专利名称：一种新型高分子材料茁霉多糖的制备方法
技术领域：
本发明是关于一种新型高分子材料茁霉多糖的制备方法，属于高分子材料或微生
物发酵领域。
背景技术：
多糖是一类高分子化合物，在食品、化学及医药工业有着广泛的应用。传统的天然 多糖和化学合成的高分子化合物都有其局限性。微生物多糖具有生产周期短(远低于植物 和海藻多糖)，产量、质量和价格受季节、气候影响不大，可以安全地应用于食品、医药、化妆 品等行业，可以被微生物降解的优点。近年来微生物多糖研究得到了迅猛发展，其中有些已 工业化生产。 茁霉多糖(pullulan，简称Pul)，又名短梗霉多糖，它是出芽孢梗霉产生的胞外多 糖，以a-l，6-糖苷键结合麦芽糖构成同型多糖为主，即葡萄糖按a-l，4-糖苷键结合成麦 芽三糖，两端再以a-l，6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成高分子多糖。
对于茁霉多糖的研究工作起始于西德，英国人在理论方面也做了不少工作。日本 进行了比较系统尤其是生产工艺和产品应用的研究，并取得不少成果。茁霉多糖可由淀粉 水解物，蔗糖或其他糖类直接发酵生产。它易溶于水，粘度较低，不易凝胶化，不老化，可任 意加工成型，无毒副作用，是一种很有前途的工业用多糖。随着其它生物多糖的开发研究以 及应用(如海藻糖等)，茁霉多糖的优点日益引起重视，在食品、医药、轻工、化工和石油领 域得以广泛的应用。 在包装材料领域，由于石油化学工业中薄膜、塑料容器等产品易造成环境污染，因 此寻找可降解高分子材料引起越来越多的重视。用茁霉多糖制成的容器在水中溶解比PVC 快3 4倍，而且它是生物合成的微生物降解材料，能被细菌作为营养吞食，燃烧时不释放 有毒气体，是真正的环保产品。 在食品工业中，茁霉多糖可作为水果、含油食品、茶叶等的包装材料，它也可作为 增稠剂等赋予食品特殊的品质，改善口感、赋予色彩及防止干化等。 在造纸工业中，茁霉多糖的水溶液具有良好的成膜性，用它生产出的无植物纤维
纸张具有良好的吸水性，便于书写和印刷，用其作粘结剂配料还可生产出特殊用途的高级
纸张。茁霉多糖作粘结剂结成的沙模在浇铸时不产生气体、尘埃、噪音和振动 关于茁霉多糖的生产方法和生产条件，人们已做了细致的研究。在进行商业生产
时，一般以淀粉水解物为底物，其浓度为10% 15%。培养基中还含有丙酮、磷酸盐和基础
盐。培养液的起始PH调为6. 5左右，在发酵过程中，它会慢慢下降，特别是在起初的24h内，
最后降至3. 5左右。芽短梗霉的最大生长期在前75h内，而茁霉多糖的最佳产量在前100h
内得到。培养液需要搅拌和通氧气，且温度保持在3(TC左右。选择适当的发酵条件和菌株
可以得到分子量大的产物。发酵完毕后，通过过滤把芽短梗霉细胞从培养液中移除。用有
机溶剂特别是乙醇沉淀法可分离得到茁霉多糖粗品，利用超滤和离子交换树脂可进行进一
步的提纯。
茁霉多糖生物合成是一个极其复杂的、动态的、受多因素影响的过程。其中微生物 的生长、产物的形成、底物的消耗、溶氧量、pH值等都处于不断变化之中。选择最佳的发酵 初始pH值、菌种、接种量和装瓶量，可以调节发酵液中不同形态的菌体浓度和比例，调控发 酵过程中残糖、pH值和溶氧量等参数变化，使发酵向高产多糖的方向进行，大大提高茁霉多 糖的产量和转化率。 生产茁霉多糖发酵所用的芽短梗霉菌株，可以从天然物质中分离得到。从自然界 获得的芽短梗霉菌株， 一般生产茁霉多糖的能力较低，采用物理或化学方法诱变，可以筛选 出优良菌株，提高芽短梗霉发酵效率、减少色素生成。 本发明以甘蔗糖蜜为原料，通过微波-紫外线复合诱变的方法筛选出优良的高产
糖菌株，经过优化的发酵条件培养，得到的茁霉多糖产率高。
发明内容
本发明的目的是提供了一种新型高分子材料茁霉多糖的制备方法。
(1)诱变处理 单孢子悬液制备在斜面培养基上加入无菌水，用接种环刮取培养物表面的孢子， 制成粗制的孢子悬液。将此悬液振荡20min，过滤悬液，制成孢子浓度约10个/ml的单孢子 悬液。 微波_紫外复合诱变处理是在致死率> 95%的照射剂量下，先用微波诱变处理 后，然后稀释涂布，28°C _301:培养，然后挑选长势良好的菌株进行紫外线诱变处理，接着稀 释涂布，28。C -3(TC培养。
(2)生产菌株的筛选 菌落初筛将经诱变后的菌株培养，挑取菌落颜色淡化、形态异常或孢子含量丰富 的菌株，斜面保存。 摇瓶初筛将菌落初筛获得的变异菌株接种于发酵培养基中，摇瓶培养，选取多糖 产量高的或色素含量明显减少的突变菌株，进行下一步摇瓶复筛。 摇瓶复筛将摇瓶初筛选出的变异菌株继续摇瓶培养，选出多糖产量最高的菌株。
(3)茁霉多糖的生成 将摇瓶筛得到的菌株先经过种子培养，然后转入发酵培养。最后将发酵液于 4000r/min离心15min，分离上清液与菌体沉淀，将上清液加入2倍体积的无水乙醇，振荡摇 匀，4t:放置过夜，使多糖充分沉淀，再4000r/min离心15min，弃上清，沉淀依次用丙酮、乙 醚洗涤，80°C烘干至恒重，即得茁霉多糖。 本发明所采用的复合诱变的方法筛选高产糖菌株，效果好，所得到的突变菌株的 产糖量高，且发酵液颜色浅，所得到的茁霉多糖为淡黄色，只需再经过简单的后续脱色工序 即可得到颜色纯正、质量又好的茁霉多糖。该方法操作简单、又节省成本，该法将在茁霉多 糖的工业化大生产中有良好的应用前景。
权利要求
一种新型高分子材料茁霉多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)诱变处理单孢子悬液制备在斜面培养基上加入无菌水，用接种环刮取培养物表面的孢子，制成粗制的孢子悬液。将此悬液振荡20min，过滤悬液，制成孢子浓度约10个/ml的单孢子悬液。微波-紫外复合诱变处理是在致死率＞95％的照射剂量下，先用微波诱变处理后，然后稀释涂布，28℃-30℃培养，然后挑选长势良好的菌株再进行紫外线诱变处理，接着稀释涂布，28℃-30℃培养。(2)生产菌株的筛选菌落初筛将经诱变后的菌株培养，挑取菌落颜色淡化、形态异常或孢子含量丰富的菌株，斜面保存。摇瓶初筛将菌落初筛获得的变异菌株接种于发酵培养基中，摇瓶培养，选取多糖产量高的或色素含量明显减少的突变菌株，进行下一步摇瓶复筛。摇瓶复筛将摇瓶初筛选出的变异菌株继续摇瓶培养，选出多糖产量最高的菌株。(3)茁霉多糖的生成将摇瓶复筛得到的菌株先经过种子培养，然后转入发酵培养。最后将发酵液于4000r/min离心15min，分离上清液与菌体沉淀，将上清液加入2倍体积的无水乙醇，振荡摇匀，4℃放置过夜，使多糖充分沉淀，再4000r/min离心15min，弃上清，沉淀依次用丙酮、乙醚洗涤，80℃烘干至恒重，即得茁霉多糖。
2. 根据权利(1)中所说的诱变处理，其特征在于所用的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼 脂培养基(PDA):马铃薯300g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，氯霉素0. lg/L， 121。C高压灭菌 20min。微波处理的条件是频率2450Hz，功率为800W，处理时间为140_160s ;紫外线诱变处 理的条件是用15W的紫外灯，距离固定在30cm左右，照射时间为60-70s。
3. 根据权利(2)中所说的生产菌的筛选，其特征在于诱变后的菌株28t:培养3-5d，然 后4"放置6-8d。
4. 根据权利要求(3)中所说的茁霉多糖的生成，其特征在于种子培养条件为接种量 5 % ，装液量20% ， 28-30°C 、 180r/min振荡培养36h ;种子培养基为蔗糖50. Og/L， K2HP04 5. Og/L， (NH4)2S04 0 . 6g/L，酵母膏3. Og/L，NaCl 1. Og/L， MgS04 7H20 0. 2g/L，pH6. 5， 121°C 灭菌30min。
5. 根据权利要求(3)中所说的茁霉多糖的生成，其特征在于发酵培养的条件为接种 量15%，装液量30X，28-30。C、200r/min振荡培养140-145h ;发酵培养基蔗糖80. Og/L， K2HP04 6 . 0g/L，NH4N03 0. 2g/L，酵母膏0. 8g/L， NaCl 1.0g/L，CaC03 0. 2g/L， pH6， 121。C灭菌 30min。
6. 根据权利要求(3)中所说的茁霉多糖，其特征在于它是一种新型的高分子材料，可 广泛用于食品、医药、轻工、化工和石油领域。
全文摘要
本发明公开了一种新型高分子材料茁霉多糖的制备方法。以甘蔗糖蜜为原料，通过微波-紫外线复合诱变的方法筛选出优良的高产糖菌株，经过优化的发酵条件培养，得到的茁霉多糖产率高。该方法操作简单、又节省成本，此法将在茁霉多糖的工业化大生产中有良好的应用前景。
文档编号C12N13/00GK101760456SQ200810162760
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者吴菁 申请人:吴菁