专利名称：杀寄生虫的苏云金芽胞杆菌菌株ybt－1532及其杀虫晶体蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物杀虫农药技术领域，具体涉及一种杀植物线虫和动物寄生虫的苏云金芽胞杆菌菌株的选育及其杀虫晶体蛋白的开发。其国际专利分类号为A0N63/00。
植物寄生线虫是农业生产中的重要害虫之一。它们危害蔬菜、玉米、棉花、烟草和水稻等经济作物，可造成与昆虫相等的经济损失。化学杀线虫剂的防治虽有一定作用，但化学农药对生态环境以及对土壤的污染和对昆虫天敌的影响是巨大的，因此开发生物农药防治线虫是当前农业害虫综合治理上急待解决的问题。
捻转血矛线虫、丝虫、疟原虫和血吸虫是畜患、人类、或人畜共患的寄生虫，化学药物的防治往往有较强的毒副作用，而且经常使用也容易使病原体产生抗药性。
生物杀虫剂具有不污染环境、对人畜安全、害虫不易产生抗药性和生产简单等优点，苏云金芽胞杆菌杀虫剂是目前最重要的生物杀虫剂。
自1988年以来，美国Mycogen公司分离到一些对动物和植物寄生线虫有毒的苏云金芽胞杆菌，作用对象包括对短体线虫、秀丽新杆线虫(Caenorhabditiselegans)、原虫、丝虫，为血清型H4、H7、H3ab等，未发现对根结线虫(世界上危害作物最严重的植物寄生线虫)以及捻转血矛线虫和血吸虫的毒力(http//www.patents.ibm.com；Feitelson等，Bio/Technology 10271-275，1992.)。
本发明的目的在于克服现有技术不足，选育对植物和动物有特异性毒力的苏云金芽胞杆菌菌株及其杀虫晶体蛋白。
本发明通过以下技术方案实现一种杀植物线虫和动物寄生虫的菌株，其特征在于，所述的菌株为YBT-1532(一种苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis，CCTCC，NO.M94068保藏日期1994年11月4日)，它包括a.鞭毛抗原血清型为H10；b.该菌株产生菱形伴胞晶体；c.组成伴胞晶体的杀虫晶体蛋白分子量为130kDa；d.该晶体蛋白的N-末端氨基酸序列为Met-Glu-Ile-Val-Asn-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys。
一种杀植物线虫和动物寄生虫的苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1532(一种苏云金芽胞杆菌，CCTCC No.M94068，保藏日期1994年11月4日)，该菌株的杀虫晶体包括以下特征a.对植物寄生线虫有毒杀作用；b.对动物寄生虫有毒杀作用。
本发明的菌株YBT-1532对植物根结线虫具高毒力，属H10，即血清型具特异性，其产生的杀虫晶体蛋白与国外报道的不同，作用对象也不同下面对本发明作进一步的描述
一、苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1532的分离筛选采用醋酸盐选择培养基(简称BPA培养基)，从土壤中分离，并以小菜蛾幼虫为试虫进行毒力测定，筛选获得本发明菌株。
1.BPA培养基配方牛肉膏5克，蛋白胨10克，醋酸钠34克，蒸馏水1000毫升，pH值7.2-7.4。
2.分离称取1克土壤样品于BPA培养基中，充分振荡后，置30℃摇床培养4小时，取出于75-80℃水浴热处理10-15分钟，稍静置后，吸0.5毫升置于BPA平板培养基上，涂布均匀，倒置于30℃培养箱中培养24小时，挑选3-5个类似苏云金芽胞杆菌的菌落接种到BPA斜面上，30℃培养72小时以上，石炭酸复红染色镜检，将有伴胞晶体的分离体确定为苏云金芽胞杆菌。
3.菌种培养、传代和保藏在牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.5％蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，pH 7.2)斜面(18×180mm)上于30℃培养，可于4℃短期保藏，以冷冻管，或砂土管长期保藏，作为原始菌种。生产菌种需从原始菌种中转接，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上。
4.菌株YBT-1532的生物学及遗传学特性①生物学特性菌体直杆状，营养体呈链状或单生，长3-5微米，宽1-1.2微米，革兰氏染色阳性，芽胞呈圆柱状或近椭圆，偏端生，芽胞囊不膨大，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落圆形，边缘平滑，菌苔丰满呈蜡质状，生长温度10-45℃，最适pH6.8-7.4，兼性嫌氧，在含7％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长，在核糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和可溶性淀粉培养基中产酸，甲基红反应阳性，芽胞生长后期产生伴胞晶体，伴胞晶体呈菱形，大小不一。
②遗传学特性苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1532为本申请人分离的特异性菌株，鞭毛抗原血清型为H10，伴胞晶体菱形，伴胞晶体蛋白为130kDa，其N-末端氨基酸序列为Met-Glu-Ile-Val-Asn-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys。
二、毒力测定(本发明的效果)1.样品制备将苏云金芽胞杆菌分离体接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，30℃培养72小时以上，加10ml无菌水洗下菌苔，打碎成均匀菌悬液作为原液。提纯伴胞晶体，用碱溶解伴胞晶体得到杀虫晶体蛋白。2.对寄生线虫的毒力将毒素蛋白喂食线虫，测定对北方根结线虫(Meloidogyne hapla)(2龄幼虫)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(2龄幼虫)、甘薯茎线虫(成幼虫混合)、短体线虫(Pratylenchus spp.)和苎麻短体线虫(成幼虫混合)等植物寄生线虫的毒力LC50分别为66.5μg/ml，70.6μg/ml，183.2μg/ml和134.7μg/ml；对动物寄生虫有毒杀作用，对捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)(2期幼虫)的LC50为31.5μg/ml；0.11mg/ml杀虫晶体蛋白对马来丝虫具95％杀虫率；对感染伯氏疟原虫的小鼠可延长6天寿命；对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)童虫的致死率在0.49μg/ml和0.98μg/ml分别为67.8％和96.8％。
本发明的应用前景与已有技术相比，本发明开拓了植物线虫和动物寄生虫防治的新途径，它不仅扩大了线虫和动物寄生虫高效低毒生物农药的范围，而且减少了由于以往大量使用化学农药对环境的污染以及线虫和寄生虫对化学药剂的抗性，有利于环境的保护和减少农产品上农药的残毒，是一种全新的动植物病虫害的防治方案件。
一般情况下，防治寄生在植物的线虫比较困难，特别是对于根结线虫这样的刺吸性线虫尤其如此。实施本发明除了直接毒杀植物、动物寄生虫外，还可将杀虫基因转移到植物体内，使杀虫晶体蛋白得以表达，从而开发出一种具有重要应用前景的防治线虫的方法。
此外，鉴于苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白具有较高的杀虫特异性，对人畜安全无毒，本发明可提供杀动物寄生虫的蛋白，用于防治动物寄生虫。
权利要求
1.一种杀植物线虫和动物寄生虫的菌株，其特征在于，所述的菌株为YBT-1532(一种苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis CCTCC，NO.M94068，保藏日期1994年11月4日，它包括a.鞭毛抗原血清型为H10；b.该菌株产生菱形伴胞晶体；c.组成伴胞晶体的杀虫晶体蛋白分子量为130kDa；d.该杀虫晶体蛋白的N-末端氨基酸序列为Met-Glu-Ile-Val-Asn-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys。
2.根据权利要求1所述的杀植物线虫和动物寄生虫的苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1532(一种苏云金芽胞杆菌，CCTCC No.M94068，保藏日期1994年11月4日)，其特征在于所述的杀虫晶体蛋白具有a.对植物寄生线虫有毒杀作用；b.对动物寄生虫有毒杀作用。
全文摘要
本发明属于微生物杀虫农药技术领域,具体涉及一种杀植物线虫和动物寄生虫的苏云金芽胞杆菌高毒力菌株的选育。本发明的特征是,分离到一株对植物线虫和动物寄生虫有毒的苏云金芽胞杆菌菌株YBT－1532,其鞭毛抗原血清型为H10,产生菱形伴胞晶体,组成伴胞晶体的杀虫晶体蛋白分子量为130kDa,该蛋白对植物线虫和动物寄生虫有毒杀作用。与已有技术相比,本发明的菌株及其杀虫晶体蛋白具有毒力高,特异性强等突出优点。
文档编号C12N1/20GK1345928SQ0011606
公开日2002年4月24日 申请日期2000年9月30日 优先权日2000年9月30日
发明者孙明, 喻子牛, 姚宝安, 王乾兰, 赵俊龙, 刘子铎, 刘斌 申请人:华中农业大学