专利名称：CYP1A2基因的SNP rs4646418及其在相关药物代谢活性检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及细胞色素氧化酶P4501A2基 因(Cytochrome P4501A2，CYP1A2)的单核苷酸多态性(single薦leotid印olymorphism， SNP)及其与药物代谢活性检测之间相关性。本发明还涉及检测所述SNP的方法和试剂盒。
背景技术：
药物作用效应的个体差异已经是一种普遍存在的现象，而由于这种差异造成的药 物无效或严重药物毒副反应已越来越引起临床医生和药物遗传学家的关注。药物代谢能力 和药物效应的差异是药效个体差异的主要原因之一，一些药物代谢和效应相关基因已被发 现在人群中不但存在DNA序列的变异，而且其RNA表达水平也存在很大的个体差异。
负责药物代谢的酶主要有两大类一类称为I相药物代谢酶，它们的作用主要氧 化激活药物分子，为下一步反应提供底物；另一类是II相药物代谢酶，它们的作用是在I相 代谢酶反应产物上加上大极性基团，例如糖基，磺酸基，乙酰基或氨基，从而增加药物分子 的溶解性，以利于排出体外。 I相药物代谢酶主要包括细胞色素氧化酶P450(CYP450)和核黄素单氧化酶 (FMO)，也包含部分羟化酶，过氧化物酶以及单胺氧化酶等。细胞色素氧化酶是最主要的药 物代谢酶，并被广泛研究。已发现人类基因组中约有55个这类基因，其中4个基因(CYP3A4， CYP2C9， CYP2C19和CYP2D6)最为主要。 II相药物代谢酶主要包括UDP糖基转移酶(UGTs)，谷胱甘肽转移酶(GSTs)，磺基 转移酶(SULTs)和N-乙酰转移酶(NATs)等。 细胞色素氧化酶P4501A2 (cytochromes P4501A2， CYP1A2)是人肝脏中一种重要的 氧化还原酶。近年来，大量研究已发现，CYP1A2在人体内的表达存在很大的个体差异。不 同个体间转录水平的表达差异可以高达40倍。因此，了解人类药物代谢和效应相关基因的 多样性的遗传基础是生物医学研究中药物基因组学研究的主要目的之一。
CYP1A2是重要的I相药物代谢酶，是P450主要代谢酶之一，在人类肝脏中，约占 P450酶总量的13%。 CYP1A2的mRNA表达量在个体之间的差异可以高达40倍，由此导致不 同个体之间对药物代谢能力的显著差异。 目前已知，临床上像theophylline、tacrine、clozapine、 olanzapine等药物是主 要由CYP1A2来进行I相药物代谢的。例如，对咖啡因(Caffeine)而言，90%是由CYP1A2 来进行代谢的；对clozapine (氯氮平)而言，约30%是由CYP1A2来进行代谢的。
目前FDA批准临床应用的药物代谢酶检测芯片是罗氏公司与Affymetrix公司共 同开发的，它上面整合了 CYP2D6和CYP2C19的已报道的一些功能位点信息，用于判断个体 对以这两个酶作为主要药物代谢酶的药物的代谢能力。CYP1A2在临床上面参与代谢的药 物种类甚多。其在个体之间的表达差异可高达40倍，是其药代能力个体差异的一个主要来 源。因此要想对个体CYP1A2的活性做出预测，就有必要对影响其表达量的或者可以预测其表达量的SNP位点进行分型。以其可以指导临床合理用药，提高药物的安全性和有效性，实 现个体化治疗的目标。 目前的研究表明，CYP1A2基因的一些多态性与药物的代谢能力相关，其中多数多 态性并不导致CYP1A2蛋白的氨基酸变化。这提示，在CYP1A2酶活性不改变的情况下(因 为酶的氨基酸序列未改变)，CYP1A2的这些多态性(包括SNP)是通过影响CYP1A2的表达 量实现的。因为蛋白的表达量与其mRNA的数量基本上呈正比，因此鉴别出与CYPlA2的表 达量相关的SNP就成为研究重点。 W0 2008032921中公开了测定包括CYP1A2在内的多种基因的基因型的SNP以及相 应的基因芯片，并且用这些SNP和基因芯片进行基因分型的应用。 JP 2007006713中公开了用于测定药物代谢酶CYP1A2基因的多态性的引物集、引 物和探针，以及用于检测CYP1A2酶活性的检测试剂。在该文献中，在施用通过CYP1A2代谢 的药物之前，先检测受试者的与CYP1A2相关的代谢能力相关的基因多态性，从而避免或减 少与该药物相关的不良反应或副作用。 W0 03014387中公开了一种检测基因CYP1A2的基因型的方法，在该文献中提示， CYP1A2基因与药物代谢能力相关。 中国专利申请200510088646. 0中公开了一种与药物代谢能力相关联的基因 CYP1A2基因型方法，其中对CYP1A2基因的G-3860A位点、G-3113A和T5347C位点进行检此外，已有报道CYP1A2与部分癌症的发生有相关关系，例如在W0 03014387和中 国专利申请200510088646. 0中都提及CYP1A2基因与肝癌易感性也存在一定的相关性。
综上所述，本领域虽然已知CYP1A2酶或CYP1A2基因的多态性与某些药物的代谢 能力相关，但是人们尚未影响在CYP1A2中存在那些具体的多态性(包括SNP)，也不清楚哪 些多态性(包括SNP)与药物代谢活性或能力的大小相关。 因此，为了减少药物对不同个体的副作用，本领域迫切需要寻找与药物代谢活性 或能力的大小相关的CYP1A2的SNP，以及相关的可用于药物代谢活性检测的方法和试剂
发明内容
本发明的目的就是提供CYP1A2基因中与药物代谢活性或能力的大小相关的单核 苷酸多态性(SNP)。 本发明的另一 目的是提供可用于预先评估个体的药物代谢活性的方法及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种体外检测(尤其是非诊断性检测)样品是否存 在细胞色素氧化酶P4501A2基因CYP1A2的单核苷酸多态性的方法，包括步骤
(a)用CYP1A2基因特异性引物扩增样品的CYP1A2基因，得到扩增产物；禾口
(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性
830位T — C ; 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1。 在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO :2或3的序列。 在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为50-3000bp，且含有SEQ ID NO :1中第830位。 在本发明的第二方面，提供了一种用于预测个体的药物代谢活性的试剂盒，它包 括特异性扩增CYP1A2基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为50-3000bp且含有 SEQ ID NO :1中第830位的扩增产物。 在另一优选例中，所述的突变是以下的单核苷酸多态性
830位T — C ; 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:l。 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的试剂 (i)与SEQ ID NO :1中第830位的突变结合的探针；或 (ii)识别SEQ ID NO :1中第830位的突变限制性内切酶。 在另一优选例中，所述的引物具有SEQ ID NO :2或3的序列。 在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列为细
胞色素氧化酶P4501A2基因CYP1A2野生型的基因组核苷酸序列，并且存在SEQID NO :1中
第830位T —C突变。 在另一优选例中，所述的多核苷酸是第830位为C的SEQ ID NO :1所示的序列。
在本发明的第四方面，提供了本发明第三方面中所述的多核苷酸的用途，它用于 制备检测个体的药物代谢活性的试剂或试剂盒。 在另一优选例中，所述的试剂为引物、引物集、探针或核酸芯片。 在另一优选例中，所述的引物或引物集可特异性地扩增出含SEQ ID NO:l中第
830位的扩增产物；所述的探针能够与含SEQID NO :1中第830位的核酸发生特异性结合；
所述的核酸芯片上含有的探针，所述的探针能够与含SEQIDNO :1中第830位的核酸发生特
异性结合。 在本发明的第五方面，提供了一种可用于检测药物代谢活性的核酸芯片，所述的 芯片包括基板以及固定在基板上的寡核苷酸探针，所述的探针能够与含SEQ ID NO:l中第 830位的核酸发生特异性结合，并且鉴别出SEQ ID N0:1中第830位的核苷酸是T还是C。
在另一优选例中，所述的药物选自下组 茶碱、他克林、氯氮平、奥氮平、氟他米特、夫罗曲普坦、利多卡因、褪黑激素、美西 律、罗哌卡因、替扎尼定、氨苯蝶啶、佐米曲坦；或 对乙酰氨基酚、阿莫曲坦、阿米替林、氯丙咪嗪、环苯扎林、三氟戊肟胺、丙米嗪、马 普替林、萘普生、雌二醇、昂丹司琼、奋乃静、普罗帕酮、普萘洛尔、利鲁唑、硫利达嗪、维拉帕 米、右旋华法林、积璐琛、或佐替平。 在本发明的第六方面，提供了一种对药物代谢活性进行预测的方法，它包括步 骤 检测待检个体的CYP1A2基因和/或转录本，并与正常的CYP1A2基因和/或转录
本相比较是否存在以下的单核苷酸多态性
830位T — C ; 其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1， 如果存在所述的单核苷酸多态性就表明对该个体而言其药物代谢活性高于普通 人群。
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应理解，上述的以及本文下文中所详述的任二个或多个技术特征都可相互组合， 以构成新的技术方案。在此申请中，为了节省篇幅，不再一一列出。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，对CYP1A2基因的SNP进行了测定和分析。首次 发现和证明了 CYP1A2基因的部分SNP可显著影响CYP1A2的mRNA拷贝数，进而影响药物代 谢活性。关联研究结果显示，在CYP1A2的SEQ ID NO :1所示序列的第830位的SNP(830位 T — C)可显著导致CYP1A2的mRNA拷贝数(P < 0. 01)，因此可作为预测药物代谢活性的特 异性SNP。在此基础上完成了本发明。
CYP1A2基因 如本文所用，"CYP1A2基因"指编码细胞色素氧化酶P4501A2的多核苷酸分子，包 括DNA和RNA。该术语还包括CYP1A2的基因组序列，尤其是含有启动子区域的多核苷酸。
如本文所用，"CYP1A2蛋白"或"CYP1A2酶"可互换使用，指细胞色素氧化酶 P4501A2。 人的细胞色素氧化酶P4501A2基因(CYP1A2)的详细序列可参见网址htto: 〃w丽. ncbi. nlm. nih. gov/)。在SEQ ID NO : 1中给出了人CYP1A2基因启动区的部分序列。
本发明的研究表明，当细胞色素氧化酶P4501A2在SEQ ID NO :1中的第830位发生 830位T — C时，导致CYP1A2的转录本的数量明显上升，进而导致翻译产生的CYP1A2蛋白 数量增加。由于该SNP不会导致CYP1A2蛋白的氨基酸发生变化，故该SNP不会导致CYP1A2 蛋白的酶活性发生变化，因此具有第830位T — C所示SNP的细胞或个体，其药物代谢能力 大于该位点为野生型的细胞或个体。
主要或者部分由CYP1A2代谢的药物 目前已知在药物代谢中涉及CYP1A2的药物很多，主要分为以下二类
—、主要或者部分由CYP1A2代谢，并且已经提示CYP1A2各种表型产生不同临 床意义的药物，其中包括(但并不限于)theophylline(茶碱)(Sarkar et al. 1992)， tacrine (他克林)(Spaldin et al. 1994) ， clozapine (氯氮平)(Bertilsson et al. 1994)， olanzapine (奥氮平)(Callaghan et al. 1999) ， Flutamide (氟他米特)，Frovatriptan (夫 罗曲普坦)，Lidocaine(利多卡因)，Melatonin(褪黑激素)，Mexiletine(美西 律)，Ropivacaine (罗哌卡因)，Tizanidine (替扎尼定)，Triamterene (氨苯蝶啶)， Zolmitriptan(佐米曲坦)。 二、部分由CYP1A2进行代谢，而CYP1A2各表型临床意义尚不明朗或者影响较弱 的药物，其中包括(但并不限于)Acetaminophen(对乙酰氨基酚)，Almotriptan(阿莫 曲坦)，Amitriptyline (阿米替林)，Clomipramine (氯丙咪嗪)，Cyclobenzaprine (环苯 扎林)，Fluvoxamine(三氣戊月亏胺)，Imipramine (丙米嚷)，Maprotiline(马普替林)， Naproxen (萘普生)，Oestrogen (雌二酉享)，Ondansetron (昂丹司琼)，Perphenazine (奋 乃静)，Propafenone (普罗帕酮)，Propranolol (普萘洛尔)，Riluzole (利鲁唑)， Thioridazine (硫利达嗪)，Verapamil (维拉帕米)，(R) -Warfarin (右旋华法林)， Zileuton (积璐琛)，Zot印ine (佐替平)。 本发明人对CYP1A2基因的SNP进行了测定和分析，其中对CYP1A2基因中的几乎
6整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分SNP与药物代谢活性并不相关。然而，关 联研究表明，SEQ ID NO :1中第830位T — C却是与药物代谢活性关联性非常高的SNP。
CYP1A2蛋白的多聚核苷酸可用于预先判断药物代谢活性。如CYP1A2DNA序列可 用于对活检标本的杂交以判断CYP1A2蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法， Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商 业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray) 或DNA芯片(又称为"基因芯片")上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因检测。 用CYP1A2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CYP1A2蛋 白的转录产物。 检测CYP1A2基因的突变也可用于预先判断药物代谢活性检测。检测可以针对 cDNA，也可针对基因组DNA。 CYP1A2蛋白突变的形式包括与正常野生型CYP1A2DNA序列相 比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA 序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern 印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。 最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用CYP1A2基因特异性引物扩增样品的 CYP1A2基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性第830位 T —C，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:l。 应理解，在本发明首次揭示了CYP1A2基因的SNP与药物代谢活性检测的相关性之 后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通 过测序等方法确定是否存在830位T — C。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。 虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一 定的不互补(尤其是引物的5'端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片 段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增 出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。 一种优选的引物对具有SEQ ID NO :2或3的序 列。 虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为50-3000bp，较佳 地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO :1中第830位。
由于本发明的SNP与药物代谢活性检测具有非常高的关联性，因此可以用于在 给药前就预先判断个体的药物代谢活性，而且可以未雨绸缪地减少与由细胞色素氧化酶 P4501A2所全部或部分代谢的药物的副作用，从而药物使用的安全性，因此具有极其重大的 应用价值和社会效益。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明
而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1 实验材料和方法 在临床上收集96例正常中国人肝脏样本。样本采集于正常供肝的病理活检部分， 约50 2Q0mg每例，在采集后立刻浸入lmL RNALater中，4。C过夜，待样本被RNALater充分浸透后，转移至-701:保存。本研究工作样本采集及使用均得到伦理学批准。 将-7(TC保存的样本于室温复溶后，从RNALater中取出，在DEPC-处理的ddH 20 中漂洗掉R亂ater，转移至lmL Trizol (Invitrogen Inc.)中，以Pro200homogenizer (Pro scientific Inc.)进行匀桨。然后依Trizol的方案(protocol)得到DNA和RNA。以 Biophotometer(Eppendorf Inc.)进行初步定量。对得到的RNA以DNase I (Takara Inc.) 进行处理，并用酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀。以DEPC-treated ddH20复溶并稀释至终浓 度约lug/ul。 -7(TC保存。 以20ii 1体系1RT缓冲液，O. 5mM dNTP，0.5iiM poly24dT， 5 ii M N9，20URnase抑 制剂(BIO BASIC INC.)，100U M-MLV(H-)逆转录酶(Promega Inc.)进行反转录。反应条 件为25°C 10min，42。C 60min，然后70°C 15min。 以人基因组DNA(购自Promega， Catalog No. G152A)作为标准品，GAPDH、 ACTB和 18srRNA作为参照基因。在ABI7900HT实时定量PCR仪(AppliedBiosystems，Foster City， CA)上面进行绝对定量PCR，确定cypla2在各个样本中的表达量。以市售的Primer3软件 设计PCR引物，选择单个外显子之内的80-180bp大小的片段进行扩增。反应体系为20uL : IX QuantiTect SYBRGreen PCR Master Mix (Qiagen Inc.) ， 0. 3 ii M各引物，2 ii 1 RT稀释 后产物(以18s rRNA作为参照基因的40000倍稀释，其他的20倍稀释)或者倍比稀释的 标准品基因组DNA G152A。反应条件为95°C 15min ;94。C 15s， 57°C 30s， 72°C 30s 40个循 环。 根据文献及H即M即数据，利用LD，在cypla2基因区域及其与cyplal的共享的调 控区域内，共选择了 16个tagSNP。任两个tagSNP之间r2小于0. 9。 tagSNP12和16作为 marker SNP，用于检测两个等位基因之间的表达比值。其余12个tagSNP以测序手段进行 分型。 IO微升PCR体系:lx HotStarTaq缓冲液，2. OmM Mg2+，0. 2mM dNTP，O. 2M引物，0. 3U HotStarTaq聚合酶(Qiagen Inc.)和1微升模板DNA(约10ng/l)，反应条件95。C 15min ; 94°C 20s， (62°C -0. 5°C /循环)40s，72。C 80s，ll个循环；94。C 20s，56。C 30s，72。C 80s， 25 个循环；72°C 5min。 PCR产物以SAP和Exol进行纯化后，用BigDye3. 0进行测序反应，在 ABI3730XL(AppliedBiosystems， Foster City， CA)上进行测序，以Polyphred读取序列。
以SNaPshot Multiplex kit(Applied Biosystems)对所有cDNA以及5个DNA样 本的标记SNP (marker SNP)进行分型，以DNA样本两个等位基因(allele)峰高比值作为参 照，通过检测marker SNP在cDNA样本中的两个allele的比值来确定两个allele表达量的 情况。以此作为后续关联研究的表现型。这个步骤重复4次，取平均值。所有16个tagSNP 的纯合与杂合状态作为研究的基因型。 以SPSS VERSI0N15. O(SPSS Inc. ， Chicago, IL)对6)所述基因型和表现型进行秩 和检验，以检测是否有与等位基因表达比值有相关关系的tagSNP位点。以Kruska-Wallis test和ANOVA对tagSNPs和CYP1A2的表达量进行相关性分析。 在秩和检验得到部分位点的基础上，进一步挑取了一个与较显著等位基因表达不 平衡(allele expression imbalance, AEI)有显著相关的位点tagl2，进行了体外转录试 验。设计了一个tag04的618bp的片段，位置从cypla2的-605到-1204。选取一个tag04 的杂合个体进行PCR扩增。该PCR上下游引物分别设计了 Kpnl和Xhol酶切位点。PCR产物以Kpnl和XhoI进行酶切，，然后克隆至pGL-3启动子载体(购自Promega公司).然后将 其转化至常规的E. coli DH10B菌株，培养后挑取分别包含两个allele的序列的细菌进行 培养，序列以测序验证无新发突变，确证挑取出的菌落只包含tag04位点不同的两个序列。 细菌培养后以QIAGEN plasmid purification kit(Qiagen)进行质粒抽提。
将人类H印G2细胞在24孔培养盘中进行培养，密度为lx105细胞/孔，培养过夜使 覆盖率为50-80%作为转染细胞。以质粒和pRL-SV40组成转染DNA mix。用jetPEI转染 试剂(Polyplus Transfection Inc.)进行细胞转染。细胞转染后37。C过夜，然后以0. 1% DMS0或10nM TCDD处理过夜。用市售的luciferase分析试剂盒(TM046, Promega)进行细胞 处理后，以Microlumat Plus LB 96Vluminometer (Berthold Technologies,Bad Wildbach， Germany)进行荧光检测。
试验结果 l)Tag SNP04(rs4646418)与样本中的CYP1A2的拷贝数之间存在显著相关性。 Tag04(SEQ ID NO : 1中第830位T — C)的C等位基因比T等位基因多产生约40%的拷贝 数。 2)转染试验结果表明，在有TCDD诱导或者没有诱导的情况下，tag04的C等位基 因均比T等位基因和对照表现出更高的表达活性。在无诱导的情况下，C等位基因比T等位 基因表达活性约强20%，在诱导后，这个比例上升到53%。 C等位基因的被诱导能力(5.7 倍)比T等位基因(4.4倍)也要高。相对于对照来说，在无诱导情况下，C等位基因和T 等位基因的荧光活性分别强80%和60% ，在诱导后，则分别上升至300%和160% 。表明这 600bp的区域具有增强子活性和TCDD诱导活性。同时说明tag04本身是具有功能的一个位 点。 上述结果提示，Tag04位点通过影响基因表达，调控了基因的功能，并影响了该基
因所代谢的药物的代谢情况。
实施例2
SNP rs4646418的验证
2. 1DNA提取 用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩 增。 2. 2PCR及测序引物的设计 根据SEQ ID N0:1所示的CYP1A2基因的序列，设计和合成以下引物。具体引物如 下表1所示。 表l引物序列表
引物名称序列(5' -3')SEQIDNO :
有义引物gggElttgg卿gElElElggtggCggElg2
反义引物ctctctccgcaaggccttccctgac3 1. 2. 3CYP1A2基因的PCR扩增
9[OO93] 以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700PCR仪上以Touchdown程序进行 PCR扩增。反应条件为94t:预变性2分钟，94t:变性30秒，63。C退火40秒，72。C延伸40 秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0. 5°C;以后94t:变性30秒，58t:退火40秒，72°C 延伸40秒，共30个循环；最后72t:延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。
结果，获得1680bp的扩增产物。
1. 2. 4SNP的发现和检测 PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI_PRISMTM377DNA测序仪(美国应用生物系 统公司即pliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件 (美国华盛顿大学http:〃droog. mbt. Washington. edu/Polyphred. html)进行序列的判读 和SNP确认。 结果，发现存在以下SNP :830位T —C。 实施例3 个体的药物代谢活性测定 因为已知在人体中咖啡因约90%由CYP1A2代谢，因此CYP1A2的活性高低与咖啡 因的代谢快慢之间存在相关性。 在本实施例中，应用实施例2的方法，在健康的中国人群中对CYP1A2基因基于SEQ ID N0 :1中的830位T — C的SNP位点进行了基因分型。并观察不同基因型与血桨咖啡因 代谢比值之间的关系。选取20名(男性和女性各10名)年龄为18-30岁(平均年龄21士2岁)的健康
受试者参与本试验，其中SEQ ID N0:1中的830位为T和C的各10名。整个实验过程按
照国家人类基因组研究伦理学准则进行，并获得了所有受试者的知情同意。 所有受试者均为非吸烟个体，在进行咖啡因代谢率检测前1周之内未曾摄入咖
啡、茶、可口可乐、巧克力以及其它含咖啡因的饮料。同时，所有的受试者试验前l周之内未
曾服用任何药物。 以咖啡因为测试药物，对所有受试者CYP1A2的体内活性进行测定。受试者晨起 (7:00 7:30AM)空腹口服咖内因胶囊100mg。分别在服药前(0小时)和服药后(5小H) 取静脉血5ml，用EDTA抗凝。 离心分离血浆和血细胞，并保存于-2(TC，分别用于进行咖啡因代谢表型的测定。 应用高效液相色谱。紫外检测法对血浆中咖啡因(CMffl)浓度及其代谢产物l，7-二甲基 黄嘌呤(C，f ft)的浓度按以下方法进行测定 0. 5ml待测血浆中加入80 ii M的p-羟乙基茶碱(内标)100微升和300mg硫酸胺， 然后加入5ml氯仿异丙醇(体积比为9 : 1)，振荡2分钟后于2000g离心8分钟，取下 层有机相在氮气下挥发干燥，50微升流动相重新溶解，取20微升上色谱柱。
比值1 =
咖啡因(T基因型)
c咖
X100%
啡因(c基因型)
比值2 =
C
代谢产物(T基因型)
X100%
G代谢产物(c基因型) 结果比值1大于1 (约200 % )，提示SEQID NO : 1中的830位T — C的SNP位点 后，个体的CYP1A2活性和药物代谢活性有所提高(高于普通人群)。 比值2小于1，也提示SEQID NO:l中的830位T — C的SNP位点后，个体的CYP1A2
活性和药物代谢活性有所提高(高于普通人群)。 实施例4 药物代谢活性检测试剂盒 如实施例1所述，SEQ ID NO :1中830位T — C的突变与药物代谢活性检测密切 相关。因此，可基于这个突变设计CYP1A2基因特异性引物在以待测个体的DNA为模板进行 扩增并进行检测。 制备一试剂盒(IOO人次)，它含有
名称序列浓度
有义引物SEQ ID NO: 2lOOpmol
反义引物SEQ ID NO: 3lOOpmol
PCR反应液含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液抽取待测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提 险
l守药物代谢活性检测预测试剂盒中的PCR引物稀释到limol/il，以所提取的DNA
取DNA
为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISMTM377DNA测序仪进行 荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。
或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也 可检测出830位T —C。 结果表明，含830位T — C的测试对象中CYP1A2的mRNA的拷贝数比正常人群高 约40X，且该位点为C的个体的将咖啡因转化为l，7-二甲基黄嘌呤的能力也比正常人群高 (约高35% )。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 参考文献 l)Aklillu E， Carrillo JA， Mako騰n E， Hellman K， Pitarque M， Bertilsson L禾口 Ingelman—Sundberg M(2003)Genetic polymorphismof CYPlA2in Ethiopians
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序列表 〈110〉上海人类基因组研究中心 〈120〉CYP1A2基因的SNP rs4646418及其在相关药物代谢活性检测中的应用
〈130>085803
〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 4 〈210>1 〈211>1680 〈212>DNA 〈213〉人(Homo sapiens) 〈220〉 〈221>misc_feature 〈222〉 (830) . (830) 〈223>SNP rs4646418T — C 〈400〉 1 ggg3ttgg3g卿朋ggtgg cgg鄉gcgg cgggggtggg gggtcgggtg gg固g朋cc 60
cactatggga cacatctcgg tgcctgtaca tagaggggtg agggctggga acacctggaa 120
gtcccaattc caaggcgtcc caagggcagt gcagaaccca gccgaggagg gggcttgagg 180
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ctcctcttcg tcatttttgc acccactgga acgctgggcg tgcagatgcc tccccagcgc 300
P_450mRNA Expression in Human Liver andlts
13
tacagcctaccaggactcggcaggcggggg cggggctgcc ccgtggtgac ctccttcccg360gggttactgagtcccggctcgcgtgagaag cgctgcgacc ccagccctga ggtcacgggg420gccggaaggccagaggcgccgcggggctgg acctgtcccc cagagcccgg gcgactagct480gaggttcgcgcctcttgattg￡l￡lgg￡ltCgg 3￡ltgg￡ltggC g朋ggggCElg gctcgctg3g540cgctcactagcggctcctcgcagcctctag gatcgcctta gtgctgattg caacgcgcgg600tccctccagccaggacccaccggcccttga gggtccctct tggctcccgg ggtggctagt660gctttgattggC3g3gC3C3gaaatccggc ggcggggggc cacggaaaga ctcgggccca720gggaccacggagggggcacctggcgcggag cccccaccct acccccggct agcttgcgtg780cgccggcgacatccctctegggggc卿gg tc郷cggcccgtccccgcy ccacctggcc840cgg郷cgcggtgcccaggcgttgCgtg3g 3￡lgg￡lCCgg￡lggcccgcgca gccacccagc■cgacccattccccggcccggcgcgggggct cgcagtcacgCg3gggggg3 gggElgtCggg960gcggggctctte朋gggccagcctcgcgcg CggCgtggggttggggtgg3 ggg卿gg朋1020ctgtcg朋gggtggCgggtgcgcgattgaa teaggggatgcggtgcaaag ggtcteggtc1080tgcgtgtggcttctgcctgcg郷卿ggC 3gCCtgC3tgtgtccgcatt ttcggtccac1140gcctgtggcaCg3C3Cg朋gccccagtgcc atttggcatggcctegctgc ctgcctccga1200cgctgtcccgccctccggaaccttcctgtt acagggtttccagg朋朋朋a朋gttgtet1260ttgcgtgcctagctcaacctggccccagct aacatcgttecgcgccatcc ccgacgtgct1320cccc朋cccggtggcaccaccatccgtcgc tggtccaggccagaaaatea tcccctcacc1380tcccattccggtcatetgcggcctcgtgca ttgcacaaatattteccaag caactectet1440gtgccaggagctgttcggaggcgctggcga ttgacagaga3ggg朋C3C3 gCtg3C3gC31500ctccteatctcgtggagtttacattctgat gg朋ggagacaagteatetg ccccaaatct1560卿g朋tgtgagagggte朋朋gtgcggtt g朋3朋朋tt3朋cag朋朋ggcgtecgga1620ttetgtgagggC3g3ttgC33ttC朋朋C3 3gggggtC3ggg朋ggcctt gCgg3g卿g1680〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉人(H3mo sapiens)〈400>2ggg￡lttgg￡lg卿朋ggtggCgg3g25〈210>3〈211>25〈212>DNA〈213〉人(H3m0 sapiens)〈400>3ctctctccgcaaggccttccctgac2权利要求
一种体外检测样品是否存在细胞色素氧化酶P450 1A2基因CYP1A2的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤(a)用CYP1A2基因特异性引物扩增样品的CYP1A2基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性830位T→C；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物具有SEQID N0:2或 3的序列。
3. —种用于预测个体的药物代谢活性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增 CYPlA2基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为50-3000bp，且含有SEQ ID N0:1中 第830位的扩增产物。
4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂(i) 与SEQ ID NO :1中第830位的突变结合的探针；或(ii) 识别SEQ ID NO :1中第830位的突变限制性内切酶。
5. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID N0:2或3的序列。
6. —种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列为细胞色素氧化酶 P4501A2基因CYP1A2野生型的基因组核苷酸序列，并且存在SEQ ID NO : 1中第830位T — C突变。
7. —种如权利要求6所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备检测个体的药物 代谢活性的试剂或试剂盒。
8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂为引物、引物集、探针或核酸芯片；更佳地，所述的引物或引物集可特异性地扩增出含SEQ ID N0:1中第830位的扩增产 物；所述的探针能够与含SEQ ID N0:1中第830位的核酸发生特异性结合；和所述的核酸 芯片上含有的探针，所述的探针能够与含SEQ ID N0:l中第830位的核酸发生特异性结合。
9. 一种可用于检测药物代谢活性的核酸芯片，其特征在于，所述的芯片包括基板以及 固定在基板上的寡核苷酸探针，所述的探针能够与含SEQ ID N0:1中第830位的核酸发生 特异性结合，并且鉴别出SEQ ID N0:1中第830位的核苷酸是T还是C。
10. —种对药物代谢活性进行预测的方法，其特征在于，它包括步骤 检测待检个体的CYPla2基因和/或转录本，并与正常的CYP1A2基因和/或转录本相比较是否存在以下的单核苷酸多态性 830位T — C ;其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0:1，如果存在所述的单核苷酸多态性就表明对该个体而言其药物代谢活性高于普通人群。
全文摘要
本发明公开了CYP1A2基因的SNP rs4646418及其在相关药物代谢活性检测中的应用。本发明还提供了一种预先判断药物代谢活性的方法，它包括检测人个体的细胞色素氧化酶P4501A2基因(CYP1A2)、转录本与正常相比是否存在变异，存在变异就表明对该个体而言，其药物代谢活性不同于普通人群或正常人群。本发明还公开了相应的用于预先判断个体的药物代谢活性的检测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101748199SQ20081020446
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者施锦绣, 王大志, 王志敏, 王蓓兰, 雷蓉, 黄薇 申请人:上海人类基因组研究中心