专利名称：捻转血矛线虫微粒体氨肽酶基因的获得方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种捻转血矛线虫浙江株微粒体氨肽 酶基因的获得方法及其用途。
背景技术：
捻转血矛线虫(/faemo"c/zwscowtom^)是牛、羊等反刍动物的主要寄生性 线虫，引起的捻转血矛线虫病每年给我国农业生产带来数以百万计的经济损 失。药物防治是控制该病的主要方法，但线虫耐药性的日益严重以及药物残留 的出现制约了己有抗线虫药物的长久使用。疫苗研制作为一种新的防治策略已 成为研究的热点。
微粒体氨肽酶Hll是一种分子量在llOkDa的完整膜糖蛋白复合物，仅在 寄生阶段的小肠微绒毛上表达。Hll属于微粒体氨肽酶家族，该复合物具有氨 基肽酶A和M活性。通过分子克隆以及序列分析，Hll基因的3个亚型已经 得到鉴定，每个分子亚型均具有膜内在蛋白质二型结构，即拥有一个短的N-末端细胞质尾巴， 一个跨膜区以及一个胞外区。
Hll具有很高的免疫保护水平，但由于体外试验还很难模拟//. coMtoWw 的寄生生活阶段，不能实现H CO"toWZ^的实验室培养，其天然提取物远不能 满足疫苗生产的需要，使得利用天然抗原提取物进行疫苗研制变得举步维艰。 因而，具有同等免疫活性的重组形式的研究具有重要的现实意义。但是到目前 为止，利用H 疫苗候选抗原的重组形式进行的免疫试验均未取得理 想效果。
Hll的重组形式仅能提供很小的免疫保护。利用重组杆状病毒转化昆虫细 胞表达的Hll的可溶性形式H11S免疫山羊，可以获得高水平的抗体，该抗体 能够与天然的Hll发生交叉反应，也能够抑制天然Hll和重组Hll的氨基肽 酶活性，但是却不能针对i/. co"tom^的感染提供有效保护。同时研究发现， 利用大肠杆菌表达Hll的活性位点区域，获得的重组蛋白以无活性的包涵体形 式存在，能够诱导山羊机体产生一定的免疫保护力，但由于免疫保护力太低， 并没有实际应用价值。利用H11活性位点区域的蛋白免疫后，产生的抗体能够 与天然H11产生交叉反应，抗体水平存在较大的个体差异，与减卵率具有一定程度的相关性。然而，该抗体却不能抑制Hll的氨基肽酶活性。昆虫细胞与大
肠杆菌表达系统获得的(部分)重组蛋白，抗原性质与酶活性具有明显的差异，
这表明抑制氨基肽酶活性并不是Hll提供免疫保护的机制。
如何提高Hll重组形式的免疫保护性成为众多学者关注的焦点，掌握Hll 启动子的活性，了解Hll转录水平或翻译水平上的调控规律或许能够为我们提 供一定的参考，而国内外目前还未见有关Hll基因组结构分析的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种获取捻转血矛线虫(//. "toWw)微粒体氨肽 酶基因的方法，也即捻转血矛线虫(H cowtoWws)浙江株Hll基因cDNA序列
以及相应基因组序列的分子生物学方法，通过以下技术方案实现
(1) //. co"toW^浙江株总RNA的抽提和Hll cDNA序列的克隆； 所述的丘浙江株总RNA的抽提和Hll cDNA序列的克隆参照
Sm他(1997)发表的//. Hl 1基因序列设计引物(见SEQNO 1和
SEQN02)，以//. co"toW^浙江株的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增。将 PCR产物与PUCm-T载体连接后，转化DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，测 序(见SEQN0 3)。
(2) Hll cDNA序列同源性比较及氨基酸序列分析；
Hll cDNA序列同源性比较及氨基酸序列分析利用生物软件DNAStar对 获得的Hll基因进行基本的特征分析，并与Smith等克隆的Hll进行同源性比 较(见SEQ NO 4)。
(3) Hll基因组序列的克隆及结构分析；
Hll基因组序列的克隆及结构分析利用DNAStar软件分析Hll及其同 源基因 T07F10.1a ( Caewor/zaW似 e/eg<ms ) 、 CBG09515 ( Caeww"/za6颠s ^/ggsae)，根据T07F10.1a、 CBG09515的内含子、外显子分布特点，参考获 得的HllcDNA序列，设计引物(见SEQN05和SEQN06)，以//. co加w加 的基因组DNA为模板，进行长距离PCR扩增，获得H11基因的部分基因组序 列，测序。按照基因步移的操作原理，参考已经获得的部分基因组序列分别设 计同向而且退火温度较高的特异性引物SP1， SP2， SP3(见SEQN07， SEQNO 8和SEQ NO 9)，与试剂盒提供的兼并引物API进行热不对称PCR反应，通 过3次巢式PCR反应完成基因序列的一次步移，获得已知序列的侧翼序列， 测序。经过5次类似的基因步移反应，获得Hll完整的基因组序列和部分5' 侧翼区序列(SEQNO 10)。利用DNAStar软件中的MegAlign分析基因组序列中的内含子、外显子组成以及5'侧翼区序列。
分离获得的捻转血矛线虫浙江株的Hll基因的cDNA序列SEQNO 3全长 2919 bp，编码972 AA，表达蛋白的分子量为110.8 KDa，等电点为6.85，与 Sm池(1997)公布的序歹lJ(GenBankNo.: X94287)比对分析，同源性为99.2%， 有5个氨基酸发生突变。
分离获得的捻转血矛线虫浙江株的Hll基因的基因组序列SEQ NO 10主 要通过基因步移的方法获得，全长14959 bp，包含25个外显子，24个内含子 以及长为1848 bp的5，侧翼序列，外显子与内含子之间通过典型的GT……AG 连接。
本发明的另一个目的在于提供所述捻转血矛线虫(Hco"toW^)微粒体氨 肽酶基因在利用重组蛋白制备亚单位疫苗中的应用。
Hll部分功能域基因的原核表达参考获得的HllcDNA序列，设计引物 (SEQNOU和SEQN0 12)，扩增Hl 1开放阅读框670bp-1710bp的部分基 因序列，命名为hps (mi partial s叫uence)。基因片段与表达载体pET-28b分 别以A^e I、屈o I酶切后构建重组表达载体pET-28b-hps，并将其转入大肠杆 菌BL21中，构建重组表达载体。重组表达载体用IPTG诱导表达，表达产物 利用SDS-PAGE和Western-blot检测。
Hll是if co加or加s的主要保护性抗原，本发明提供的Hll cDNA序列为
疫苗免疫研究的开展提供了素材；与国外线虫株mi的比较分析可在一定程度
上为线虫因适应不同环境而产生的地区差异性和生物多样性提供证据；本发明 还提供了 Hll基因的基因组结构特征，可从转录水平上分析该基因的生物学活 性，为获得具有较高免疫活性的重组蛋白提供背景资料。 本发明的特点
1. 参考Hll基因的cDNA序列，可以较方便地获得Hll的基因组序列， 而且获得的序列完整、准确；
2. 可以利用Hll的基因组序列分析Hll mRNA的转录特征，为H. contortus的疫苗研制提供了可靠的背景资料和素材；
3. 大肠杆菌表达的原核蛋白主要以包涵体的形式存在于基因工程菌中，仅 需简单的超声波破碎等处理方式即可获得具有较高稳定性和生物活性的粗蛋 白。
图1是本发明提供的特异性引物设计示意图(以获取5'序列为例)。图2是本发明提供的//. co"toWw浙江株Hll cDNART-PCR扩增图谱。 图3是本发明提供的//. co"torto浙江株Hll基因克隆的双酶切和PCR 鉴定图谱。
图4是本发明提供的i/. co"towws浙江株Hll与Smith (1997)公布的序 列同源性比对的分析图谱。
图5是本发明提供的分别利用特异性引物HCF-SP1,HCF-SP2，HCF-SP3与 兼并引物API进行热不对称PCR的扩增图谱。
图6是本发明提供的//. cw7toW^浙江株Hll部分功能域基因(hps)的 PCR扩增图谱。
图7是本发明提供的//. 浙江株Hll部分功能域基因(hps)重组
表达载体的双酶切和PCR鉴定图谱。
图8是本发明提供的H co"tom^浙江株HPS重组蛋白的SDS-PAGE鉴定 图谱。
图9是本发明提供的//. co"tor加浙江株HPS重组蛋白的Western-blot鉴
定图谱。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。 实施例1
本实施例描述了本发明提供的//. cowtom^浙江株Hll基因cDNA序列的 获得方法，长距离RT-PCR扩增并克隆Hll cDNA的整个试验过程。 (一)RT-PCR扩增//. co"foWw浙江株Hll的cDNA序列
1. 参考分子克隆第三版一步法从组织中制备RNA进行//. cowtoWM总 RNA抽提，经甲醛凝胶电泳确定无降解后，-8(TC保存。
2. 引物设计按照Smith (1997)等发表的序列，根据其阅读框的序列 特点，两端分别加上Sal I和HindIII酶切位点及保护碱基设计引物Pl/P2 (参考 SEQNOl和SEQN0 2),引物由上海博亚生物技术有限公司合成。
3. H. ZJ株cDNA的合成在一支1.5ml Eppendorf管中，依次 加入3 jil总RNA、 DEPC处理ddH20 5 jil、 0.5 |il Ribonuclease inhibitor、 2 pi 01igo(dT)18，小心混匀，65。C保温5min，室温放置10min，室温高速离心5 s， 然后再按次序加入4 pi 5x MMLV缓冲液、0.5 |il Ribonuclease inhibitor、 2 )il 100mMDTT、 2 pi dNTP mix、 lplMMLV，小心混匀，37。C保温1 h， 90。C处理5min，冰上冷却，室温高速离心5s， -20 。C冻存。
4.基因的PCR扩增以反转录获得的cDNA为模板，采用SuperTaq酶扩 增Hll基因。扩增条件如下94 。C预变性2 min， 94 °C 30 s， 58 °C 30 s， 68 °C 3min， 30个循环，最后68 "C延伸10min。循环反应完毕后，取5 pl反应产物 在1%的琼脂糖凝胶上电泳，观察结果(参见附图2)，然后利用凝胶回收试剂 盒回收PCR产物备用。
(二) //. co"toWusZJ株Hll基因的克隆
1. PCR产物和pUCm-T的连接在lO)il连接体系中依次加入如下成分 10x连接缓冲液1 W、 pUCm-T酶切载体1 |iil、 PCR纯化回收酶切产物7 |il、 T4 DNA连接酶1 ^， 16 'C连接过夜。
2. 连接产物的转化取连接产物5nl，加入到200 pl感受态细胞，冰浴20 min，室温放置10 min，加入1000 pl LB培养基，37 。C ， 150 r/min震荡40 min。 取300 pl均匀涂布于含X-gal和IPTG的LB Amp琼脂板上，37 。C培养24 h， 挑取白斑菌落(阳性克隆)。
3. pUCm-T-Hll质粒的提取和鉴定挑取若干个白斑，分别接种于5 ml含 Amp的LB培养液中，37 'C摇菌，抽提质粒。碱法抽取的质粒用Sal I和HindIII 酶切鉴定正确后(参见附图3)，将菌液送上海博亚生物技术有限公司测序。测 序结果表明，Hll的cDNA序列共有2919bp，与SmMi等(1997)克隆的Hll 基因相比，有15个碱基发生了突变，其中5个有意义突变，IO个无意义突变。 5个有意义突变分别为第550位T-C;第1577位A-G;第1681位G-A;第2444 位C-T;第2642位G-A,，具体序列参考SEQ NO 3 (GenBankNO.: AY819650)。
4. DNAstar软件分析表明Hll cDNA序列编码972 AA，表达蛋白分子量 为110.8 KDa，等电点为6.85，同源性为99.2% (参考SEQNO 4)。与上述3中 对应的发生突变的氨基酸依次为第184位Phe-Leu;第526位Lys-Arg;第561 位Glu-Lys;第815位Ser-Phe;第881位Gly-Glu的改变，参见附图4。
实施例2
本实施例描述了本发明主要利用基因步移技术获得Hll基因的基因组序 列过程。
(一)Hll部分基因组序列的获得取用PBS缓冲液洗涤过的//. co"toW船50 mg移入冰浴的Collection Tube中，用研磨棒快速研磨成糊状后， 按照TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit的方法提取基因组DNA，-2(TC保存。
以提取的H co"tor加基因组DNA序列为模板，利用引物Hc-GSF / Hc-GSR (参考SEQ NO 5和SEQ NO 6)，进行长距离PCR反应。反应体系(50 fil) : TaKaRa LA Taq(5 U/|il) 0.5 lOxLA PCR Buffer(Mg2+ Plus) 5 pi, dNTP Mixture (各2.5 mM) 8 |til，基因组DNA 0.7 (il， Hc-GSF(20 |iM) 1 (il, Hc-GSR(20 pM) 1 ddH20 38 (il。反应条件为94 。C预变性3 min; 94 °C,60 s, 58 °C 60 s， 72 °C 6 min; 72 °C 10 min; 30个循环。利用引物Hc-GSF/ Hc-GSR扩增获得部分 基因组序列，长度为4806bp。
(二) 利用基因步移的方法获得Hll的基因组序列以及部分5'侧翼序 列首先在已获得的4S06bp片段沿3'方向设计特异性引物HCF-SPl / HCF-SP2 / HCF-SP3，设计方法参考Takara Genome Walking Kit,参见图1 (参考SEQNO 7, SEQ NO 8和SEQ NO 9)，利用该引物与试剂盒提供的API兼并引物进行
基因步移的相关反应，具体流程如下
(1) 以基因组DNA为模板，以HCF-SPl为上游引物，API Primer为下 游引物，进行第一轮PCR反应。50(1l反应体系组成如下基因组DNA模板1 (xl， TaKaRa LA Taq(5卵)0.5 lOxLA PCR Buffer(Mg2+ Plus) 5 pi, dNTP Mixture (各2.5mM) 8 nl， HCF-SPl (10 pmol/(il)引物l|id， API引物(100 pmol/pl) 1 |al， ddH20 33.5 (il。反应条件为
94°C 1 min; 98 。C 1 min;
94。C 30 s， 65 °C 1 min， 94°C 30 s， 25 °C 3 min， 94°C 30 s， 65 °C 1 min， 94°C 30 s， 65°C 1 min， 94。C 30 s， 44°C 1 min， 72 。C 10 min
(2) 以第一轮的PCR反应产物为模板，进行第二轮PCR反应。50pl反 应体系组成如下第一轮PCR反应产物1^1， TaKaRa LA Taq(5U/|LU) 0.5(il， lOxLA PCR Buffer(Mg2+ Plus) 5pl, dNTP Mixture (各2.5mM) 8^1， HCF-SP2
(10pmol/|il)引物l|til， API引物(100pmol/nl) l(il， ddH20 33.5^1。反应条 件为
94°C 30 s， 65°C 1 min， 72°C 2 min; ^
72。C2min，共5个循环； 72。C 2 min; 72 。C 2 min;'
72°C 2 min; 72°C 2min;-
共15个循环94°C 30 s， 65°C 1 min， 72°C 2 min; 共15个循环 94°C 30 s， 44°C 1 min， 72°C 2 min; 72 。C 10 min
(3)以第二轮的PCR反应产物为模板，进行第三轮PCR反应。50 pl反 应体系组成如下第二轮PCR反应产物1^1， TaKaRa LA Taq(5 U/|ul) 0.5 |ul, lOxLA PCR Buffer(Mg2+ Plus) 5 pl， dNTP Mixture (各2.5 mM) 8 |nl， HCF-SP3( 10 pmol/^il)引物1 pl， API引物(100pmol/|Lil) 1 |al， ddH20 33.5 pl。反应条件 为
94°C 30 s， 65°C 1 min， 72°C 2 min;
共15个循环
94°C 30 s， 65°C 1 min， 72°C 2 min; 94°C 30 s， 44。C 1 min， 72。C 2 min; 72°C 10 min
(4) 取上述各步PCR反应液5 pl进行1%的Agarose凝胶电泳，结果如 附图5所示。
(5) 使用凝胶回收试剂盒，割胶回收第三轮PCR扩增产物，与pMD18-T 载体连接，转化，挑选阳性克隆，测序，结果分析获得H11基因的部分5'侧翼 序列。在获得的序列区域设计引物3HcHPF/3HcHPR， (3HcHPF: 5-CAGAAGAAGAGTGTGACTGATGT陽3', 3HcHPR: 5，-CCAGTTCACATTCTTGGGGTAT-3')，用于鉴定扩增获得的5'侧翼区序列。鉴 定结果表明，获得5，侧翼区序列为1848bp。
(6) 按照同样的操作流程，最终扩增获得的Hll基因组序列全长为14959 bp，包含25个外显子，24个内含子以及长度为1848 bp的5'侧翼序列，参考 序列SEQNO 10 (GenBankNO.:FG481146)，外显子与内含子之间通过典型的 GT......AG连接。
实施例3
本实施例描述了本发明对Hll部分功能域基因的原核表达过程。
1. 参考Hll的cDNA序列(SEQN03)，设计引物HPSF/HPSR，两端分 别加上Nde I禾口 Xho I酶切位点及相应保护性碱基(SEQ NO 11和SEQ NO 12)，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。
2. Hll部分功能域(HPS)核酸序列的PCR扩增以实验室保存的pUCm-T-Hll质粒为模板，用Taq DNA聚合酶扩增，条件为94 'C预变性3 min; 94。C30s， 58.7。C30s， 68 °C 3 min，共30个循环；最后72 。C延伸10 min。 反应完毕后，取5nl反应产物在1.0。/。的琼脂糖凝胶上电泳，观察结果，参见 图6。
3. Hll部分功能域(HPS)的原核表达 A^fe/和J^o/酶切HPS基因片 段和质粒pET-28b，并用DNA回收试剂盒回收纯化酶切产物，按T4 DNA连 接酶说明进行连接，连接产物转化大肠杆菌BL21， PCR、酶切鉴定阳性(参 见图7，图8)，送至上海英骏生物技术有限公司测序。
4. IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白及纯化取50 pl含重组表达质粒的菌 种液接种到5ml含Amp的LB液体培养基中，于37 "C摇床中以220转/分振摇 培养，至菌液的OD值约为0.5时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L后 30 'C继续振荡培养，分别在诱导前(0h)和诱导后2、 4、 6、 8h吸取5ml菌 样于4°C， 5000 rpm离心5 min，收集细菌沉淀，用PBS重悬。用PBS洗2次， 加1 ml裂解缓冲液、10 ^溶菌酶，冰浴30 min，超声波裂解菌体(条件为200 w， 处理4s，间隔4s，共40次)后12000 rpm离心1 min,沉淀用PBS重悬加入等 量2xSDS凝胶加样缓冲液，上清也加入等量上样缓冲液，煮沸5min，冰浴2 min, -2(rC备用。同时设立带pET-28b质粒的BL21大肠杆菌对照，SDS-PAGE 鉴定，参见图8。将诱导培养的细菌进行超声裂解，收集上清液加入到用PBS (pH7.4)预先平衡的镍琼脂糖凝胶柱中。控制流速lml/min，经PBS平衡后 用含不同浓度咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，流速2 ml/min，收集洗脱液，经 Western-blot鉴定，参见图9。本发明涉及的序列 <110>浙江大学
<120>捻转血矛线虫微粒体氨肽酶基因的获得方法及应用 <160> 12
<210> 1
<211>24
<212>DNA
<213>捻转血矛线虫 (Haemonchus contortus)
<220>
<221>CDS
<400> 1
aagtcgactgagggtctccatcta
<210> 2 〈211〉 26 <212>DNA
<213>捻转血矛线虫 (Haemonchus contortus)
<220>
<221>CDS
<400> 2
ccaagcttaattcgaattacaaggtg
<210> 3 <211> 2919 <212>RNA
<213>捻转血矛线虫 (Haemonchus contortus)
<220>
<221>CDS
<400> 3
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<213>捻转血矛线虫 (Haemonchus contortus) <220>
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<210〉 5 〈211〉 26 <212>DNA
<213>捻转血矛线虫 (Haemonchus contortus)
<220>
<221>Exon
<400> 5
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〈210〉 6<formula>formula see original document page 13</formula>cacttaccctatcctgctactgcatcgatttcgctcgtcactcttttgaatgtattgattgtcttgattgttgagattagttatctgataaaaattaatggttgacgtctattggt
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<213>捻转血矛线虫 (Haemonchus contortus)
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权利要求
1. 一种获取捻转血矛线虫微粒体氨肽酶基因的方法，所述捻转血矛线虫命名为H.contortus，其特征在于通过以下技术方案实现(1)H. contortus浙江株总RNA的抽提和H11 cDNA序列的克隆所述的H. contortus浙江株总RNA的抽提和H11 cDNA序列的克隆参照Smith 1997年发表的H.contortus H11基因序列设计引物，见SEQ NO 1和SEQ NO 2，以H.contortus浙江株的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，将PCR产物与PUCm-T载体连接后，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，测序见SEQ NO 3；(2)H11 cDNA序列同源性比较及氨基酸序列分析H11 cDNA序列同源性比较及氨基酸序列分析利用生物软件DNAStar对获得的H11基因进行基本的特征分析，并与Smith等克隆的H11进行同源性比较，见SEQ NO 4；(3)H11基因组序列的克隆及结构分析H11基因组序列的克隆及结构分析利用DNAStar软件分析H11及其同源基因T07F10.1a、CBG09515，根据T07F10.1a、CBG09515的内含子、外显子分布特点，参考获得的H11 cDNA序列，设计引物，见SEQ NO 5和SEQ NO6，以H.contortus的基因组DNA为模板，进行长距离PCR扩增，获得H11基因的部分基因组序列，测序。
2. 根据权利要求1所述的获取捻转血矛线虫微粒体氨肽酶基因的方法， 其特征在于分离获得的捻转血矛线虫浙江株的Hll基因的cDNA序列SEQ N03全长2919bp，编码972AA，表达蛋白的分子量为110.8 KDa，等电点为 6.85，与1997年Sm池公布的序列比对分析，同源性为99.2%，有5个氨基酸 发生突变。
3. 根据权利要求1所述的获取捻转血矛线虫微粒体氨肽酶基因的方法， 其特征在于分离获得的捻转血矛线虫浙江株的Hll基因的基因组序列SEQ NO IO通过基因步移的方法获得，全长14959 bp，包含25个外显子，24个内 含子以及长为1848 bp的5'侧翼序列，外显子与内含子之间通过典型的GT…… AG连接。
4. 根据权利要求1所述方法获得的捻转血矛线虫微粒体氨肽酶基因在利 用重组蛋白制备亚单位疫苗中的应用。
全文摘要
本发明提供一种获取捻转血矛线虫(H.contortus)微粒体氨肽酶基因的方法，通过总RNA的抽提和H11 cDNA序列的克隆，H11 cDNA序列同源性比较及氨基酸序列分析，H11基因组序列的克隆及结构分析。本发明参考H11基因的cDNA序列，可方便、完整、准确地获得H11的基因组序列，可利用H11的基因组序列分析H11 mRNA的转录特征，为H.contortus的疫苗研制提供了可靠的背景资料和素材。本发明提供的捻转血矛线虫微粒体氨肽酶基因可在利用重组蛋白制备亚单位疫苗中的应用。
文档编号C12N15/10GK101434951SQ200810163618
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者周前进, 姜小磊, 张红丽, 杜爱芳 申请人:浙江大学