DPPH自由基的抗氧化效果图； 图2是非溶性壳聚糖对于DPPH自由基的抗氧化效果图； 图3是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TA100被直接突变源MNNG(0.4μg/plate)诱发突变时，含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物对其的抗突变效应图； 图4是Salmonella typhimurium TA100被间接突变源AFB1(0.5μg/plate)诱发突变时，含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物对其的抗突变效应图； 图5是含壳聚糖泡菜(实施例2)在15℃温度下发酵时明串珠菌属种(Leuconostoc sp.)及乳杆菌属种(Lactobacillus sp.)数量的变化图； 图6是使用在含壳聚糖的腌制溶液中腌制的白菜来制成的泡菜(实施例3)在4℃温度下发酵时的Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.数量变化图； 图7是将食盐腌制白菜在含壳聚糖的涮洗液中涮洗后制成的泡菜(实施例4)在4℃温度下发酵时的Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.数量变化图； 图8是使用含壳聚糖作料制成的泡菜(实施例5)在4℃温度下发酵时的Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.数量变化图。
具体实施例方式 本发明提供一种具备了优异的抗菌、抗氧化、抗突变及抗癌活性的腌制用壳聚糖粉末，上述腌制用壳聚糖粉末是从具有50到90％的脱乙酰度与1到10cP粘度的水溶性壳聚糖、具有60到100％的脱乙酰度与8到80cP粘度的非溶性壳聚糖、以及食品学允许使用的盐所组成的组中选定的任一个或一个以上的组合。
上述水溶性壳聚糖或非溶性壳聚糖可以以食品学允许的盐的形态来使用，作为盐，通过食品学允许使用的游离酸(free acid)来形成的酸加成盐是适宜的。游离酸可以使用无机酸与有机酸，无机酸优选使用盐酸，有机酸优选使用醋酸、柠檬酸及乳酸等。
上述腌制用壳聚糖粉末的特征在于从脱乙酰度与粘度不同的12种水溶性壳聚糖(S-1～S12)与11种非溶性壳聚糖(NS-1～NS11)中筛选出抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性优异的水溶性/非溶性壳聚糖，根据脱乙酰度与粘度加以规格化。上述壳聚糖中5种水溶性壳聚糖(S-2、S-9、S-10、S-11、S-12)与6种非溶性壳聚糖(NS-2、NS-5、NS-8、NS-9、NS-10、NS-11)对各食品组的标准菌株(type strain)显示出具备优异的抗菌活性，S-7、S-10及NS-8显示出具备优异的抗氧化活性与抗突变效应，S-10与NS-8则显示出优异的抗癌效果。从而，根据本发明的壳聚糖是筛选出具有50到90％的脱乙酰度与1到10cP粘度的水溶性壳聚糖、具有60到100％的脱乙酰度与8到80cP粘度的非溶性壳聚糖后，根据脱乙酰度与粘度而加以规格化。其中，具有90％的脱乙酰度与3cP的粘度的水溶性壳聚糖(S-10)、具有95％的脱乙酰度与22cP的粘度的非溶性壳聚糖(NS-8)所显示出的抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性最为优异。
而且，本发明提供一种含有根据脱乙酰度与粘度的差异而加以规格化的腌制用壳聚糖粉末的腌制溶液。
上述腌制溶液优选含有相对于腌制溶液总重量为0.2到1.0重量％的壳聚糖粉末。如果壳聚糖粉末用量低于0.2重量％，则壳聚糖粉末的含量太少而无法改善腌制物的储存性与质构；如果用量超过1.0重量％，也无法进一步改善腌制物的储存性与质构。
而且，本发明还提供一种利用上述腌制溶液腌蔬菜类而制成的腌制物。上述腌制物并不限于蔬菜类，而是包括了将水果、肉类及鱼贝类等腌到腌制溶液中制成的物质的统称，上述蔬菜类包括白菜、小萝卜、萝卜、黄瓜、洋葱、大蒜及辣椒等。优选地，上述腌制物中含浸有相对于腌制物总重量为0.05到0.25重量％的壳聚糖。
本发明还提供一种利用上述腌制物制成的泡菜。
本发明还提供一种含有相对于泡菜总重量为0.01到1.5重量％的上述腌制用壳聚糖粉末的泡菜。
本发明的含壳聚糖粉末的泡菜可以利用标准化的泡菜食谱制作。
使用标准化方法制成的含壳聚糖泡菜具备了优于壳聚糖本身的抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性，壳聚糖可以使泡菜缓慢地发酵而延长了到达适熟期的时间，从而使储存稳定性优异。而且，含壳聚糖泡菜可以抑制Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.乳酸菌的生长速度，所以储存性与保存性优异。而且，植物性纤维素是负(-)电荷的膳食纤维，壳聚糖则是正(+)电荷的膳食纤维，因此腌制物中含浸混入有适量的壳聚糖的话，就会形成阳性膳食纤维，使泡菜的植物性纤维素的结构变得致密，从而改善泡菜的质构并完善膳食纤维本身的功能性。
下面结合实施例对本发明做进一步说明。但下述实施例的作用仅是为了更加容易地理解本发明，因此本发明的内容不受下述实施例的限制。
实施例1壳聚糖的制备 1-1.壳聚糖的制备 把大韩民国东海产的红蟹的蟹壳加以干燥后放进5％NaOH水溶液中，在100℃的温度下萃取5小时而得到脱蛋白的蟹壳。把上述脱蛋白的蟹壳放进5％HCl水溶液中，在常温下萃取5小时进行脱钙化而得到甲壳质。然后在反应槽中装入45％NaOH水溶液，在此沉积上述所得甲壳质后，一边改变温度(80℃、90℃、100℃、110℃)与时间(5、10、15、20、25、30、35、40、50小时)，一边通过脱乙酰反应来制作壳聚糖。表1是所制成的上述壳聚糖的脱乙酰度与粘度的测定结果。脱乙酰度是利用胶体滴定法(pvsk titration method)测定，粘度是把壳聚糖溶解在醋酸制成0.5％的含壳聚糖醋酸溶液，在20℃的恒温槽中保管2小时后在恒温下测定。
表1
如表1所示，壳聚糖的脱乙酰度与粘度随着45％NaOH水溶液的温度与时间而变化，在较高温度下长时间反应的话，虽然脱乙酰度提高但粘度降低，缩短反应时间的话虽然能提高粘度但脱乙酰度会降低。而且可以知道在较低温度进行反应的话，虽然脱乙酰化时间较长但粘度却缓慢地下降。因此决定壳聚糖的规格就使用脱乙酰度与粘度来表示。
1-2.规格化壳聚糖的制备 为了把上述步骤1-1制成的壳聚糖加以规格化，准备了如表2所示具有不同脱乙酰度与粘度的12种水溶性壳聚糖(S-1～S-12)与11种非溶性壳聚糖(NS-1～NS-11)。所有的壳聚糖被放进塑料容器内并且在室温保管并使用，并且按照下述实验例1～4的方法测定了水溶性/非溶性壳聚糖的抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性。在上述23种水溶性/非溶性壳聚糖中，筛选出了抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性优异的壳聚糖而加以规格化。
表2
针对水溶性/非溶性壳聚糖进行的抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性的测定结果为，5种水溶性壳聚糖(S-2、S-9、S-10、S-11、S-12)与6种非溶性壳聚糖(NS-2、NS-5、NS-8、NS-9、NS-10、NS-11)对各食品组的标准菌株具有良好的抗菌活性，S-7、S-10及NS-8具有良好的抗氧化活性与抗突变效应，S-10与NS-8具有良好的抗癌效果。因此，本发明的壳聚糖选择具有50到90％的脱乙酰度与1到10cP粘度的水溶性壳聚糖、具有60到100％的脱乙酰度与8到80cP粘度的非溶性壳聚糖后根据脱乙酰度与粘度进行了规格化。
实施例2含壳聚糖泡菜的制备 2-1.壳聚糖材料 把水溶性/非溶性壳聚糖中的抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性最好的水溶性壳聚糖S-10(脱乙酰度90％，粘度3cP)与非溶性壳聚糖NS-8(脱乙酰度95％，粘度22cP)保管在4℃温度下并使用。
2-2.泡菜材料 白菜购自釜山市的釜田市场，鱼露使用清净鳀鱼露(大象有限公司)，辣椒面是从英阳农协的清洁辣椒面加工厂购买使用。萝卜、葱、大蒜、生姜购自釜山市的釜田市场。糖使用白砂糖，食盐使用天日盐(Gosen有限公司)。
2-3.泡菜的制备 泡菜使用腌制白菜100重量份、辣椒面3.5重量份、大蒜1.4重量份、生姜0.6重量份、鱼露2.2重量份、葱2.0重量份、萝卜13.0重量份、糖1.0重量份的比例加以混合后使用标准化的泡菜食谱进行制造。
也就是说，用天日盐制备10％腌制溶液后，放进白菜进行10小时盐腌制。用自来水洗腌制白菜3次并脱水3小时。把相对于腌制白菜100重量份分别为1重量份与0.5重量份的水溶性壳聚糖(S-10)粉末与非溶性壳聚糖(NS-8)粉末作为副材料混入到作料中揉拌。将萝卜与葱切丝，把用水调好的辣椒面放入萝卜丝里揉拌，然后均匀地混合鳀鱼露、大蒜及生姜，盐度则各自利用食盐加以调节，来制成泡菜。
实施例3使用含壳聚糖腌制溶液腌制的白菜的泡菜制备法 把非溶性壳聚糖NS-8溶入醋酸制备2％的壳聚糖溶液。使用上述壳聚糖溶液并且加水使壳聚糖含量相对于腌制溶液总重量成为0.05、0.15、0.3及0.5％，然后在其中添加天日盐制成10％腌制溶液。把白菜放进上述含壳聚糖腌制溶液里，进行10小时盐腌制。用自来水洗腌制白菜3次并脱水3小时，将萝卜与葱切丝，把用水调好的辣椒面放入萝卜丝里揉拌，然后均匀地混合鳀鱼露、大蒜及生姜，盐度则各自利用食盐加以调节，来制成泡菜。
实施例4将用食盐腌制后的白菜用含壳聚糖涮洗液涮洗后使用的泡菜的制备法 把非溶性壳聚糖NS-8溶解于醋酸制备2％的壳聚糖溶液。使用上述壳聚糖溶液并且加水使壳聚糖含量相对于涮洗液总重量成为0.1、0.2、0.3及0.5％，来制成含壳聚糖的涮洗液。用天日盐制备10％腌制溶液后，放进白菜进行10小时盐腌制。将腌制白菜用自来水洗2次，最终涮洗过程中在上述含壳聚糖涮洗液中涮洗3分钟后，脱水3小时，然后将萝卜与葱切丝，把用水调好的辣椒面放入萝卜丝里揉拌，然后均匀地混合鳀鱼露、大蒜及生姜，盐度则各自利用食盐加以调节，来制成泡菜。
实施例5使用含壳聚糖作料的泡菜制备法 用天日盐制备10％腌制溶液后，放进白菜进行10小时盐腌制。用自来水洗腌制白菜3次并脱水3小时。按照1∶1的重量比混合水溶性壳聚糖(S-10)粉末与非溶性壳聚糖(NS-8)粉末后，使用相对于腌制白菜100重量份分别为0.1、0.25、0.5及1.5重量份的壳聚糖作为副材料混入作料并揉拌。将萝卜与葱切丝，把用水调好的辣椒面放入萝卜丝里揉拌，然后均匀地混合鳀鱼露、大蒜及生姜，盐度则各自利用食盐加以调节，来制成泡菜。
实验例1抗菌活性的测定 为了确认水溶性/非溶性壳聚糖的抗菌活性，进行了下述实验。
1-1.菌株及培养基 作为用来研究抗菌活性的病原性微生物及腐败性微生物，使用了9种革兰氏阴性菌与6种革兰氏阳性菌，详细内容如表3。单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 19115、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29737、枯草杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC 21366、嗜水产气单胞菌嗜水亚种(Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila)ATCC 7966、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorecens)ATCC 21541、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)ATCC 6059、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)ATCC 15390、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)ATCC 25601、植物乳杆菌(Lactobacillus plantrarum)ATCC 8014、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)ATCC 990、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC 8739、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802及创伤弧菌(Vibrio vulnificus)ATCC 27562取自韩国微生物保存中心，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 13311取自基因银行。
培养基使用的是胰酪胨大豆肉汤(TSB，Difco，USA)、脑心浸液(Brain HartInfusion)(BHI，Difco，USA)及MRS肉汤(Difco，USA)，作为用来研究壳聚糖的抗菌活性的培养基则使用了水解酪蛋白胨肉汤(Muller Hinton broth)(MHB，Merck，Germany)。
表3
1-2.各壳聚糖种类的抗菌活性 为了在本实验中使用，把水溶性壳聚糖完全溶解到蒸馏水中、把非溶性壳聚糖完全溶解到1％(v/v)醋酸中，制成1％(w/v)浓度的壳聚糖储存溶液。
关于壳聚糖的抗菌活性研究，是采用纸片法(paper disc method)确认是否形成了针对标准菌株的抑菌圈(clear zone)，所使用的培养基是在MHA中添加壳聚糖储存溶液使最终浓度成为0.1％来制成的。此时，由于非溶性壳聚糖中的NS-1、NS-3及NS-4壳聚糖不能溶解而没有应用于以后的实验。本实验所使用的含壳聚糖培养基的pH是全部使用1N HCl与1N NaOH确保在pH5.9。
对于标准菌株的0.1％水溶性壳聚糖的抗菌活性如表4所示，对于标准菌株的0.1％非溶性壳聚糖的抗菌活性如表5所示。
表4
表5
如表4所示，0.1％水溶性壳聚糖的抗菌活性根据菌株而互不相同。S-12对于15种标准菌株中的13种菌株表现出抗菌活性而在15种壳聚糖中具有最广的抗菌谱，S-10与S-11对9种菌株呈现出抗菌活性，S-2与S-9对8种菌株呈现出抗菌活性，S-3与S-4对7种菌株呈现出抗菌活性，S-1与S-7对6种菌株呈现出抗菌活性，S-8对5种菌株呈现出抗菌活性，S-5与S-6对4种菌株呈现出抗菌活性，总而言之，根据壳聚糖的种类其抗菌活性也呈现出了多样化的表现。Proteus vulgaris被所有的水溶性壳聚糖抑制了生长，Aeromonashydrophila、Salmonella typhimurium及Erwinia carotovora也被大部分的水溶性壳聚糖抑制了生长。Bacillus cereus也被S-8以外的所有壳聚糖抑制了生长。
如表5所示，0.1％非溶性壳聚糖对于所有的标准菌株呈现了抗菌活性。而且同一浓度下的壳聚糖的抗菌活性是，非溶性壳聚糖显著高于水溶性壳聚糖。
1-3.壳聚糖对于病原性微生物及腐败微生物的抑制生长活性 选出水溶性壳聚糖中显示抗菌活性较高的S-2、S-9、S-10、S-11、S-12与非溶性壳聚糖中显示抗菌活性较高的NS-2、NS-5、NS-8、NS-9、NS-10、NS-11，针对15种标准菌株研究了抑制生长活性。
为了调查所选出的壳聚糖的抗菌力，把1％(w/v)壳聚糖储存溶液添加到MHB中使水溶性壳聚糖的最终浓度成为0.1％，使非溶性壳聚糖的最终浓度成为0.1％及0.05％。病原性微生物标准菌株在TSB进行两次继代培养，乳酸菌标准菌株在MRS肉汤进行两次继代培养，把上述两种标准菌株分别以0.05ml的量接种到含壳聚糖的培养基里，在37℃的温度下震荡培养24小时后利用蛋白胨水适当地稀释后测定生菌数(log No.CFU/ml)。乳酸菌利用MRS琼脂，Erwinia carotovora subsp.Carotovora利用BHI琼脂，其余的腐败微生物与病原性微生物则利用TSA，根据倾注平板法(pour plate method)测定生菌数。
0.1％水溶性壳聚糖对标准菌株的抑制生长活性如表6所示，0.1％非溶性壳聚糖对标准菌株的抑制生长活性如表7所示，0.05％非溶性壳聚糖对标准菌株的抑制生长活性如表8所示。
表6
表7
表8
如表6所示，A.hydrophila在S-11与S-12壳聚糖添加组中没有观察到其生长，其他3种壳聚糖和对照组相比大约抑制了4-5对数周期(log cycle)左右的生长。选出的壳聚糖对E.carotovora呈现出较强的抗菌活性，尤其是在S-2、S-10及S-11中根本没有观察到生长，S-9及S-12中只观察到大约101CFU/ml的菌数，与对照组相比大约抑制了7对数周期左右。P.fluorecens，V.parahaemolyticus及V.vulnificus在对照组中被观察到108CFU/ml的菌数，在选出的壳聚糖中观察到107CFU/ml的菌数，显示出比对照组大约低l对数周期左右的菌数，显示出非常低的由壳聚糖引起的抑制生育效果。B.subtilis在除了S-9以外的其余壳聚糖中没有观察到菌的生长，在S-9中也只观察到101CFU/ml以下的菌数。B.cereus在S-9、S-10及S-12中也只观察到101CFU/ml以下的菌数，在S-2与S-11中则没有观察到菌生长。乳酸菌株L.curvatus在选出的一切壳聚糖中都没有观察到其生长，L plantarum则在S-11以外的一切壳聚糖中没有观察到其生长，可知所选出的壳聚糖对乳酸菌株具有较强的抑制生长活性。L.monocytogenes及S.aureus虽然在S-12中没有观察到菌生长，但在其余壳聚糖观察到107-108CFU/ml，而显示出了近似于对照组的菌生长，是6种革兰氏阳性菌中壳聚糖的抑制生长率最低的一种。如前所述，水溶性壳聚糖对革兰氏阳性菌的抗菌活性比革兰氏阴性菌高，水溶性壳聚糖中的S-12壳聚糖对标准菌株呈现出广的抗菌活性。
如表7所示，A.hydrophila在对照组的观察值为108CFU/ml，在NS-11的观察值为105CFU/ml，在NS-2的观察值为104CFU/ml，与对照组相比抑制了4-5对数周期左右的生长，其余壳聚糖的观察值为102-103CFU/ml左右的菌数，抑制了5-6对数周期左右的菌生长。P.vulgaris与E.carotovora培养24小时后在NS-10中观察到102CFU/ml的菌生长，在NS-10壳聚糖以外的其余壳聚糖中没有观察到菌生长。V.vulificus在NS-5中观察到102CFU/ml的菌生长，在其他壳聚糖中没有观察到菌生长。L.monocytogenes、S.aureus、P.fluorecens、S.marcescens、E.coli、V.parahaemolyticus、B.subtilis、B.cereus、L.curvatus及L.plantarum培养24小时后在所有的壳聚糖中没有观察到菌生长。如前所述，非溶性壳聚糖对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌都呈现出了较强的抗菌活性，尤其是对于革兰氏阳性菌的抗菌活性更高。
A.hydrophila在水溶性壳聚糖S-11与S-12中没有观察到菌生长，呈现出优于非溶性壳聚糖的抗菌活性，但本实验的结果是，从整体上讲在同一浓度下非溶性壳聚糖要比水溶性壳聚糖抗菌谱更广，抑制菌生长能力也更高。
非溶性壳聚糖在0.1％浓度下呈现出较强的抗菌活性，但是没有随着壳聚糖的种类不同而出现抗菌活性差异，标准菌株都被6种壳聚糖抑制了生长，没有随着壳聚糖的种类不同而出现微生物的选择性抗菌活性差异。
如表8所示，S.typhymurium在NS-2、NS-5及NS-8中培养24小时后观察到近似于对照组的108CFU/ml菌数，在NS-11观察到105CFU/ml的菌生长，其余壳聚糖中没有观察到菌生长。S.marcescens在培养24小时后在所有的壳聚糖中观察到101-102CFU/ml的菌数，与对照组相比抑制了大约6-7对数周期左右的生长，但没有观察到因壳聚糖种类而带来的生长抑制度的差异。A.hydrophila也和S.marcescens一样没有随着壳聚糖的种类不同而出现生长抑制度的差异，但相比对照组大约减少了4对数周期左右的菌数，不受壳聚糖种类的影响而全部呈现出较高的生长抑制度。革兰氏阳性菌中的L.moncytogenes与S.aureus在N-2中，B.cereus在N-9与N-10的壳聚糖中分别出现了101CFU/ml以下的菌生长，在其他壳聚糖中则没有观察到菌生长。L.curvatus出现了101CFU/ml以下或101CFU/ml左右的菌生长，L.plantarum在NS-11以外的其余壳聚糖中出现了101-103CFU/ml的菌生长，虽然与对照组相比显著地抑制了菌生长，但乳酸菌株的情况，显示出被壳聚糖抑制生长的效果多少要低于其他革兰氏阳性菌的倾向。0.5％非溶性壳聚糖对标准菌株的抑制生长效果以NS-11最高，其次为NS-9。非溶性壳聚糖对标准菌株的抑制生长效果是，革兰氏阳性菌显示出高于革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌的情况没有因为壳聚糖种类不同而出现抑制生长效果上的差异，但革兰氏阴性菌的情况则随着壳聚糖的脱乙酰度上升而呈现出更高的抑制生长效果。
1-4.对于病原性微生物及腐败微生物的最低抑菌浓度(Minimum inhibitorconcentration；MIC) 选出水溶性壳聚糖中抗菌活性较高的S-2、S-9、S-10、S-11、S-12与非溶性壳聚糖中抗菌活性较高的NS-2、NS-5、NS-8、NS-9、NS-10、NS-11后，针对15种标准菌株测定了最低抑菌浓度。
为了测定水溶性壳聚糖与非溶性壳聚糖对标准菌株的最低抑菌浓度，根据琼脂扩散法(agar diffusion method)，在适合标准菌株生长的各温度下培养72小时后测定最低抑菌浓度。
水溶性壳聚糖的MIC测定结果如表9所示，非溶性壳聚糖的MIC测定结果如表10所示。另外，针对各食品组的高抗菌活性度壳聚糖规格组如表11所示。
表9
表10
表11
如表9所示，水溶性壳聚糖对于标准菌株的MIC范围是0.05-0.8％、＞0.8％，乳酸菌株的MIC则低于其他试验菌株。L.curvatus在S-2与S-11出现了0.05％的MIC，在其余壳聚糖中出现了0.08％的MIC。L.plantarum在S-10中出现了最高的MIC即0.1％，S-12为0.08％，S-2、S-9及S-11出现了0.05％的MIC。B.cereus及B.subtilis的MIC是0.1-0.3％，MIC虽然根据壳聚糖种类的不同而出现了差异，但B.subtilis的MIC稍低于B.cereus的MIC。E.carotovora在S-11与S-12中的MIC为0.08％，其MIC比其他壳聚糖低了很多，E.carotovora的MIC在革兰氏阴性菌中最低。
非溶性壳聚糖对于标准菌株的MIC范围如表10所示，A.hydrophila在NS-2与NS-5，P、vulgaris在NS-2、E.coli在NS-5、Sal.typhimurium在NS-2、NS-5、NS-9及NS-11分别表现出＞0.1％的MIC，其余壳聚糖的MIC范围是0.03-0.1％，其MIC值远低于水溶性壳聚糖。革兰氏阳性菌的MIC范围是0.03-0.08％，非溶性壳聚糖对于标准菌株大部分表现出0.05％的MIC。革兰氏阴性菌的MIC范围是0.05-1％或＞1％，其MIC值比革兰氏阳性菌广，非溶性壳聚糖对于革兰氏阴性菌大部分表现出0.08％的MIC，非溶性壳聚糖的MIC也是革兰氏阳性菌低于革兰氏阴性菌。
如表11所示，5种水溶性壳聚糖(S-2、S-9、S-10、S-11、S-12)与6种非溶性壳聚糖(NS-2、NS-5、NS-8、NS-9、NS-10、NS-11)对于各食品组的标准菌株呈现出优异的抗菌活性，所以可以延长食品保存期，并有效地防止鱼贝类、肉类及蔬菜类所引起的腐败与食中毒现象。
从上述结果得知壳聚糖对于标准菌株的抗菌活性具有下列特征，水溶性壳聚糖在脱乙酰度达到60％以上时呈现出非常优异的抗菌活性，非溶性壳聚糖则在脱乙酰度达到89％以上时呈现出非常优异的抗菌活性。而且，所选定壳聚糖对于标准菌株的抑制生长活性与最低抑菌浓度是，非溶性壳聚糖优于水溶性壳聚糖，对于革兰氏阳性菌的效果优于革兰氏阴性菌。
实验例2抗氧化活性的测定 为了确认水溶性/非溶性壳聚糖的抗氧化活性，进行了下述实验。
2-1.DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼)清除效果 利用Blois等的方法测定水溶性/非溶性壳聚糖对于DPPH的供电子能力(electron donating ability)。把利用甲醇稀释后的水溶性/非溶性壳聚糖(1mg/ml，0.5mg/ml)100μl倒入96孔板后，添加60μm DPPH试剂100μl，在室温静置30分钟后在540nm测定吸光度。
水溶性壳聚糖对DPPH自由基的抗氧化效果如图1所示，非溶性壳聚糖对DPPH自由基的抗氧化效果如图2所示。
如图1及图2所示，水溶性壳聚糖S-9与S-10在1mg/ml的浓度下分别具有79％与74％的清除自由基能力，在低浓度的0.5mg/ml浓度下也分别具有77％与72％的高抗氧化活性。可见上述两个试样之间的抗氧化活性并没有随着浓度不同而出现较大的差异。然而，S-4的试样虽然在1mg/ml的浓度下具有83％的活性，但在0.5mg/ml的浓度下仅具有48％的活性。由上述结果可知，水溶性壳聚糖的抗氧化活性随着浓度不同而出现较大的变化。与此相反的是，非溶性壳聚糖的抗氧化活性不太受浓度的影响而维持40～50％的抗氧化活性。
2-2.在细胞(cellular)系统进行的抗氧化实验 1)细胞种类及试药 LLC-PK1(porcine renal epithelial cell)购自ATCC(Solon，Ohio，USA)，用于培养的DMEM(Dulbecco′s modified Eagal medium)与FBS(fetal bovine serum)购自Invitogen CO.(Grand Island，NY)。用于诱导氧化应激的SNP使用Wako(Tokyo，Japan)公司的产品，SIN-1(3-morpholinosydnonimine；3-吗啉代斯德酮亚胺)、AAPH[2，2′-Azobis(2-aminopropane)dihydrochloride；2，2′-偶氮双(2-氨基丙烷)二氢氯化物]、焦棓酸(pyrogallol)及MTT(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H tetrazolium bromide；3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H四唑溴化物)则使用了Sigma Chemical Co.(USA)公司产品。
2)细胞培养 利用含有100units/ml的青霉素-链霉素(penicilin-streptomycin)与5％FBS的DMEM在37℃、5％CO2培养基培养LLC-PK1细胞。培养出来的细胞在一星期内重新供应2～3次，培养6～7日左右时利用磷酸盐缓冲盐水(phosphate bufferedsaline；PBS)进行第一次洗涤后，利用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA将附着的细胞分离进行离心分离后，把堆积的细胞放进培养基里，使用吸液管(pipet)加以混合而使细胞均匀地分散，每隔6～7日进行一次继代培养而应用到实验。继代培养时记录各传代次数(passage number)，当传代次数超过10次以上时培养出新的细胞进行实验。
3)细胞生存 细胞达到集合(confluence)状态后，在96孔板上以每孔1×104cells/ml的方式植栽培养2小时后，为了诱发氧化应激而添加作为过氧基(LOO-)、ONOO-、NO、O2-的供体的AAPH(10mM)、SIN-1(1mM)、SNP(1.2mM)及焦棓酸(1.2mM)培养24小时。诱发氧化应激后按照各浓度(50、100、500、1000μg/ml)处理S-10与NS-8培养24小时，然后把1mg/ml的MTT溶液注入各孔，在37℃的温度下重新培养4小时，把上述过程中生成的甲瓒结晶溶解到二甲基亚砜(DMSO)，然后在540nm测定吸光度(Mosmann，1983)。
对于经过AAPH处理的LLC-PK1细胞的水溶性壳聚糖(S-10)与非溶性壳聚糖(NS-8)在各浓度下的抗氧化活性如表12所示；对于经过SIN-1处理的LLC-PK1细胞的水溶性壳聚糖(S-10)与非溶性壳聚糖(NS-8)在各浓度下的抗氧化活性如表13所示。
表12
表13
如表12所示，对于经过AAPH处理的LLC-PK1细胞的、通过筛选过程选出的溶解到PBS的水溶性壳聚糖(S-10)与溶解到1％醋酸的非溶性壳聚糖(NS-8)在各浓度下的抗氧化活性表现如下只经过AAPH处理的对照组的细胞生存率为23.6％，但按照各浓度处理了S-10与NS-8后的细胞生存率呈现出根据浓度而上升的趋势，水溶性壳聚糖在1000μg/ml下呈现了67.1％的细胞生存率，与对照组相比有所增加。水溶性/非溶性壳聚糖有效地改善了凭借AAPH的LLC-PK1细胞的氧化应激，尤其是水溶性壳聚糖的抗氧化活性更优于非溶性壳聚糖。
如表13所示，仅仅处理了SIN-1的对照组由于受到氧化应激破坏细胞的影响而使细胞生存率减少到20.4％，但按照各浓度处理了S-10与NS-8壳聚糖之后的细胞生存率则随着浓度而增加，并且在1000μg/ml下分别得到了72.9％与64.2％的细胞生存率，这应该是因为凭借对于ONOO-的直接清除能力而改善了氧化应激。
实验例3抗突变效应的测定 为了确认水溶性/非溶性壳聚糖及含壳聚糖泡菜的抗突变效应，进行了下述实验。
1-1.试药及菌株 D-生物素、L-组氨酸·HCl(一水合物)、D-葡萄糖-6-磷酸盐(一钠盐)及NADP(钠盐)购自Sigma Chemical Co.(USA)，细菌营养培养基(经过脱水)与Bitek琼脂购自Difco实验室(USA)。另外，作为突变诱发源，则向AldrichChemical Co.(USA)采购了作为直接突变源的MNNG(4-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine；4-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)后溶解于经过灭菌处理的蒸馏水中应用于实验，从Sigma Chemical Co.(St.Lous，MO，USA)采购了作为间接突变源的AFB1(黄曲霉毒素B1)后溶解于DMSO。
实验所使用的菌株Salmonella typhimurium TA100由美国加州大学的Ames，B.N.博士提供。这些菌株在实验马上要开始前先确认组氨酸需求性、深粗型(rfa)突变、uvrB突变及R因子等遗传性质后再使用。
泡菜试料使用对上述实施例2中制成的含壳聚糖泡菜的初始泡菜和适熟期泡菜(pH4.3)，利用榨汁机(NUC，韩国)进行榨汁而制成的汁液试料与甲醇萃取物。汁液试料的制备方法为，收集汁液后在4℃温度与9000rpm的转速下离心分离15分钟后采集上清液，然后使用微孔滤器(milipore filter；0.20μm)过滤除菌后作为试料使用。甲醇萃取物的制备方法为，收集初始壳聚糖泡菜及发酵到pH4.3适熟期的壳聚糖泡菜后进行冻结干燥处理并磨碎试料制成粉末，把20倍(w/v)的甲醇添加到粉末试料后进行12小时的搅拌作业两次，加以过滤后，利用旋转式真空浓缩器浓缩成甲醇萃取物。萃取物是用DMSO稀释后进行实验。
1-2.对于直接突变源(MNNG)的抗突变效应 把0.5ml的磷酸缓冲液(直接突变源)、培养了一个晚上的菌株(1～2×109cells/mi)0.1ml、稀释试料50μl及突变诱发物质50μl倒入冰池里的带盖试管(cap tube)后轻轻地涡旋混匀，在37℃的温度下预培养30分钟。把45℃的顶层琼脂(组氨酸/生物素溶液)2ml倒入预培养的各管(tube)并涡旋混匀3秒钟后涂抹在最小化葡萄糖琼脂平板(minimal glucose agar plate)上，在37℃的温度下培养48小时后计数回复突变体(revertant)。突变抑制率(inhibition rate)则使用数学式1计算。
Salmonella typhimurium TA 100被直接突变源MNNG(0.4μg/plate)诱发突变时，水溶性壳聚糖及非溶性壳聚糖的抗突变效应分别如表14及表15所示，含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物的抗突变效应分别如表16及图3所示。
数学式1 抑制率(％)＝[(a-b)/(a-c)]×100 ※a由突变源诱导的回复突变数； b处理了试料时的回复突变数； c没有突变源与试料时的自然回复突变数。
表14
※每板的自然回复突变数47±9 表15
※每板的自然回复突变数47±9 表16
※每板的自然回复突变数44±6 如表14及表15所示，水溶性壳聚糖在2.5mg/plate高浓度下的抗突变效应高于1.25mg/plate低浓度下的抗突变效应。以2.5mg/plate的浓度处理水溶性壳聚糖时，S-7呈现出55％的抗突变效应，S-10则随着浓度增加而呈现出更高的抗突变效应。在水溶性壳聚糖方面，S-7与S-10以55％的抗突变效应呈现出最高值，在非溶性壳聚糖方面，NS-8以70％的抑制率呈现了最高的抗突变效应。大部分水溶性/非溶性壳聚糖的抗突变效应随着浓度增加也显著地增加。而且，水溶性/非溶性壳聚糖的抗突变效应随着脱乙酰度的增加或者粘度的减小而出现增加。该实验为23种壳聚糖的筛选作业提供了重要的依据。
如表16及图3所示，含1％非溶性壳聚糖NS-8的泡菜在1.25mg/plate的浓度下得到了64％的抗突变效应，比标准化泡菜的抗突变效应(41％)高了很多。含壳聚糖泡菜在2.5mg/plate的浓度下、含1％水溶性壳聚糖S-10的泡菜与含1％非溶性壳聚糖NS-8的泡菜均得到了77％的最高的抗突变效应，也比标准化泡菜的抗突变效应(58％)高。由此可知含水溶性/非溶性壳聚糖的泡菜的抗突变效应高于标准化泡菜的抗突变效应。而且，含非溶性壳聚糖NS-8的泡菜的抗突变效应高于含水溶性壳聚糖S-10的泡菜，含1％壳聚糖的泡菜的抗突变效应高于含0.5％壳聚糖的泡菜。
1-3.对于间接突变源(MNNG)的抗突变效应 为了活化间接突变源，按照Maron与Ames的方法制备了作为肝微粒体酶混合物(microsomal enzyme mixture)的S9混合物。为了诱发大约200g的雄性Splague-Dawley大鼠的肝酶，把作为多氯联苯(PCB)混合物的氯化联苯(Aroclor)1254稀释成每1ml玉米油含200mg的浓度后腹腔注射一次(500mg/kg)并且在5日后摘取肝。在4℃无菌状态下将摘取的肝利用0.15M KCl清洗数次，然后添加重量达3倍肝重量的0.15M KCl溶液，在均化器(Potter-Elvehiem apparatus，USA)里进行均质化。在9,000xg离心分离10分钟后得到上清液S9组分，然后按1～2ml的分量分注到冷冻管(cryo tube)里，在干冰急剧冻结后保管在-180℃的液氮罐里来应用于实验。把上述S9组分(10％)与MgCl-KCl盐(2％)、1M葡萄糖-6-磷酸盐(0.5％)、1M NADP(4％)、0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.4)及灭菌水一起混合而制成S9混合物。
除了在上述1-2中以S9混合物(间接突变源)替代磷酸缓冲液(直接突变源)以外，其余的步骤和上述1-2的方法相同来进行实验。
Salmonella typhimurium TA100被间接突变源AFB1(0.5μg/plate)诱发突变时，含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物的抗突变效应如表17及图4所示。
表17
※每板的自然回复突变数量66±15 如表17及图4所示，在1.25mg/plate的低浓度下含0.5％非溶性壳聚糖NS-8的泡菜以67％的抑制率表现出最高的抗突变效应，含1％水溶性壳聚糖S-10的泡菜则具有63％的抑制率。上述数值高于标准化泡菜的抗突变效应(53％)。在2.5mg/plate的浓度下处理含壳聚糖泡菜时，含0.5％水溶性壳聚糖S-10的泡菜以92％的抑制率表现出很高的抗突变效应，含1％水溶性壳聚糖S-10的泡菜则具有87％的抑制率。上述数值高于标准化泡菜的抗突变效应(77％)。因此，含水溶性/非溶性壳聚糖的泡菜对于间接突变源AFB1的抗突变效应也表现出了类似于对于MNNG的抗突变效应的倾向。
实验例4抗癌活性的测定 为了确认水溶性/非溶性壳聚糖及含壳聚糖泡菜的抗癌活性，进行了下述实验。
4-1.细胞培养 细胞培养用RPMI 1640、FBS、0.05％胰酶-0.02％EDTA及100units/ml青霉素-链霉素购自GIBCO公司(USA)。细胞培养使用5％CO2培养基(Forma，model MCO96，Japan)进行实验。AGS人体胃癌细胞(AGS human gastricadenocarcinoma cell)及HT-29人体结肠癌细胞(HT-29 human colonadenocarcinoma cell)取自韩国细胞株银行(KCLB，Korean Cell Line Bank)(首尔医大)并加以培养后应用于实验。
AGS人体胃癌细胞及HT-29人体结肠癌细胞则使用含有100units/ml青霉素-链霉素与10％FBS的RPMI 1640，在5％CO2培养基进行培养。培养出来的各癌细胞在一星期内重新供应2～3次，然后在第6～7日利用PBS洗，利用0.05％胰酶-0.02％EDTA分离出已附着的细胞进行离心分离后，把积聚的癌细胞放进培养基里使用吸液管混合而使癌细胞均匀地分散，按照10ml分量分割成一定数量后注入75ml的细胞培养烧瓶里，并且每隔6～7日继续进行继代培养而应用于实验。继代培养时记录各传代次数，当传代次数超过10次以上时从液氮罐拿出新的癌细胞重新培养后进行实验。
4-2.MTT化验 培养出来的上述癌细胞在96孔板上以每孔1×104cells/ml的方式分注180μl，按照各浓度添加20μl的试料后，在37℃的温度下在5％CO2培养基培养72小时。在其中添加用磷酸生理盐水将浓度调节为5mg/ml的MTT(Sigma，USA)溶液20μl，在同一培养条件下继续培养4小时。在2000rpm转速下离心分离10分钟后去除上清液，添加DMSO 150μl后将板晃动30分钟。把所生成的甲瓒结晶溶解于DMSO后利用酶标仪(ELISA Reader)测定540nm下的吸光度。细胞毒性率(％)则使用数学式2计算。
数学式2 细胞毒性率(％)＝[(对照组的吸光度-试料处理组的吸光度)/对照组的吸光度]×100 水溶性壳聚糖对AGS人体胃癌细胞的抑制生长效果如表18所示，水溶性壳聚糖对HT-29人体结肠癌细胞的抑制生长效果如表19所示，非溶性壳聚糖对HT-29人体结肠癌细胞的抑制生长效果如表20所示。含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物对AGS人体胃癌细胞的抑制生长效果如表21所示，含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物对HT-29人体结肠癌细胞的抑制生长效果如表22所示。
表18水溶性壳聚糖对AGS人体胃癌细胞的抑制生长效果
表19水溶性壳聚糖对HT-29人体结肠癌细胞的抑制生长效果
表20非溶性壳聚糖对HT-29人体结肠癌细胞的抑制生长效果
表21含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物对AGS人体胃癌细胞的抑制生长效果
表22含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物对HT-29人体结肠癌细胞的抑制生长效果
如表18所示，水溶性/非溶性壳聚糖对AGS人体胃癌细胞的抗癌效果以S-10在5mg/ml高浓度下的抗癌效果最优异，而且抗癌效果也随着浓度而从8％急剧增加到了88％。
如表19及表20所示，在HT-29人体结肠癌细胞上也出现了类似于AGS人体胃癌细胞的倾向，5mg/ml高浓度壳聚糖的抗癌效果优于1mg/ml低浓度壳聚糖的抗癌效果。水溶性壳聚糖S-7与S-8表现出了43～44％的最高抗癌效果，非溶性壳聚糖NS-8与NS-9则表现出了83％的非常高的抗癌活性。
如表21所示，含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物对AGS人体胃癌细胞的抑制癌细胞生长效果为，在高浓度(200μg/ml)下含1％S-10的泡菜与含1％NS-8的泡菜分别以66％与89％的抑制癌细胞生长效果超过了标准化泡菜(38％)。而且如表22所示，含壳聚糖泡菜的甲醇萃取物对HT-29人体结肠癌细胞的抑制癌细胞生长效果为，在高浓度(200μg/ml)下含1％S-10的泡菜与含1％NS-8的泡菜分别以47％与63％的抑制癌细胞生长效果超过了标准化泡菜(32％)。如前所述，含非溶性壳聚糖的泡菜的抗癌效果更优于含水溶性壳聚糖的泡菜。
实验例5对于含壳聚糖泡菜的储存稳定性的验证 为了验证本发明含壳聚糖泡菜的储存稳定性，一边在4～15℃的温度下发酵泡菜，一边每隔5日就观察其发酵特性。
5-1.泡菜发酵中pH与酸度变化的测定 利用榨汁机(NUC，韩国)对上述实施例2到5所制成的含壳聚糖泡菜进行榨汁而制成试料。使用pH测量仪(Corning 220，USA)在室温下测量pH值。利用蒸馏水把试料20ml稀释20倍后取10ml根据AOAC法测定酸度。此时把0.1％酚酞作为指示剂添加1ml，滴定0.1N NaOH，把呈粉红色的点设定为终点。滴定值是利用数学式3换算为乳酸并且以含量％来表示。
数学式3 乳酸(％)＝{(0.1N NaOH的ml×NaOH的标准浓度)/试料的重量(g)}×9 在15℃温度下发酵的含水溶性/非溶性壳聚糖的泡菜(实施例2)的pH与酸度变化如表23所示，在4℃温度下发酵的使用在含壳聚糖腌制溶液中腌制的白菜制成的泡菜(实施例3)的pH与酸度变化如表24所示，在4℃温度下发酵的将食盐腌制的白菜在含壳聚糖涮洗液中涮洗后制成的泡菜(实施例4)的pH与酸度变化如表25所示，在4℃温度下发酵的使用含壳聚糖作料制成的泡菜(实施例5)的pH与酸度变化如表26所示。
表23
表24
表25
表26
如表23所示，观察泡菜刚刚腌好后的pH变化的话，含非溶性壳聚糖的泡菜显著地维持着高pH值。随着发酵的进展，含壳聚糖泡菜的发酵速度低于标准化泡菜的发酵速度，到了第7日，含1％S-10的泡菜具有3.91的pH值，而标准化泡菜具有3.71的低的pH值；浓度越低、pH值就跟着降低，含0.5％NS-8的泡菜的pH值为3.73，近似于标准化泡菜。经过第4日的适熟期后，含壳聚糖泡菜的发酵速度进一步加快，到了发酵第7日时pH值已经非常接近了。酸度的变化也呈现了相似的倾向，含非溶性壳聚糖的泡菜的酸度在初期阶段明显低于含水溶性壳聚糖的泡菜的酸度，但随着发酵进展酸度变化表现得相似。如前所述，发酵初始阶段由于添加壳聚糖而泡菜的发酵速度降低，这表示壳聚糖可以有效地抑制初期的发酵。
如表24所示，随着用来腌制白菜的食盐水中含有的壳聚糖的浓度从0.05％向0.15％、0.3％、0.5％一直递增，pH值逐渐降低。使用在0.3％的含壳聚糖腌制溶液中腌制的白菜而制成的泡菜，在发酵第15～25日时，维持了4.2～4.4的pH值与0.6～0.7％的酸度，使用在0.5％的含壳聚糖腌制溶液中腌制的白菜而制成的泡菜，在发酵35日时才进入了适熟期，第35日的pH值依然不低于4.0。可见和标准化泡菜的发酵情形相比，上述含壳聚糖泡菜有效地延长了储存性与赏味期。与此相反的是，使用0.05％及0.15％的含壳聚糖腌制溶液腌制白菜后制成的泡菜却在和标准化泡菜差不多的时间进入了适熟期。
如表25所示，将食盐腌制白菜在含壳聚糖涮洗液中涮洗后制成的泡菜也在第15日进入了适熟期，可见其储存性高于标准化泡菜。但壳聚糖的浓度并没有造成显著的差异。
如表26所示，使用含水溶性/非溶性壳聚糖(0.1、0.25、1.5％)作料制成的泡菜在第15日进入了适熟期，使用含0.5％水溶性/非溶性壳聚糖的作料制成的泡菜和标准化泡菜一样在第10日进入了适熟期(pH4.34)。酸度的变化类似于pH的变化，使用含水溶性/非溶性壳聚糖作料制成的泡菜的储存性高于标准化泡菜。但壳聚糖的浓度并没有造成显著的差异。
根据上述pH值与酸度变化的观察结果得知，使用在含壳聚糖腌制溶液中腌制的白菜来制成的泡菜，与将食盐腌制白菜在含壳聚糖的涮洗液中涮洗后制成的泡菜、以及使用含水溶性/非溶性壳聚糖作料制成的泡菜相比，泡菜的储存性与保存性最好。
如前所述，含壳聚糖泡菜里的壳聚糖可以延缓泡菜的发酵速度而增强泡菜的储存性与保存性，和标准化泡菜相比，由于到达适熟期的时间较长而延缓了发酵进度，因此具有良好的储存稳定性。
5-2.泡菜发酵中乳酸菌数量的测定 下面主要观察上述实施例2到5所制成的含壳聚糖泡菜对泡菜乳酸菌Leuconostoc sp.与Lactobacillus sp.的生长所造成的影响。
泡菜不仅在发酵初期生成Leuconostoc sp.乳酸菌而使泡菜的味道与风味变得良好，还能抑制作为杂菌的嗜氧性细菌的繁殖而呈现出爽口的味道，但随着发酵进展，具有酸味的Lactobacillus sp.乳酸菌增加，从而pH降低，酸度提高。
利用平皿计数法(plate count technique)测定了泡菜在发酵时的乳酸菌数量。在泡菜发酵熟成过程中微生物菌数的变化方面，首先利用经过灭菌处理的蒸馏水把1ml的混合液阶段性地稀释到101～107，把各稀释液0.1ml放进事先加热溶解后冷却到43～45℃的MRS培养基10ml里并加以混合，然后在细菌培养皿(Petri Dishes)上制作平皿并且在37℃的培养基里培养48小时后，计数所出现的菌落数量，测定为乳酸菌数量。培养基使用了主要用于乳酸菌分离作业的MRS琼脂培养基。MRS琼脂培养基的组成示于表27。Lactobacillus培养基使用了在Lactobacillus的选择性培养基(LBS培养基)上添加了可以抑制Pediococcus生育的醋酸与醋酸钠的改性LBS琼脂培养基(m-LBS培养基，表28)，在30℃的温度下平皿培养3天。Leuconostoc选择性培养基使用添加了苯乙醇与蔗糖的苯乙醇蔗糖(Phenylethyl alcohol sucrose)琼脂培养基(PES琼脂培养基，表29)，在20℃的温度下平皿培养3天。
含壳聚糖泡菜(实施例2)在15℃温度下进行发酵时的Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.数量变化如图5所示。使用含壳聚糖的腌制溶液腌制白菜后制成的泡菜(实施例3)在4℃温度下进行发酵时的Leuconostoc sp.及Lactobacillussp.数量变化如图6所示。通过含壳聚糖的涮洗液涮洗食盐腌制白菜后制成的泡菜(实施例4)在4℃温度下进行发酵时的Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.数量变化如图7所示。使用含壳聚糖作料制成的泡菜(实施例5)在4℃温度下进行发酵时的Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.数量变化如图8所示。
表27
表28
表29
如图5到图8所示，本发明含壳聚糖泡菜可以抑制Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.乳酸菌的生长速度，呈现出良好的储存性与保存性。
实验例6含壳聚糖泡菜的质构测定 为了确认本发明含壳聚糖泡菜的储存期中的质构，进行了下述实验。
把发酵时间达3星期及4星期的上述实施例3所制泡菜(使用了0.3％及0.5％的含壳聚糖腌制溶液)切成10cm2大小作为试片，测定上述试片的剪切强度来判断其质构。表30是其结果。
表30
如表30所示，本发明含壳聚糖泡菜的质构显著优于标准化泡菜。
实验例7利用含壳聚糖的腌制溶液腌制的腌制白菜及使用该腌制白菜制成的泡菜中的壳聚糖含量测定 为了确认本发明的利用含壳聚糖的腌制溶液腌制的腌制白菜及使用该腌制白菜制成的泡菜中的壳聚糖含量，进行了下述实验。
对于上述实施例3中由含0.3％及0.5％壳聚糖的腌制溶液腌制而成的腌制白菜及使用上述腌制白菜制成的泡菜中的壳聚糖含量进行测定。表31是其结果。
表31
如表31所示，利用含壳聚糖腌制溶液腌制的腌制白菜及使用该腌制白菜制成的泡菜，由于壳聚糖随着腌制浓度而含浸到腌制白菜内而有效地改善了泡菜的质构并完善了膳食纤维本身的功能性。也就是说，植物性纤维素是负(-)电荷的膳食纤维，壳聚糖则是正(+)电荷的膳食纤维，因此适量的壳聚糖含浸混入腌制物后就成为阳性膳食纤维，使泡菜的植物性纤维素结构变得致密，从而改善泡菜的质构并完善膳食纤维本身的功能性。
产业用途 本发明腌制用壳聚糖粉末，通过选出抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性优异的水溶性/非溶性壳聚糖后根据脱乙酰度与粘度而加以规格化，利用该腌制用壳聚糖粉末制成的含壳聚糖泡菜具备了优于壳聚糖本身的抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性。而且，本发明的含壳聚糖泡菜可以通过壳聚糖使泡菜缓慢地发酵而延长了到达适熟期的时间，从而提高了储存稳定性，而且可以抑制Leuconostoc sp.及Lactobacillus sp.乳酸菌的生长速度而得以大幅提高储存性与保存性，并且适量的壳聚糖含浸混入腌制物后就成为阳性膳食纤维，使泡菜的植物性纤维素结构变得致密，从而有效地改善泡菜的质构并完善膳食纤维本身的功能性。
权利要求
1.一种腌制用壳聚糖粉末，具备优异的抗菌、抗氧化、抗突变及抗癌活性，其特征在于是从由具有50～90％的脱乙酰度与1～10cP的粘度的水溶性壳聚糖、具有60～100％的脱乙酰度与8～80cP的粘度的非溶性壳聚糖、以及食品学允许使用的盐组成的组中选出的任意一个或一个以上的组合。
2.根据权利要求1所述的腌制用壳聚糖粉末，其特征在于所述食品学允许使用的盐是从由盐酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐及乳酸盐组成的组中选出的任意一种。
3.一种腌制溶液，其特征在于含有相对于腌制溶液总重量为0.2～1.0重量％的权利要求1或2所述的腌制用壳聚糖粉末。
4.一种腌制物，其特征在于在权利要求3的腌制溶液中腌制蔬菜类而制成。
5.根据权利要求4所述的腌制物，其特征在于所述蔬菜类是从由白菜、小萝卜、萝卜、黄瓜、洋葱、大蒜及辣椒组成的组中选出的一种以上。
6.根据权利要求4所述的腌制物，其特征在于所述腌制物中含浸有相对于腌制物总重量为0.05～0.25重量％的壳聚糖。
7.一种泡菜，其特征在于利用权利要求4～6中的任一项所述的腌制物来制成。
8.一种泡菜，其特征在于含有相对于泡菜总重量为0.01～1.5重量％的权利要求1或2所述的腌制用壳聚糖粉末。
全文摘要
本发明涉及一种腌制用壳聚糖粉末、使用该壳聚糖粉末的腌制物及使用该壳聚糖粉末制成的泡菜。上述腌制用壳聚糖粉末的特征在于选出抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性优异的水溶性/非溶性壳聚糖，并根据脱乙酰度与粘度加以规格化。利用上述规格化的壳聚糖粉末制成的含壳聚糖泡菜，优于壳聚糖本身的抗菌活性、抗氧化活性、抗突变效应及抗癌活性，其储存稳定性与质构很好。
文档编号A23B7/154GK101584361SQ20081016151
公开日2009年11月25日 申请日期2008年9月24日 优先权日2008年5月19日
发明者朴健荣, 卢弘均, 李信浩, 河钟吉 申请人:株式会社金湖化成