一种补料发酵生产辅酶Q₁₀的方法

专利名称：一种补料发酵生产辅酶Q₁₀的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种补料发酵生产辅酶Q1Q的方法。
背景技术：
辅酶Q^别名癸烯醌、泛酮、万有醌，英文名Coenzyme Q1Q，简称Cc^。，为脂溶性酮类 化合物，化学名称2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌。分子式C59H9。04 ;CAS号
303-98-0 ;化学结构式^^-^11^^^^^^.性质黄色或浅黄色结晶性粉
末。易溶于氯仿、苯和四氯化碳，溶于丙酮、乙醚，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇。遇光易分 解。 辅酶Qw在动植物、微生物细胞内与线粒体内膜相结合，是呼吸链中重要递氢体， 是一种有效的生化药物，具有重要的生理作用，近年来已被广泛应用于各类心脏病、糖尿 病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性 牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最近，研究发现CoQ,具有抗衰老 作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。
CoQ1Q的制备方法主要有五种 1、半合成法目前开发的半合成法工艺是以对甲基苯酚为原料通过溴代，醚化、氧 化获得甲基二甲氧基苯醒，然后与从烟草或马铃薯叶子中提取茄呢醇縮合得到辅酶Qi。。该 方法的关键是如何将侧链连接到母环上。 2、全合成法1988年Eem和Kanan开发的全合成法生产辅酶Qw工艺是目前唯一 成功的全合成法技术，但是由于合成线性不饱和侧链存在一定难度，以及合成条件苛刻，与 工业化还有一定的距离。 3、发酵法1977年实现了微生物发酵法生产辅酶Q^。这种生产工艺被认为是最有 前途的合成工艺，近几年来微生物发酵法成为国内外开发的热点。红极毛杆菌、脱氮极毛杆 菌，甲烷微环菌等是生产辅酶Q1Q的主要菌种。 4、植物细胞培养法植物细胞培养技术是将植物体的某一部分经过无菌处理后， 置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。植物的各个部位，如根、茎、 叶、花、果、花药和花粉等都可以作为外植体来启动细胞培养，所形成的脱分化细胞团称为 愈伤组织，将愈伤组织转移到液体培养基中进行培养称为悬浮培养。 5、生物提取法(1)醇一碱皂化制造法该工艺辅酶Q1Q的收率为61. 2mg/kg新鲜 猪心，这是国内普遍采用工艺。在乙醇的存在下，长时间的皂化可能导致辅酶Qw中的甲氧 基和乙醇中乙氧基换位，生成单或双乙氧基衍生物，为了避免这些杂质的生成。可以用K0H 代替NaOH和甲醇皂化，但也必须加入焦性没石子酸，否则辅酶Q1Q在皂化过程中全部被破 坏，加入量占起始原料的5% _7%，皂化过程中可以通入氮气。(2)醇一醚混合提取法该工 艺醇一碱皂化制造法工艺相似，只是省去了皂化反应。 总的来说化学合成法合成步骤繁多，条件苛刻，副产物含量多，提纯成本高；并
3且合成产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，要合成生物活性高的CoQ1Q尚未达到工业 化生产的程度。生物提取法中动植物CoQ1Q含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来 源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。植物细胞培养法周期长， 产率低，而且生产成本高，不利于工业化生产。相比之下利用微生物发酵法生产CoQw有几 个基本优点(l)发酵产物为天然品，生物活性好，易被人体吸收；(2)没有原材料的制约， 可通过规模放大提高生产能力。如能选择合适菌株进行诱变选育，选育性能优良的菌种，同 时优化发酵工艺，使菌种的Co(^。。生产水平提高，生产成本就会大幅度下降。因此，微生物 生产CoQ1Q在工业化生产上更为看好。

发明内容
本发明的目的是提供一种补料发酵的方法来生产CoQw。 本发明技术人员经长期研究发现红色酵母菌HY-05能用于发酵生产C0Q1Q，并能高 密度发酵。研究表明，蔗糖是酵母菌HY-05发酵生产C0Q1Q的较佳碳源，但浓度过高会抑制 CoQw合成。玉米浆中含有多种氨基酸、生物素、蛋白质等成分，可提供细胞生长所需的氮， 并可作为CoQ1Q合成的促进剂，但研究表明，玉米浆起始浓度过高不利于CoQ1Q发酵。本发明 以补料分批培养的方式较好的解决了此问题。
具体发酵方法如下所示
1、种子培养 从活化斜面上挑取一环菌体接入种子培养基，28°C ， 240r/min培养24h。种子培养 基(％):蔗糖2.0，蛋白胨1.0，酵母粉1.0;自然pH。
2、摇瓶培养 菌种在平板上28t:培养48h后，接入种子培养基(20mL/250mL锥形瓶)，28t:振荡 培养2处后，以2%接种量接入发酵培养基(40mL/500mL锥形瓶)，26t:振荡培养72h。发酵 培养基(% ):蔗糖4.0，蛋白胨2.8，腿2 040. 13 ;PH= 5.0。
3、补料分批培养 5L发酵罐装液量3L，接种量2 % ，发酵温度26 °C ， pH5. 5 6. 5为宜，搅拌速度 300r/min。在发酵前期可通过转速和通气量控制溶解氧在50 %左右，从发酵第24h开始，在 减速流加20%蔗糖溶液的同时以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米浆，保持溶解氧的浓度在 35X左右，48h时终止发酵。 本发明用补料发酵的方法，生产出的Co(^。明显优于分批发酵，并且补料方式、补 加底物的量都影响着CoQ1Q的合成量。当底物消耗速率较高，细胞生长较快时，CoQ1Q的合 成速率较低，在细胞生长的稳定期CoQ1Q合成继续进行。细胞的生长与CoQ1Q的合成属于半 耦联型，底物的流加必须兼顾细胞生长和产物的合成。采用补料分批发酵方式不仅可减少 底物的反馈抑制，而且可增大发酵过程中的溶氧，进一步提高CoQw的合成量。玉米浆中含 有嘌呤类、硫氨素、苯丙氨酸、缬氨酸等多种成分，可作为Co(^。合成的促进剂提高产物的合 成。从发酵第24h开始，在减速流加蔗糖的同时以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米浆，CoQ1Q 的积累可达到最大为156. 2mg/L，与不补料相比产量提高了 58. 1%。
与现有CoQ1Q生产方法相比，本发明具有如下有益效果
1、所用发酵菌株红色酵母菌HY-05为安全性菌株；
2、所用发酵培养基及相关原料价廉易得，可降低发酵成本；
3、发酵温度适中，发酵条件要求低；
4、发酵所得单位产量高。
权利要求
一种生产辅酶Q10的方法，采用补料发酵法生产，其特征在于发酵所采用的菌种为红色酵母菌HY-05。
2. 根据权利要求1所说补料发酵的方法，其特征在于，所述发酵方法具体包括如下步骤① 种子培养从活化斜面上挑取一环菌体接入种子培养基，28t:，240r/min培养24h。 种子培养基(％):蔗糖2.0，蛋白胨1.0，酵母粉1.0;自然pH。② 摇瓶培养菌种在平板上2『C培养48h后，接入种子培养基(20mL/250mL锥形瓶)， 28t:振荡培养24h后，以2%接种量接入发酵培养基(40mL/500mL锥形瓶)，26。C振荡培养 72h。发酵培养基(% ):蔗糖4. 0，蛋白胨2. 8， KH2P040. 13 ;pH = 5. 0。③ 补料分批培养接种量为2%，发酵温度26°C， pH5. 5 6. 5为宜，搅拌速度300r/ min。在发酵前期可通过转速和通气量控制溶解氧在50%左右，从发酵第24h开始，在减速 流加20%蔗糖溶液的同时以7. 5mL/(L h)的速度流加玉米浆，保持溶解氧的浓度在35% 左右，48h时终止发酵。
全文摘要
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种补料发酵法生产辅酶Q10。本发明采用红色酵母菌HY-05用于发酵生长辅酶Q10，并用玉米浆补料分批发酵，在减少底物的反馈抑制同时，增大发酵过程中的溶氧，进一步提高辅酶Q10的合成量，发酵成本低。
文档编号C12P7/24GK101760484SQ200810162759
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者吴菁 申请人:吴菁