专利名称：一种中华蜜蜂头部表达序列基因芯片及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种中华蜜蜂头部表达序列基因芯片 及其用途。
背景技术：
生物基因组中可转录表达的序列(即基因)仅占总序列的3-5% ，对这部 分序列进行测定，将直接导致新基因的发现，并获取基因组中与产业化关系最 为密切的信息。20世纪80年代，高通量的自动测序的出现，使从质粒互补脱 氧核糖核酸(Complement DNA，简称cDNA)文库随机选取许多cDNA克 隆和决定来自非载体两端的几百个碱基的DNA序列成为可能。这些短的DNA 序列叫作"表达序列标签"(Expressed Sequence Tags,简称ESTs)。 1992年 Sikela和Matsubara ( Sikela , et al . Nucleic Acids Res . 19 , 1837- 1843 ; Matsubara , et al . Alature Genetics ， 2 ， 173-179)针对获得大量信使核糖核酸 (mRNA)序列的迫切需要，提出大规模互补脱氧核糖核酸(cDNA)测序的研 究战略。其基本特征就是从以质粒为载体，构建完成的目的组织互补脱氧核糖 核酸(Complementary DNA，简称cDNA )文库中，随机选择许多cDNA克 隆，利用质粒上携带的通用引物对cDNA两端进行一轮脱氧核糖核酸序列测 定，所获得的来自3'端或5'端的几百个碱基的非载体短脱氧核糖核酸(DNA) 序列。简而言之，表达序列标签是来自表达基因片段3'端或5'端的短脱氧核 糖核酸序列，代表一个表达基因的部分转录片段。
随着生物技术的发展和生命科学发展的需要以及表达序列标签固有的特 点，1995年10月Patrick Brown和他的同事[Bio Teclmiques ， 19 ( 1995), 442- 47] 提出了 cDNA微阵列技术，M Schena ( Science 1995 ; 270 ( 5235 ), 467-470 ) 和D . Shalon ( Genoe Research 1996 ; 6 (7) ， 639 - 645)等首次制造了 cDNA阵 列，随后这项技术得到了飞速的发展。基因芯片(Biochips)的实质就是在面积 不大的基片上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置地可寻址的生物识别分 子，它是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量基因探针或 基因片断按特定排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的
3致密、有序的DNA分子点阵。
根据基因芯片所用探针的不同可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。寡核苷 酸芯片所用探针采用原位合成方法人工合成，所有序列长度通常为20个碱基。 cDNA芯片所用探针为cDNA，通常以cDNA克隆为模板，采用PCR扩增，序 列长度不一致。基因芯片技术主要包括三个基本环节(1)芯片制备采用表 面经过化学处理的固相载体如玻片或硅片作为芯片片基，将DNA片段按特定顺 序排列在片基上；(2)样品制备与杂交即将样品作特定生物处理，获取其中 的DNA或RNA信息分子并加以标记，然后选择合适的反应条件，使样品分子 与靶标分子产生杂交反应。(3)芯片的检测与分析即将芯片置入芯片扫描仪 中，通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置，经软件分析获得相关生物信息。 因DNA芯片因具有强有力性、灵活性、敏感性和相对简单等特点而可应用在许 多领域，如DNA序列测定、基因多态性检测、新基因的发现、疫苗和药物 研究。基因芯片技术的出现，使综合、系统分析某些生命现象成为可能，为生命 科学、医学等领域的研究提供了一个强有力的工具。随着人类和多种模式生物 全基因组测序的完成和公开，目前根据人类和模式生物基因组信息设计的基因 芯片已大规模商业化开发应用，在医学、农业和其它各生命科学领域广泛应用(李 瑶，裘敏燕，刘三震，等.基因芯片与功能基因组。北京化学工业出版社，2004， 153-154; Chen JJ， WuR， YangPC， etal。 Genomics, 1998， 51 (3): 313-324)。
蜜蜂是不仅具有重要的经济和生态价值，同时作为一种行为非常复杂的模 式生物，在生命科学领域有着十分重要的学术价值，为此美国于2003年初启动 了西方蜜蜂(々& we〃乔ra)基因组测序工作。在2006年10月26日出版的《自 然》杂志上，美国蜜蜂基因测序联盟(HGSC)首次公布了测序和分析结果，它 标志着蜂学研究进入了一个全新阶段。与此同时，由美国科学院院士、伊利诺 斯大学Robinson教授等研制的西方蜜蜂脑cDNA芯片和全基因组寡核苷酸芯片 相继问世(RobinsonGE， Ben-Shahar Y. Brain and Behavior, 2002， 1: 197-203; WhitfieidCW， BandMR， BonaldoMF， et al。 Genom Research, 2002， 12: 555-566; Honey Bee Oligonucleotide Microarray (http:〃www.beespace.UIUG.edu/ BeeArray)，并通过应用于实验研究，破解了不同日龄工蜂职能分化的分子机理 (Whitfield CW， CzikoAM， Robinson GE。 Science, 2003， 302: 296-299)，目前 其基因组寡核苷酸芯片已实现商品化。该高通量、集成化和自动化蜜蜂芯片的 开发和应用，提供了以基因群体模式对生物学性状的基因水平分析，阐明分子 作用机理的强有力工具，对加快养蜂业品种的优育和优选，寻找新基因、疾病 诊断、药物筛选均具有重要价值。中华蜜蜂U. ceranacera"a，中蜂)是原产于我国的蜜蜂种质资源，在我国 已有3000年以上的人工养殖历史，由于其长期适应我国的地理环境和气候条件， 形成了很强的抗逆性和抗病性，特别是具有很强的抗大蜂螨特性，且是可遗传 的。而大蜂螨(狄氏瓦螨&m^血Wn/"or)对西方蜜蜂是毁灭性的病害。因此， 中蜂具有西方蜜蜂不可替代的种质特性和资源优势，迄今仍是我国西北地区和
各地偏远山区的当家蜂种，对农村经济的发展依然具有重要价值；同时作为重 要的传粉昆虫，中蜂一直是我国自然生态体系的一个重要生物链环节，对保护 植物多样性具有不可替代的重要作用(陈盛禄.中国蜜蜂学。北京中国农业出 版社)。但目前对中蜂基因芯片的研究尚属空白。开发具有我国自主知识产权的 中蜂基因芯片可为高通量筛选和挖掘蜜蜂功能基因提供有效方法，对我国特有 的蜜蜂种质资源和生物多样性的保护和利用，蜂产品质量的提高均具有重要价 值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种中华蜜蜂头部表达序列基 因芯片及其用途。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 一种中华蜜蜂头部表达序列
基因芯片，它主要由载体和结合在载体上的SEQIDNO.l SEQIDNO. 718所
示序列、及它们的同源序列和互补序列的核酸分子组成。
一种上述的中华蜜蜂头部表达序列基因芯片在生物功能的研究和检测方面 的应用。
进一步地，所说的生物包括动物、动物细胞、动物组织器官及系统。所说 的生物功能的研究包括药物、动物的抗逆性、育种和新品种的产生、杂种优势 的早期预测、动物生长和发育的机理和药物的毒理学；所说的生物功能的检测 包括转基因动物的安全性检测、食物成分的功能性评估、病原体的检测和诊断、 物种的鉴定。
本发明的有益效果是
1.用获得的新的EST制成EST芯片具有许多商用价值和科研价值(1) 应用该EST芯片可用于克隆动物的重要生产性状的基因，如抗虫、抗病害和抗 低温等基因的克隆。(2)应用该基因芯片也可用于对蜜蜂的杂种优势进行早期 预测，筛选出最佳的优势杂交种。(3)应用该基因芯片也能用于对转基因蜜蜂 及其产品进行商品检验，以检验可食转基因产品的安全性。(4)应用该基因芯片还可用于査找药物的毒性和副作用，进行毒理学研究，利于对新型农药的筛 选。(5)该基因芯片可用于动物育种和新品种的产生。(6)该基因芯片还可用
于从整体上研究整个信使核糖核酸(mRNA)的表达，这对生物体基因调节的整 体性研究具有重要的科研和实践指导价值。(7)应用该基因芯片还可以运用突 变体研究植物中胞间和胞内信号转导，为发现动物中的基因功能和生理代谢途 径提供重要的理论依据。(8)该基因芯片能够作为一种商品，广泛应用于生命 科学，农业行业以及实际生产中。
2. 可以利用这些新的表达序列标签绘制基因图谱。如果一个EST在基因组 中只出现一次，那么它可以做为序列标签位点(STS)。由EST构建的物理图谱 叫表达图或转录图。利用EST进行基因图制作，可以加快序列标签位点的制作 和新基因的染色体定位。
3. EST序列可以作为基因特异性探针，对组织特异性基因表达的研究具有
重要的作用。
4. 这些新的EST丰富了表达序列标签数据库，并可以最大限度地利用公开 的表达序列标签数据库信息，大大缩短克隆新的全长互补脱氧核糖核酸的周期 并可减少克隆的成本，加快蜜蜂的生物信息积累较薄弱的基因克隆进度。
5. EST还可进行新基因的遗传迸化关系分析。EST可以对所有动物的基因 作为一种标签库，通过不同的序列比较可以获得保守序列片段，从而获得基因 的遗传进化图谱。
除了以上5点外，本发明在蜂学领域的主要技术效果还有
1. 可广泛应用于中蜂及同属蜜蜂相关基因的表达分析、种质鉴定和功能基 因挖掘。
2. 可应用于蜜蜂抗蜂螨、抗胡蜂和抗微生物疾病品种的筛选及功能基因的筛选。
3. 可应用于蜂王浆、蜂蜜生产性能的评价。
图1是中蜂头部总RNA甲醛变性凝胶电泳检测图2是中蜂头部cDNA琼脂糖凝胶电泳检测图，其中，A是MA标准分子量， B是cDNA片段；
图3是中蜂头部cDNA文库插入片段的PCR产物电泳图，其中，M是标准分 子量；图4是中蜂头部EST片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图，其中，M 是标准分子量-，
图5是中蜂头部表达序列基因芯片点阵设计图，-图6是中蜂头部表达序列基因点阵实样图7是中蜂头部表达序列基因芯片与样本杂交前芯片扫描图； 图8是中蜂头部C表达序列基因芯片与样本杂交后扫描图9是中蜂头部表达序列基因芯片与样本杂交后扫描数据分析散点图。
具体实施例方式
本发明分离出的中蜂头部cDNA表达序列标(EST)具有SEQIDN0.1 SEQ ID NO. 718所示的序列。所说的cDNA序列具有SEQ ID N0.1 SEQ ID NO. 718所示的序列中的一条或数条的组合。cDNA序列包括SEQIDN0.1 SEQID NO. 718所示的序列中每条序列的互补序列或同源序列。cDNA序列包括SEQ ID NCU SEQ ID NO. 718所示的每条序列中的8 100个连续核苷酸为探针的 序列或其互补序列。上述序列标签所组成的基因芯片是在载体上结合有SEQ ID NO.l SEQIDNO. 718所示的序列、同源序列或其互补序列的核酸分子。载体 为固相载体或液相载体。固相载体为玻片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维膜、凝胶。 所说的核酸分子是脱氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸。
芯片的具体制备方法和步骤如下
1. cDNA文库构建
用油漆笔标记当日羽化的中蜂工蜂，在1、 3、 4、 5、 7、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27和30日龄期进行回捕，-80°。保存。分别从每个日龄工蜂样品取10 个头部，加液氮匀浆，加TRIZOL进行总RNA提取。用试剂盒分步纯化出mRNA， 合成cDNA第一链和第二链。然后用末端补平酶将双链cDNA末端补平，加上 五o^I接头并将其磷酸化，再经J^oI酶切处理，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴 定，再用MinElute Gel Extraction试剂盒进行凝胶回收。
将cDNA与载体pBluescriptn SK(+)相连，用电击反应法转化五.co/Z DH10B 感受态菌，加SOC培养基，37匸摇床复苏1 h,取50 fiL菌液涂布含有IPTG/X-gal 的LB培养基，37'C培养过夜。从生长转化菌的平板上随机挑取若干个菌落，培 养，抽提质粒，采用M13通用引物进行PCR扩增鉴定文库质量。
2. cDNA文库测序
从文库挑取单克隆接种在含LB培养基的96孔板，37t:培养18小时左右，提取质粒作为模板，用通用引物M13进行PCR扩增，样品经纯化后放入
Megabace 1 000中进行测序，得到SEQ ID NO.l ~SEQ ID NO. 718所示的基因序 列。
3. EST功能注释、芯片用EST筛选与数据库构建
利用浙江大学生物信息服务平台服务器进行EST片段处理和拼接，phmp 软件作有效性处理.。选出具有独立功能的Contig、 Siglet序列，用Ontology (GO) 和Blast软件进行功能注释。用DNAstar软件选出与Contig、 Siglet序列相匹配 的EST代表性序列。在此基础上建立初步的EXCEL芯片EST数据库。
4. EST片段PCR扩增与纯化
根据候选EST序列编号査找出相应的文库，挑取质粒，进行浓度测定和稀 释后作为模板，采用引物M13作PCR扩增、电泳检测。PCR产物用乙醇沉淀 法进行纯化、冷冻干燥，后完加入相应体积的50%二甲基亚砜(DMSO)，通过 紫外浓度检测，使溶解后的PCR产物终浓度为500 1000 ng/^iL。
5. 芯片设计
将实际得到的718个EST片断，以及阳性对照、空白对照，进行矩阵分布设 计，并在初步的EXCEL芯片EST数据库的基础上，编辑好与芯片矩阵相对应 的数据库。芯片矩阵分布的具体要求是每张基因芯片设置3个相同的杂交矩 阵，区间距为12.5mm，每个矩阵含40X40个点，分为4个亚矩阵，每个亚矩 阵点样密度为20列X20行。每个探针重复点样2次，点直径为100nm，点间 足巨200 pm。
6. cDNA芯片点制
将溶解好的PCR产物用Omnigrid接触式芯片点样仪进行点样。点样完毕后 在400mJ能量下用紫外交联仪中进行交联、晾干，抽样进行扫描检测。
7. 芯片质量检测.
随机抽取1张基因芯片用GenePix 4100A芯片扫描仪进行扫描检测点样的均 匀性与信号差异。
8. 杂交样品制备和杂交应用试验
分别用Trizol提取处理和对照蜜蜂总RNA，采用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光 标记，与芯片进行杂交处理。然后用GenePix4100A芯片扫描仪扫描芯片记录杂 交信号，标准化处理后，检测信号的有效性。采用图片分析软件GenePixPro5.0 对扫描结果进行定量分析。对标准化后的数据作M (荧光强度比值的对数值)-A (总荧光强度对数值)散点图，评估芯片杂交质量，判断二者的相关性。
中华蜜蜂头部表达序列基因芯片用于生物功能的研究和检测。所说的生物包括动物(昆虫、蜜蜂)以及它们的细胞、组织器官及其系统；所说的生物功 能的研究包括药物、动物的抗逆性、育种和新品种的产生、杂种优势的早期预 测、动物生长和发育的机理和药物的毒理学；所说的生物功能的检测包括转基 因动物的安全性检测、食物成分的功能性评估、病原体的检测和诊断、物种的 鉴定。
本发明通过采用原产中国的中华蜜蜂工蜂头部总RNA，反转录成cDNA后建 立文库，然后抽提质粒，采用通用引物进行表达序列标签测序，用生物信息软 件进行EST片段处理和拼接，有效性处理。选出具有独立功能的Contig、 Siglet 序列，进行功能注释，选出与Contig、 Siglet序列相匹配的EST代表性序列，进 行PCR扩增和检测。建立初步的EXCEL芯片EST数据库。将PCR得到的718 个EST片断，以及阳性对照(已测全序列的一条Mrjp-l前体DNA)、空白对照， 进行矩阵分布设计。然后以经氨基修饰的玻璃片基作为载体，用芯片点样仪进 行点样，紫外交联。该芯片每张含3个相同的杂交矩阵，区间距为12.5mm，每 个矩阵含40X40个点，4个亚矩阵，每个亚矩阵点样密度为20列X20行。使 每个探针重复点样2次，点直径为100pm，点间距200 pm。经扫描检测，芯片 样探针点均匀，信号差异小。分别用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光标记的处理和 对照蜜蜂cDNA样本，与芯片进行杂交处理。然后用芯片扫描仪扫描芯片记录 杂交信号，标准化处理，检测信号的有效性。采用图片分析软件对扫描结果进 行定量分析。对数据作M散点图评估，显示杂交信号可靠，出现假阳性的可能 性低。本发明芯片包含了中蜂脑的主要DNA信息，适用于生物，包括动物(昆 虫、蜜蜂)以及它们的细胞、组织器官及其系统的生物的功能研究，包括药物、 动物的抗逆性、育种和新品种的产生、杂种优势的早期预测、动物生长和发育 的机理和药物的毒理学；检测包括转基因动物的安全性检测、食物成分的功能
性评估、病原体的检测和诊断、物种的鉴定；特别是适用于中蜂及同属蜜蜂相 关基因的表达分析、种质鉴定和功能基因挖掘，具有广阔的应用前景。
本发明根据附图和实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更 加明显。
实施例1: cDNA文库构建
参考Robinson实验室的方法(Charles W W, Mark R B， Maria F B, Charu G K " a丄Genome Research. ， 2002， 55: 555-566)，用油漆笔标记当日羽化 的工蜂，在l、 3、 4、 5、 7、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27和30日龄期进行回 捕，每个日龄分别回捕100头以上，迅速剪取头部后用液氮冻存，随后-80。C保 存。分别从冻存的每个日龄工蜂样品取10个头部，共130头，加液氮匀浆，然后加TRIZOL进行总RNA提取。用P/。甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的完整性，从 中蜂头部提取的总RNA的1%甲醛变性凝胶电泳检测结果(图1)可见，28S、 18S 条带十分清晰，表明所提取的总RNA完整，基本无降解。紫外分光光度计检测 结果，提取的总RNA的OD260/280值为l.卯，表明纯度较高，符合建库要求。
用PolyATtract mRNA Isolation System II Kit olyATtract mRNA Isolation System II试剂盒纯化mRNA。用pBluescript II XR cDNA Library construction试 剂盒合成cDNA第一链和第二链。由cDNA琼脂糖凝胶电泳结果(图2)可见， 本实验所合成的双链cDNA片段为数条清晰的条带，片段集中区在0.2 4 kb之 间，表明均一性良好。
然后用末端补平酶将双链cDNA末端补平，加上五coR I接头并将其磷酸化， 再经^o/I酶切处理，酶切产物采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后用MinElute Gel Extraction试剂盒进行凝胶回收。
参考黄晓和周荣家的方法(动物学报，1998， 44 (2): 237~238)，将cDNA 与载体pBluescript II SK(+).相连，连接反应物用电击反应法转化￡. co// DH10B 感受态菌，加1 mLS.O.C培养基，在37"C摇床复苏lhr，最后取50 菌液涂 布含有IPTG/X-gal的LB培养基，37。C培养过夜，计数长出的阳性克隆，计算 文库滴度。对所建cDNA文库平板菌落统计结果，50^1 cDNA的转化产物可产 生400个左右的阳性克隆，文库的滴度约为8xl04pfo/mL。
从生长转化菌的平板上随机挑取32个菌落，扩大培养，抽提质粒，采用 T7/M13通用引物，艮P: 5，端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG，和3，端 引物GGAAACAGCTA TGACCATGA进行PCR扩增鉴定，PCR反应参数为95 。C预变性4分；95。C变性30秒，55X:退火45秒，72。C延伸1分，35个循环； 72保温10分；扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。对随机挑取32个阳性 克隆的PCR扩增产物作琼脂糖凝胶电泳，结果(图3)显示插入片段分布均匀， 大小在0.5 3 kb之间，32个克隆的PCR产物泳道中有3条空白，由此得文库 重组率为90.6°/0。
实施例2:文库测序分析和数据库构建
中蜂cDNA质粒克隆由浙江大学沃森基因组研究院测序，使用M13正向 引物，由3'端测序。其主要方法是从文库挑取单克隆接种在含LB培养基的96 孔板，37°C培养18小时左右，提取质粒作为模板，用通用引物M13进行PCR 扩增，样品经纯化后放入Megabace 1000中进行测序。结果共获得1，3392条EST， 通过phrap软件作有效性处理，去除序列中的载体序列，修正3，端测出序列中 的模糊碱基，将片段长度小于100 bp的EST序列视为无效。共得到平均长度大于500bp的高质量EST共8569条(表l)。
利用浙江大学生物信息服务平台服务器进行EST片段处理和拼接，选出具有独立功能的Contig (由多个EST拼接而成)、Siglet (为单一EST片段)序歹廿，用Ontology (GO)和Blast软件进行功能注释，用DNAstar软件选出与Contig、Siglet序列相匹配的EST序列(每条Contig选2-3条覆盖全长的代表性EST),在此基础上建立EXCEL芯片EST数据库。通过CAP3软件处理，共拼接出217条Contig、 788条Singlet (表1)。
表1中蜂脑EST序列分析
高质量EST
8569
Contig217
> 40 ESTs11
>脂ESTs6
> 500 ESTs2
>1000 ESTs1
Singlet788
在前述基础上，采用DNAstar软件从8569条EST筛选出1025条可用于点芯片的候选EST。根据候选EST序列编号查找出相应的文库，挑取质粒，进行浓度测定和稀释，采用引物M13作PCR扩增。经PCR扩增和电泳检测，有718条EST获得高质量PCR产物(见实施例3)，将这些ESTs与GenBank西方蜜蜂和果蝇数据库(截至2008年7月)用Blastn进行搜索，得到的Blast最高分值，概率以及同源序列长度和功能识别描述，按芯片阵列要求，编辑成EXCEL数据库，并用Ontology (GO)进行功能注释，主要EST功能信息见表2。
表2中蜂头部表达序列基因芯片探针组成
功能分类
探针
功能分类
探针
/1 me/啡ra genomic contigAme//!y^ra linkage group 1genomic contig/4.膨/咏ra linkage group 2genomic contigAwe/映ra linkage group 3genomic contig
58
51
47
21
CG4696-PACG4720-PA
Carboxylesterase
Defensin/royalisinprecursor
22
2A.mellifera linkage group 4
genomic contig
A,〃^ra linkage group 5
genomic contig
j,,//^ra linkage group 6
genomic contig
linkage group 7
genomic contig
y4.we〃i/fera linkage group 8
genomic contig
」./ne〃^fera linkage group 9
genomic contigAme/騰ra linkage group 10genomic contig
linkage group 11genomic contigj.we//z/era linkage group 12genomic contigylme/啡ra linkage group 13genomic contigv4.脂/映ra linkage group 14genomic contigA膨〃^ra linkage group 15genomic contigy4.me/啡ra linkage group 16genomic contig
Apisimin
Apisimin precursor
ADP/ATP translocase
Alpha-amylase
Alpha-glucosidase
22 ENSANGP00000013101 1
51
25
12
83
19
2
31
ENSANGPOOOOOO 18891 4
32 ENSANGP00000022830 2
Elongation factor-1alpha F2
32 Glucose dehydrogenase 1
Glucosylceramidaseprecursor
31 Glucose oxidase
Heat shock cognate 70protein
Long-wavelengthrhodopsin
19 Mrjp
26 Ribosomal protein L8
48 Transferring
11 Venom protein 2
60S acidic ribosoma
3
protein PI
60S acidic ribosomal
1
protein P2
阳性对照阴性对照
空白对照
7
2
23
2
2
2
2
411Antennal-specific protein 3c 一 ，,
1 其他 57precursor_____
实施例3 :基因芯片的制备
一、 提取质粒
吸取lmL含Amp的LB培养液，加入到96孔培养板，接种5 uL侯选EST的克隆菌液，在150rpm、在150rpm、 37。C下培养16-18 h;按以下步骤提取质粒
a) 菌液离心4000rpm， 5 min，弃上清；
b) 加入预冷的溶液IIOO PL,剧烈震荡悬浮；
c) 加入溶液I1200 uL，颠倒混匀，冰浴5min;
d) 加入预冷的溶液m 150 liL，倒置后，温和震荡10s，冰浴5min;
e) 4°C ， 4000 rpm，离心15 min;
f) 转移400 WL上清至深孔板，4°C， 4000 rpm，离心15 min;
g) 转移300 WL上清至深孔板，加等体积的异丙醇混匀，4°C， 4000rpm，离心40min，弃上清；
h) 用70%乙醇洗涤，4°C， 4000 rpm，离心15 min;
i) 去上清，超净台干燥，至无异味；j)加入50wL的去离子水，溶解沉淀。
取luL用紫外分光光度计测定质粒浓度，然后取3uL进行琼脂糖凝胶电泳检测。质粒板-2(TC保存备用。
二、 探针的PCR扩增
在实施例2的基础上，根据候选EST序列编号查找出相应的文库，挑取质粒，进行浓度测定和稀释，采用引物M13作PCR扩增(美国MJResearch公司，DNAEngine Tetrad温度梯度PCR仪)。PCR体系(lOOpL): 10 XPCR Buffer 10 ^L，dNTP2pL，正向和反向引物各1mL， r叫酶l〖iL，模板lpL， ddH2085 pL<^l]于96孔板)。PCR反应参数94。C预变性4min; 94。C变性30s， 56。C退火40s，72。C延伸10min， 30个循环；72。C保温10min。反应结束后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。经电泳检测，PCR产物片段大小在200 1500bp。
三、 PCR产物处理1， PCR产物纯化
(1)将PCR扩增产物转移到0.5 raL印pendorf管中；(2)向eppendorf管中加入2X体积(200uL)无水乙醇，然后加入PCR产物，混匀；(3)用铝箔纸封口，轻微离心，置于-20。C放置过夜，充分沉淀；(4) 4°C， 12000 rpm，离心20min; (5)弃上清，eppendorf管倒置于吸水纸上，去除残余乙醇；(6)加入2X体积70。/。乙醇洗涤；(7) 4'C， 12000卬m，离心5 min; (8)去上清，超净台干燥；(9)将沉淀溶于适量去离子H20，移入96孔板的相应孔内。2. PCR产物的干燥、检测和稀释(1)用ND-1000紫外分光光度计对所有纯化产物的浓度进行测定，并根据其体积，计算出相应的核酸含量。同时再次电泳检测。结果纯化产物条带清晰(代表性电泳结果见图4)，紫外分析0026。/28。值在1.7 2.0，表明纯度较高，符合点制芯片质量要求。(2)将纯化产物移入384孔板内的项应孔内，放入Alphal-5真空冷冻干燥机中，进行真空干燥。待样品完全干燥后，小心取出样品，封上铝箔纸，轻微离心，将核酸粉末甩至管底。(3)干燥完毕后加入相应体积的50%二甲基亚砜(DMSO)， PCR产物终浓度控制在500 1000ng^L。 384孔板轻微离心后，封上铝箔纸，置脱色摇床上使PCR产物充分震荡溶解。。
四、 芯片制备
将实际得到的718个EST片断，以及阳性对照、空白对照，进行矩阵分布设计(图5)，并在初步的EXCEL芯片EST数据库的基础上，编辑好与芯片矩阵相对应的数据库。芯片矩阵分布具体要求是每张基因芯片设置3个相同的杂交矩阵，区间距为12.5mm，每个矩阵含40X40个点，分为4个亚矩阵，每个亚矩阵点样密度为20列X20行。每个探针重复点样2次，点直径为100 (im，点间距200 pm。按照设计的中蜂脑cDNA芯片矩阵排列图顺序。将探针溶液转移至384孔板中，固定两小时，避光保存备用。实际点样结果为每个亚矩阵点样密度为20列X 18行,4个亚矩阵，本每个矩阵1440点，其中4点为空白。
cDNA芯片采用Omnigrid接触式芯片点样仪进行点样。microarry载体为氨基修饰的玻璃片基(25mmX75mm，购自美国Coming公司)。点样完毕后在400mJ能量下用紫外交联仪中进行交联，最后用吸耳球吹净玻片表面，室温放置30min晾干，保存于干燥暗室备用，完成了芯片制备(图6)。
五、 芯片质量检测
1. 杂交前监测
中蜂脑cDNA基因芯片点制完成后，随机抽取1张基因芯片用GenePix4100A芯片扫描仪进行扫描检测，以检查点样质量。图7为芯片上4个亚矩阵之一的点阵扫描图像，由该图像可见，芯片点样点形状规则，直径为80±20%，荧光背景低，无连点，重复点大小形状基本上一致，信号差异系数大于0.33的低于30%，点样成功率超过99%。
2. 杂交检测和应用试验(1) 探针制备和杂交应用试验
以中蜂和意蜂脑为样本，用Trizol提取总RNA，采用RNA Fluorescence Labeling Core Kit(TaKaRa)标记总RNA，荧光基团分别为Cy3-dCTP和Cy5-dCTP。 将纯化后的荧光探针溶解在5 nL杂交缓冲液中。98。C变性2min，迅速置于冰上 冷却，然后向探针中加入等体积的杂交缓冲液混匀。将混合液滴加于杂交区内， 用盖玻片覆盖，置于密闭杂交仓内，42。C水浴18h。杂交结束后，依次用lxSSC、 0.20/。SDS， O.lxSSC、 0.2%SDS， O.lxSSC清洗，最后在室温下浸入去离子水中， 洗涤lmin。迅速转入50 mL空离心管中，1500 rpm离心l min，甩干芯片。
用GenePix4100A芯片扫描仪扫描芯片，杂交芯片上大部分靶点的杂交都呈 现出一定的杂交信号，芯片上的各个矩阵及其靶标点，排列均匀整齐，形状规 整，荧光背景较低，矩阵间的重复性较好。阳性对照点杂交信号较强，空白对 照无杂交信号，表明芯片的点制效果良好(图8)。经标准化处理后，有效数据 占总数的90%以上，符合分析要求。
(2) 扫描与数据分析
采用图片分析软件Gene Pk Pro5.0对扫描结果进行定量分析。首先经过自动 和人工定位与排列，圈定每个杂交点的范围，然后用该软件读出荧光信号强度。 由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需要对输出结果进行标准化 处理，以消除由于两种荧光强度不均引起的误差。将阳性对照的荧光信号强度 比中值(Ratio值)设定为l，由此得出标准化系数，对输出结果进行标准化处理。 对标准化后的数据作M (荧光强度比值的对数值)-A (总荧光强度对数值)散 点图，从而评估芯片杂交质量，判断二者的相关性，其中M二log2Cy5/Cy3， A=l/21og2 (Cy5XCy3)。
M-A散点图是评估芯片杂交质量的一种方式，它可以反应荧光信号强度比 值是否随信号强度的变化而变化。从图9可见，信号点在M=0轴上下两侧分布 比较均匀，说明杂交信号可靠，荧光信号比值不受荧光强度的影响，出现假阳 性的可能性低。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的 精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发 明的保护范围。
权利要求
1. 一种中华蜜蜂头部表达序列基因芯片，其特征在于，它主要由载体和结合在载体上的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.718所示序列、及它们的同源序列和互补序列的核酸分子组成。
2. 根据权利要求1所述的中华蜜蜂头部表达序列基因芯片，其特征在于所述载 体为固相载体或液相载体。
3. 根据权利要求2所述的中华蜜蜂头部表达序列基因芯片，其特征在于，所述固 相载体为玻片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维膜或凝胶。
4. 根据权利要求1所述的中华蜜蜂头部表达序列基因芯片，其特征在于，所述核 酸分子是脱氧核糖核酸、核糖核酸或多聚寡核苷酸。
5. —种权利要求1所述中华蜜蜂头部表达序列基因芯片在生物功能的研究和检 测方面的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述生物包括动物、动物细胞、动 物组织器官及系统。所述生物功能的研究包括药物、动物的抗逆性、育种和新 品种的产生、杂种优势的早期预测、动物生长和发育的机理和药物的毒理学。 所述生物功能的检测包括转基因动物的安全性检测、食物成分的功能性评估、 病原体的检测和诊断、物种的鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种中华蜜蜂头部表达序列基因芯片及其用途，该基因芯片主要由载体和结合在载体上的SEQ ID No.1～SEQ ID No.718所示序列、及它们的同源序列和互补序列的核酸分子组成。本发明的基因芯片包含了中蜂脑的主要DNA信息，适用于生物以及它们的细胞、组织器官及其系统的生物的功能研究，特别是适用于中蜂及同属蜜蜂相关基因的表达分析、种质鉴定和功能基因挖掘，具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101481731SQ200810163619
公开日2009年7月15日 申请日期2008年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者丁美会, 张伟光, 张传溪, 张瓅文, 李红亮, 杨喻晓, 沈立荣, 洪旭涛, 程家安, 凤 金, 高其康 申请人:浙江大学