专利名称：：苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黄萎病的方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及一种苜蓿抗菌肽基因，以及应用该苜蓿抗菌肽基因提高棉花抗黄蒌病的方法。
背景技术：
：棉花黄萎病是严重影响棉花生长与产量形成的重要病害。棉花黄萎病的病源菌是大丽轮枝菌和黑白轮枝菌，1914年在美国的弗吉尼亚州发现，现在已经传播到中国、前苏联、澳大利亚、保加利亚、希腊、秘鲁、巴西、阿根廷、以色列、伊拉克、伊朗、印度、西班牙等三十多个国家和地区。我国棉黄萎病于1935年从美国引种传入，先后在陕西泾阳、山西运城、山东高密和河南安阳等地发生危害。20世纪70年代以后，全国已有12个省市(区)发生棉黄萎病，主要分布于黄河流域棉区。1993年棉黄萎病在全国大暴发，发病面积达267万hm2。20世纪90年代中期以后，在以新疆为主的西北内陆棉区扩展速度较快，据不完全统计，该棉区的70-80%棉田已有黄萎病出现。1997年全国因黄萎病减产10.7%，损失皮棉43万t，价值人民币60.5亿元。至2002年全国统计棉黄萎病发病面积已达300万hm2，占我国总棉田面积的一半以上。黄萎病的病原菌非常容易传播，能随空气、种子、土壤颗粒、作物残枝、流水及农具等到处传播。病原菌能够在作物病残体上、甚至直接在土壤中长期存活达十几年之久，且可以常年积累。目前，最有效的防治办法就是在种棉花之前，用化学试剂处理棉种和菌土。这种防治手段不但增加棉农的种植成本，而且有农药残留，对环境和人体健康造成很大的威胁。由于黄萎病是维管束病害，棉株一旦被病菌侵染，没有任何有效治疗手段。因此，防治棉花黄萎病最为经济、安全、有效的办法就是培育和推广抗病品种。传统的常规育种曾经育出不少抗性品种，为我国的棉花发展做出很大贡献。但由于病菌小种一直不断在发生变异，病菌的传播导致了大部分病田是多种病菌小种混生，原有的抗性品种已经不能满足生产的需要，2003年我国棉花黄萎病又严重发生，造成棉花大面积减产。由于现有的陆地棉栽培品种的遗传基础狭窄，常规的杂交育种使得棉花品种间的遗传变异越来越小，对棉花性状的改良越来越难。有些海岛棉和野生棉品种中有抗黄萎病基因，但是从种间和亚种间杂种选出可以适宜推广的高产品种非常困难。利用基因工程技术将外源基因导入棉花，为棉花育种提供了新的育种途径。目前，导入棉花的抗黄萎病基因有几丁质酶基因、(3-1，3葡聚糖酶基因、天麻抗真菌蛋白基因、葡萄糖氧化酶基因等，转化后代都有一定的抗性提高，但到现在为止，还没有一个转基因抗性品种被报道。因此，寻找新的抗黄萎病基因，将其转化到棉花基因组中，获得能应用于生产的转基因品种，仍然迫在眉睫。苜蓿抗菌肽是从苜蓿种子中发现的一种新的抗菌蛋白质，具有抗晚疫病(由大丽轮枝菌引起)的能力，以及具有抵抗黑胫病菌、赤星病菌入侵的能力。实验还证明，纯化的苜蓿抗菌肽还能抑制黄色镰刀菌、番茄早疫菌等的生长和繁殖。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黄萎病的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种苜蓿抗菌肽基因，它具有SEQIDNO.l所示的基因序列。一种提高棉花抗黄萎病的方法，包括以下步骤；(1)提取苜蓿种子的RNA，反转录为cDNA，根据抗菌肽序列设计引物，以cDNA为模板克隆苜蓿抗菌肽基因。(2)将克隆到的苜蓿抗菌肽基因连接到中间载体pMD19中，测序分析，得到SEQIDNO.l所示的基因序列。(3)将测序后的苜蓿抗菌肽基因连接到植物表达载体质粒pCAMBIA1301中，形成重组质粒pCAMBIA1301-antiVD。(4)将重组质粒pCAMBIA1301-antiVD转化到农杆菌LBA4404中。通过农杆菌介导法将苜蓿抗菌肽基因导入棉花。经农杆菌菌液浸染的棉花下胚轴切段在选择培养基上诱导抗性愈伤组织，经过继代培养，诱导出胚状体，胚状体发育成苗。本发明的有益效果是本发明通过农杆菌介导法将外源抗菌肽基因导入棉花基因组，结果部分转基因植株的抗黄萎病能力得到提高，为抗黄萎病育种创建种质材料。可为其它作物的黄萎病研究提供参考，具有重要的理论和实践意4义。图1中，(a)是苜蓿抗菌肽基因的PCR扩增产物电泳图，(b)为苜蓿抗菌肽基因连接入载体后经PstI和BamHI双酶切后的电泳图，其中，M为DL2000分子量，1为PCR扩增的alfAFP基因，2为双酶切空质粒pMD-19载体，3为双酶切pMD-19-antiVD载体；图2是植物表达载体pCAMBIA1301-antiVD的结构简图，图中，LB:左边界，RB:右边界，Nos:胭脂碱合成酶基因终止子，GUS:(3-葡萄糖甘酸酶，CaMV35S:N烟草花叶病毒35S启动子，Hygromycin:潮霉素磷酸转移酶.CaMV35SpolyA:35S终止子；图3是农杆菌介导棉花下胚轴遗传转化及再生苗的生长发育过程照片，其中，a、农杆菌介导下胚轴后抗性愈伤的诱导，b、胚性愈伤，c、球形胚，d、子叶胚，e-f、移栽到温室的再生植株，g-j、再生植株的开花、结铃和吐絮；图4是50mg/L潮霉素涂抹对照植株的叶片和转基因植株的叶片照片，其中，左边是对照植株的叶片，右边是转基因植株的叶片；图5是接种50ml大丽轮枝菌后，病原菌在对照植株和转基因黄萎病免疫植株维管束中的繁殖照片，其中，(a)是病原菌在对照植株维管束中的繁殖，(b)是病原菌在转基因黄萎病免疫植株维管束中的繁殖。具体实施例方式本发明提高棉花抗黄萎病的方法，包括以下步骤1.提取苜蓿种子的RNA，反转录为cDNA，根据抗菌肽序列设计引物，以cDNA为模板克隆苜蓿抗菌肽基因(朋"TZ))。其中，上游引物5'-GCCGGATCCATGGAGAAGAAATCACTAGCTG-3';下游引物5'画CGGCTGCAGTTAACATCTTTTAGTACACCAGCAG-3'。2.将克隆到的苜蓿抗菌肽基因连接到中间载体pMD19中，用于测序分析，得到SEQIDNO.l所示的基因序列。3.将测序后的苜蓿抗菌肽基因连接到植物表达载体质粒pCAMBIA1301中，形成重组质粒pCAMBIA1301-antiVD。4.将重组质粒pCAMBIA1301-antiVD转化到农杆菌LBA4404中。通过农杆菌介导法将苜蓿抗菌肽基因导入棉花。经农杆菌菌液浸染的棉花下胚轴切段在选择培养基上诱导抗性愈伤组织，经过继代培养，诱导出胚状体，胚状体发育成苗。下面根据实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。实施例1、材料植物受体材料为自育品系棉花5983，该品种有优良的农艺性状，较高枯萎病抗性，但黄萎病抗性较差。试验所用的质粒为pCAMBIA1301(由本实验室保存)，该质粒的T-DNA区含有在植物中表达的GUS基因和潮霉素抗性基因，基因的表达均是由CaMV35S启动子驱动。其中GUS基因含有内含子，只能在真核生物中表达。另外，在该质粒的多克隆位点处连接了CaMV35S启动子和终止子，外源基因在质粒的多克隆位点插入后可利用该启动子和终止子。试验所用的农杆菌菌株是根癌农杆菌菌株LBA4404(由本实验室保存)。2、PCR扩增目的基因提取苜蓿种子的RNA。参照SMARTTMPCRcDNASynthesisKit(Clontech,PaloAlto，CA，USA)试剂盒操作说明将RNA反转录为cDNA。根据抗菌肽(antiVD)的序列，用引物设计软件Primer5.0设计引物。上游引物5'-GCCGGATCCATGGAGAAGAAATCACTAGCTG-3'和下游引物5'-CGGCTGCAGTTAACATCTTTTAGTACACCAGCAG-3'。引物两端分别是BamHI和PstI两个酶切位点序列。以反转录的cDNA为模板，扩增基因序歹i」，扩增片段为237bp。PCR反应为94。C预变性5min;94。C变性30s，46。C退火30s，72。C延伸30s，30个循环；72"C延伸10min。PCR产物经琼脂糖电泳、凝胶成像仪拍照记录后用凝胶回收试剂盒(TaKaRa，AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0)回收目的条带。3、目的基因的克隆和测序将目的基因连接到载体pMD-19中，该载体含氨苄青霉素抗性并可进行蓝白斑筛选(Takara)。10yl反应体系如下pMD-TEasy载体回收的DNA片段0.1pmol-0.3pmo1Ligationmix5^1去离子水补足10pl用移液器吹打连接反应液使之混匀后，16'C孵育30min。将连接好的质粒6转化到大肠杆菌DH5a，挑选白斑，在含有50mg/L的LB培养基中培养。测序分析，得到SEQIDNO.l所示的基因序列。。4、目的片段与双元载体连接和基因的转化用BamHl和PstI酶切T-载体，电泳，回收目的片段。用BamHI和PstI酶切质粒pCAMBIA1301，电泳，回收已经切开的质粒。ddH209lU;目的基因片段6u1;pCAMBIA13012u1;T4DNAligasebuffer2ul;总体积共20iU。轻轻混匀后于16。C温育lh。将连接产物转化DH5a感受态细胞。经转化的细菌涂于含50mg/L潮霉素的固体LB培养基平板上，37"C过夜，用牙签挑取单菌落，在含5ml含50mg/L潮霉素的液体LB培养基中37'C过夜，用SDS碱裂解法小量制备质粒，PCR鉴定。结果在以阳性克隆为模板的扩增反应中均扩增出阴性对照没有的237bp大小的目的基因片段(antiDV)。提取质粒DNA，转化入农杆菌LBA4404感受态细胞，进行PCR鉴定。利用农杆菌介导棉花下胚轴的基因转化体系，将目的基因转入棉花。将含有表达载体的农杆菌接种于YEB培养基(含潮霉素50mg/L)，28'C震荡培养至OD600-0.5-0.7，室温离心10分钟(3000rpm)。沉淀用LS液体培养基(Ph5.8)悬浮。取5-7天无菌苗下胚轴切段(3-5mm)，在制备好的菌液中浸泡10-15min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的共培养基(LS培养基中含0.1mg/LKT，0.2mg/L2，4-D，30g/L葡萄糖，7.5g/L琼月旨，pH5.8)中，21°C黑暗条件下共培养60h。接着转移到抗性愈伤诱导培养基(MSB培养基中含O.lmg/LKT，0.2mg/L2，4-D，40mg/L潮霉素，300mg/L羧卡，pH5.8)培养3周，诱导抗性愈伤。将抗性愈伤继代到含20mg/L潮霉素和300mg/L羧苄的MSB培养基上增殖培养，3周/欠，继代2次。将抗性愈伤组织接入分化培养基(MSB培养基中含0.3mg/LKT，0.5mg/LIBA,20mg/L潮霉素，300mg/L羧苄，30g/L葡萄糖，7.5g/L琼脂，pH5.8)，用于胚性愈伤组织的诱导和体细胞胚的分化和成熟。在不加抗生素的体细胞胚的萌发培养基(1/2MSB培养基中含0.5mg/LNAA，30g/L葡萄糖，7.5g/L琼脂，pH5.8)中生长成小苗。最后得到15株再生植株。直接移栽到温室。5、转化体的潮霉素抗性检测用50mg/L的潮霉素涂抹转抗病基因再生植株，7-10d后观察涂抹部位的颜色。黄色或枯斑为非转基因植株，绿色为转基因植株。结果表明，在15株转化植株中，有3株在涂抹处有枯斑，与对照表现相同。有12株涂抹的叶片依然保持绿色。因此，推测这12株为转基因植株。6、转基因植株的分子检测7采用CTAB法提取抗潮霉素再生植株和对照植株基因组DNA，用antiVD基因引物对转基因植株进行PCR检测，以质粒pCAMBIA1301-antiVD为阳性对照，以对照植株DNA为阴性对照。结果表明，12个植株的DNA都扩增出与阳性对照一样大小的目的片段，而阴性对照没有目的条带扩增出来。初步说明这12株再生植株为转基因植株，分别命名为Z1至Z12。用PstI单酶切PCR阳性转基因植株和对照植株的基因组DNA，经酶切和电泳分离后，转移到尼龙膜上，以质粒pCAMBIA1301-antiVD为阳性对照，用antiVD基因片段做探针进行Southern印迹杂交。检测结果表明，阴性对矗没看检测到杂交信号。阳性对照有很强的杂交信号。12个PCR阳性转基因植株都有杂交信号，其中6个植株是单拷贝，6个植株有2个拷贝。Southern印迹结果说明目的基因己经成功的转入这12个再生植株基因组中。因为大丽轮枝菌主要是从根部侵入棉花植株，如果抗病基因能在根部大量袭达，则大丽轮枝菌侵染棉花的机会就会减少很多。因此，我们主要是关心这个基因在转化植株根部的转录。提取Southern印迹阳性植株的根部RNA，结果表明，RNA电泳后有明显的两条主带28S和18S，无降解现象。分光光度计测定浓度后，可用于Northern杂交。杂交结果表明antiDV基因在根部大量表达。7、转基因棉株抗病性检测为了研究转基因植株对棉花黄萎病的抗性，在棉株移栽30天后，将50ml菌液倒入转基因植株和对照植株的根部。分三个时期调査植株的发病情况。调查结果如表1所示，有5株(Zl、Z4、Z5、Z10和Zll)转化植株在整个生育期没有发病症状。其余7株有不同程度的发病，且随着植株的生长，发病情况愈来愈严重。到成熟期，有3株发病级别为1级(Z3、Z6和Z7)，有3株发病级别为2级(Z2、Z3和Z12)，有1株发病级别为3级(Z9)。这个结果与转基因植株抗病性的离体分析结果基本吻合。植株提取液抑菌活性高的植株，在本试验中的发病级别低。8表1用大丽轮枝菌接种后对照(C)和转基因(Z1-12)植株的发病级别:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>为了证实转基因植株抗病性的提高与病源物大丽轮枝菌在植株体内的繁殖减少有关，将接菌后成熟期的转基因植株和对照植株的剖杆。结果表明，对照植株茎杆的维管束中充满了大丽轮枝菌和菌丝，而转基因免疫植株中没有可见的大丽轮枝菌。因此，转基因植株抗病性的提高是由于导入了外源基因a^/DF的表达抑制了大丽轮枝菌的侵入。苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黄萎病的方法的基因序列表SEQUENCELISTING<110〉浙江大学〈120>苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黄萎病的方法<160〉1<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉218〈212>DNA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>权利要求1.一种苜蓿抗菌肽基因，其特征在于，它具有SEQIDNO.1所示的基因序列。2.—种提高棉花抗黄萎病的方法，其特征在于，包括以下步骤；(1)提取苜蓿种子的RNA，反转录为cDNA，根据抗菌肽序列设计引物，以cDNA为模板克隆苜蓿抗菌肽基因。(2)将克隆到的苜蓿抗菌肽基因连接到中间载体pMD19中，测序分析，得到SEQIDNO.l所示的基因序列。(3)将测序后的苜蓿抗菌肽基因连接到植物表达载体质粒pCAMBIA1301中，形成重组质粒pCAMBIA1301-antiVD。(4)将重组质粒pCAMBIA1301-antiVD转化到农杆菌LBA4404中。通过农杆菌介导法将苜蓿抗菌肽基因导入棉花。经农杆菌菌液浸染的棉花下胚轴切段在选择培养基上诱导抗性愈伤组织，经过继代培养，诱导出胚状体，胚状体发育成苗。3.根据权利要求2所述提高棉花抗黄萎病的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述引物包括上游引物5'-GCCGGATCCATGGAGAAGAAATCACTAGCTG-3';下游引物5'-CGGCTGCAGTTAACATCTTTTAGTACACCAGCAG-3'。4.根据权利要求2所述提高棉花抗黄萎病的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述选择培养基为抗性愈伤诱导培养基。全文摘要本发明公开了一种苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黄萎病的方法。该方法根据抗菌肽氨基酸序列设计PCR引物，以苜蓿种子的RNA为模板，反转录成苜蓿抗菌肽cDNA；以cDNA为模板克隆苜蓿抗菌肽基因；将苜蓿抗菌肽基因连接到植物表达载体质粒pCAMBIA1301中，形成重组质粒pCAMBIA1301-antiVD；然后通过农杆菌介导法将苜蓿抗菌肽基因导入棉花，在选择培养基上诱导抗性愈伤组织，经过继代培养，诱导出胚状体，胚状体发育成苗后；应用本发明的方法，转基因棉花的抗黄萎病能力得到提高。文档编号C12N15/29GK101445801SQ200810163520公开日2009年6月3日申请日期2008年12月29日优先权日2008年12月29日发明者张海平,王学德申请人:浙江大学