专利名称：结核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及结核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表达载体和应用， 属于生物医学工程领域。
背景技术：
结核病是一种严重危害人类健康的传染性疾病，由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)感染引起。全球大约有三分之一的人感染 过结核(大约21亿)，每年新发病1000万人，卡介苗(BCG)作为预防结核病的 疫苗，近100年来虽然广泛用于新生儿的预防接种，但保护率只有50%左右， 而对成年人的保护率在不同地区，在0 80°/。之间波动；另外接种BCG还能使 少数人发生较严重的并发症，发生播散性感染而致死。鉴于结核病发生的严 重态势，加强结核病的防治工作、探索结核病的早期诊断及研制开发新型预 防、治疗的疫苗，已成为当前国际乃至我国关注的紧迫而优先的课题。
新型抗结核疫苗的研制，选取优势抗原最为重要。结核分枝杆菌的Hsp65 蛋白(热休克蛋白65KD)属于Hsp70家族，有很强的免疫原性，能诱导和增 强机体的体液免疫和细胞免疫的发生，并可激活yST細胞，可以在动物体 内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应，是人体感染结核杆菌 以后免疫系统的主要靶抗原和T细胞攻击的主要对象。因此Hsp65是一种理想 的疫苗候选抗原。来源于结核分支杆菌Esat6是一种非常重要的T细胞免疫 原，是MTB培养早期分泌的相对分子质量为6kD的早期分泌性抗原靶(6kD early secretory antigenic target, Esat6)，由结核分枝杆菌RD1区Y277片 段编码，全长288bp，编码95个氨基酸。Esat6在机体产生保护性免疫应答中， 通过活化巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等释放炎症递质肿瘤坏死因子和 组胺等；并参与诱导树突状细胞分化、成熟并促进y干扰素介导的Esat-6特 异性Thl细胞产生的过程。虽然Hsp65抗原和Esat6分别在感染免疫中的作用 已经被研究证实有效,但对Esat6协同Hsp65抗原在结核杆菌感染中的免疫应 答特点和保护力尚不清楚。转基因植物生物反应器是利用基因工程重组技术和植物自生代谢原理 产生具有特殊功能的蛋白，常见的有人或动物的保护性抗原蛋白、抗体和一 些重要的多肽等，它们具有重要药用价值和商业市场。转基因植物生物反应 器和微生物反应器、动物反应器相比较具有生产成本低、表达产物具有天然 的生物活性、安全性好的优点，这也是转基因植物得到迅速发展的重要原因 之一。
启动子是调控外源基因在植物体内表达的开关，它直接影响到外源基因 在植物体内的丰度、表达组织或发育时期，所以，能否选择到适宜受体植物 的启动子使其有较高的表达量，成为转基因植物发展的一个瓶颈问题。
植物表达启动子分为三种组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型 启动子。目前在绝大多数双子叶转基因植物中广泛使用的启动子是来源于花
椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的 Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子等。CaMV35S、 Actinl、 Ubiquitin等均为强组成型启动子，控制外源的基因在转基因植株的各个部 位和整个生育期表达。CaMV35S启动子在双子叶植物中的表达效率高于单子 叶植物，而Actinl、 Ubiquitin等启动子在单子叶植物中的表达效率较高， 这可能与单、双子叶植物，在转录因子和启动子序列识别上有差异。
选择合适的植物表达启动子，是解决表达量低的有效途径，而选择的依 据主要以受体材料的特性来决定。在植物基因工程研究中， 一个表达载体系 统是至关重要的。目前报道植物转基因研究中多采用高效组成型启动子，如 CaMV35S、画V启动子等，在它们调控下，外源基因在转基因植物中所有的发 育阶段和所有的部位都能表达，这在转抗病基因和抗虫基因时，会收到较好 的效果。但对表达特殊营养成分的基因，例如表达乙肝抗原基因等，外源基 因在植物内持续高效的表达，不仅造成营养成分的浪费，而且往往会造成植 物形态的改变，严重时还会影响到植物的正常发育。
发明内容
本发明的目在于克服现有技术的缺点，提供一种结核Hsp65和Esat6融 合抗原基因。
本发明的另一 目的在于提供一种包含上述结核Hsp65和Esat6融合抗原 基因的玉米表达载体的构建方法。
本发明的再一 目的在于提供上述方法构建的玉米表达载体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现 一种结核Hsp65和Esat6融合抗 原基因，其序列如SEQ ID N0.5所述。
一种包含了上述结核Hsp65和Esat6融合抗原基因的玉米表达载体的构 建方法，包括以下步骤
(1) 根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的编码序列设 计融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1对引物
上游引物序列为Pl 5' - TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTG - 3'，含 BglII酶切位点和起始密码子ATG;
下游引物序列为P2 5' - GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTG - 3'，含 Xba I酶切位点和终止密码子CTA;
(2) 以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板，用步骤(1)设计的引物Pl和 P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65-linker-Esat6;
(3) pCR-G载体的构建
用HindIII和BamHI分别双酶切质粒pUBCG和pCR 2. 1，经琼脂糖电泳 分离，从pUBCG酶切产物回收1. 4kb的玉米种子特异表达启动子Globulin-l， 从pCR 2. 1酶切产物回收3. 9kb的载体片段，将两个回收片段连接、转化获 得重组质粒pCR-G;
(4) pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建
用Sacl和EcoRI分别双酶切质粒pGFP-2和pUC18，经琼脂糖电泳分离， 从pGFP-2酶切产物中回收270bp的nos片段，从pUC18酶切产物中回收2. 6kb 的载体片段，将两个回收片段以T4连接酶连接、转化获得重组质粒pUC18-nos;用Xbal和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位点的DNA 片段，与经相同处理的质粒pC層BIA-1300连接、转化获得重组质粒 pCAMBIA-1300-nos;
用XhoI酶切质粒pMDXl，回收560bp的bar基因片段，用Xhol切除质 粒pCAMBIA-1300-nos内潮霉素抗性基因，回收pCAMBIA-1300-nos并进行末 端脱磷酸；将bar基因片段与pCAMBIA-1300-nos连接、转化获得重组质粒 pCAMBIA1300-nos-bar;
(5)中间载体pCRGHLE的克隆与构建
用BamHI和Xbal分别双酶切步骤(3)所得质粒pCR-G和步骤(2)所 得Hsp65-linker-Esat6，经琼脂糖电泳分离，纯化后进行连接、转化筛选获 得重组载体pCRGHLE;(6)目的载体pCAMBIA1300GHLE的克隆与构建
用HindIII和Xbal双酶切步骤(5)所得重组载体pCRGHLE，得到 globulin-1和Hsp65-linker-Esat6的联合片段，将HindIII和Xbal双酶切 步骤(4)所得pCAMBIA1300-nos-bar后的片段与上述联合片段连接、转化 筛选获得目的载体pCAMBIA1300GHLE。
步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在95'C预 变性5 min,然后进入下列循环95°C、 30 s, 56°C、 50 s， 72°C、 90 s，共 进行40个循环，最后72"C延伸10min，扩增完毕后置4'C终止反应；所述混
合液组成如下
浓度为10umo1/1的上游引物Pl 1 y 1
浓度为lOumol/1的下游引物P2 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的浓度
各为2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
pEGFPHsp65-Esat6 1 u 1
Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 u 1
Ex耐热性DNA聚合酶 0. 3 u 1
灭菌水 37. 7 u 1
上述方法构建的结核Hsp65和Esat6融合抗原基因玉米表达载体作为制 备疫苗的用途。该载体是植物双元表达载体，可以携带结核Hsp65和Esat6 融合抗原基因被转化到农杆菌中，介导转化玉米幼胚，继而获得玉米转基因 植株，也可以将结核Hsp65和Esat6融合抗原基因整合到植物基因组中，使 抗原基因在植物中正常表达出含有结核Hsp65和Esat6融合抗原基因的表达 蛋白质作为口服疫苗。
本发明的原理是(l)改造质粒pCR 2. 1，插入种子特异表达启动子 globulin-1;改造质粒pCAMBIA1300，插入nos终止序列和选择标记bar基 因，除去原有的潮霉素抗性基因；将结核杆菌的优势抗原Hsp65和Esat-6 基因导入到植物表达载体pCAMBIA1300中， 一同导入表达载体的还有玉米胚 乳特异性表达启动子glubulin-l基因和bar基因及nos终止子；(2) globulin-1是来源于玉米的特异性启动子，可以带动插入下游的外源基因在 玉米胚乳中大量表达；(3) pCAMBIA1300载体自带的CaMV35S组成型启动子 也可以带动插入下游的外源基因在玉米胚乳中大量表达。
基因Hsp65和Esat6在NCBI中的登陆号为M15467和AF420491。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果(1)本发明将
Hsp65和Esat6两种抗原同时克隆到同一载体上，构建含结核杆菌Hsp65和 Esat6的融合质粒，以期融合Hsp65和Esat6 口服疫苗能比其中一种口服疫苗 单独的免疫效果强；(2)本发明构建由玉米种子特异表达启动子globulin-l 调控的结核优势抗原Hsp65和Esat6融合基因表达载体，使其特异、高效地 在玉米种子中表达，可以克服组成型启动子在应用中的缺陷，这一研究在国 内外鲜有报道；目前，本实验室已经利用农杆菌介导转化玉米幼胚，获得部 分转基因植株，为进一步研究利用转基因玉米生产结核Hsp65和Esat6融合 抗原基因口服疫苗的免疫效果奠定基础。
图1是PCR扩增的Hsp65-linker-Esat6图。
图2是表达载体pCAMBIA1300示意图(含bar和nos终止子)。
图3是中间载体pCRG示意图。
图4是重组载体pCAMBIA1300GHLE示意图。
图5是pCRG构建示意图。
图6是pCAMBIA1300-nos-bar构建示意图。
图7是pCAMBIA1300GHLE构建示意图。
图8是pCRGHLE双酶切琼脂糖凝胶电泳图，
其中，1为pCRGHLE的hindIII和xbal双酶切产物；M为lkb DNA ladder marker。
图9是pCAMBIA1300GHLE双酶切琼脂糖凝胶电泳图，
其中，M为lkb DNA ladder marker; 1为pCAMBIA1300GHL质粒；2为 pCAMBIA 1300GHLE的hindlll和xbal双酶切产物；3为pCAMBIA1300单酶切 产物。
图10是pCRG HindlII+BamHI双酶切琼脂糖凝胶电泳图， 其中，l-3为pCRG HindiII+BamHI双酶切产物；M为250bp marker。 图11是pCAMBIA1300-nos Xbal+EcoRI双酶切琼脂糖凝胶电泳图， 其中，1-3为pCAMBIA1300-nos的Xbal+EcoRI双酶切产物；M为250bp marker 0
图12是pCAMBIA1300-nos—bar Xhol单酶切琼脂糖凝胶电泳图， 其中，M为250bp marker; 1为pCAMBIA 1300—nos— bar的Xhol单酶切产物。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施 方式不限于此。
首先对实验材料的说明如下
质粒pUBCG、 pGFP-2、 pUC18、 pCR 2. 1、 pCAMBIA1300 (均为广东省农 业科学院作物所玉米室提供)；pEGFPHsp65-Esat6 (本实验室保存)；玉米种 子特异表达启动子为本广东省农业科学院作物所玉米室自主分离。
大肠杆菌菌株XLl-blue (本实验室保存)；
试剂酶类(大连宝生物公司)；试剂盒(质粒提取试剂盒，PCR产物清 洁试剂盒，DNA胶回收纯化试剂盒)(OMEGA); PCR引物合成(上海生工生物 工程公司)；重组质粒上目的基因的序列测定(广州拓谱公司)；
农杆菌菌株LBA4404 (广东省农业科学院作物所玉米室提供)
培养基LB培养基用于大肠杆菌的培养。YEB培养基用于农杆菌的培养。
实施例1: Hsp65 — linker—Esat-6基因的克隆与质粒载体的构建
(1) 克隆基因引物的设计
根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的CDS序列设计融合 抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1对引物，
上游引物序列为Pl 5' TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTG - 3'，含 BglII酶切位点和起始密码子ATG;
下游引物序列为P2 5' - GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTG _ 3'，含 Xba I酶切位点和终止密码子CTA.
(2) PCR反应与克隆
以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板，用引物PI, P2进行PCR扩增 Hsp65-linker-Esat6,具体步骤如下将混合液在95。C预变性5 min，然后 进入下列循环95°C、 30s，56°C、 50 s， 72°C、 90 s，共进行40个循环，最 后72'C延伸10min，扩增完毕后置4"C终止反应；所述混合液组成如下 浓度为10umo1/1的上游引物Pl 1 u 1
浓度为lOumol/1的下游引物P2 1 U 1浓度
各为2. 5 mM的dNTP混合物 4 u 1
pEGFPHsp65-Esat6 1 u 1
Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 u 1
Ex耐热性DNA聚合酶 0. 3 u 1
灭菌水 37. 7 u 1
PCR产物上样电泳(质量分数为0. 7%的琼脂糖)，回收1. 9KB的目的条 带，如图1所示，带1为Hsp65-1 inker-Esat6片断，带2为Takara公司lkb DNA marker,用OMEGA PCR产物清洁试剂盒纯化并溶于50ulddH20.
(3) pCR-G载体的构建(构建示意图如图5所示)
用Hindlll和BamHI分别双酶切质粒pUBCG和pCR 2. 1，经质量分数为0. 8% 的琼脂糖分离，从pUBCG酶切产物回收1.4kb的玉米种子特异表达启动子 globulin-1，从pCR 2. 1酶切产物回收3. 9kb的载体片段，将两个回收片段 用T4连接酶连接，转化大肠杆菌XL1-Blue,酶切鉴定获得重组质粒pCR-G (结构示意图见图3)，酶切验证(如图IO所示)。
(4) pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建(构建示意图如图6所示)
用Sacl和EcoRI完全双酶切质粒pGFP-2和pUC18，经质量分数为1%的 琼脂糖分离后用DNA快速回收试剂盒从pGFP-2酶切产物中回收270bp的nos 片段，从pUC18酶切产物中回收约2.6kb的载体，将两个回收片段以T4连 接酶连接，然后转化大肠杆菌XL1-Blue，酶切鉴定重组质粒pUC18-nos;再 用Xbal和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位点的DNA片段， 与经相同处理的质粒pCAMBIA-1300 (结构示意图见图2)用T4连接酶连接、 转化大肠杆菌XL1-Blue，酶切鉴定获得的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-nos，限制酶切与测序鉴定插入片段为nos (如图8所示)。
用XhoI酶切质粒pMDXl，回收约560bp的bar基因，用Xhol切除质粒 pCAMBIA-1300-nos内潮霉素抗性基因，回收大片段pCAMBIA-1300-nos并进 行末端脱磷酸(如图11所示)；将含有bar基因片段的DNA与 pCAMBIA-1300-nos用T4连接酶连接，转化大肠杆菌XL1-Blue，酶切鉴定获 得的重组质粒。利用限制性酶切和测序鉴定bar基因插入方向，将构建的质 粒的命名为pCAMBIA1300-nos-bar (如图12所示)。
(5) 中间载体pCRGHLE的克隆与构建
用BamHI和Xbal分别双酶切步骤(3)所得质粒pCR-G和步骤(2)所所示)经琼脂糖电泳分离，纯化后，用T4 连接酶进行连接，转化感受态细胞；感受态细胞的制备，重组质粒筛选等方 法参见《分子克隆》(Maniatis等，1989)。筛选到正确的重组子pCRGHLE。 (6)目的载体pCAMBIA1300GHLE的克隆与构建(构建示意图如图7所示) 用HindIII和Xbal双酶切步骤(5)所得重组载体pCRGHLE，得到 globulin-1和Hsp65-linker-Esat6的联合片段，将HindIII和Xbal双酶切 步骤(4)所得pCAMBIA1300-nos-bar后的片段与上述联合片段用T4连接酶 连接，转化感受态细胞，筛选正确的重组子pCAMBIA1300GHLE (结构示意图 见图4，双酶切琼脂糖凝胶电泳图如图9所示)。
实施例2
提取筛选实施例l所得重组表达载体pCAMBIA1300GHLE，电击法转化农杆 菌LBA4404，方法参照卢圣栋《现代分子生物学实验技术》。提取质粒后用 HindIII和XbaI进行双酶切，鉴定，最终确定重组质粒pCAMBIA1300GHLE转入 到了LBA4404中。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述 实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护 范围之内。序列表
<110>暨南大学
〈120>结核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表达载体和应用
<130〉 8
〈160〉 3
<170〉 Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211〉 1075
〈212〉 腿
〈213〉 结核Hsp65和Esat6融合抗原基因
〈400〉 1
gaatgggcactgatagatcc atgcccccat gtcgccgccaccgggaacggaagccttctc60
cttttccggcttgtcggcaa cgacggcctc ggtggtcaggaacagccccgcgatggacgc120
cgcattctgcagcgccgaac gggtcacctt gaccgggtcagc犯cgccggcagcgagcag180
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ctcggccaccacgcccggct ccagcccgga gttg犯ggcgatctgcttcagcggggcctc300
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tcacgagtaccccgagatgt agcccttgtc gacgcataccctcggtgagctcgag1075
<210> 2 <211> 27〈212〉 DNA
〈213〉 融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的上游引物 〈400〉 2
ttagatctgc aatggccaag acaa/ttg 27
〈210〉 3 〈211〉 27 〈212〉 DNA
<213〉融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的下游引物 〈400〉 3
gctctagact atgcgaacat cccagtg 2权利要求
1、一种结核Hsp65和Esat6融合抗原基因，其特征在于其序列如SEQID NO.1所述。
2、 一种包含了权利要求1所述结核Hsp65和Esat6融合抗原基因的玉米表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1) 根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的编码序列设 计融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1对引物上游引物序列为Pl 5' - TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTG - 3'，含 BglII酶切位点和起始密码子ATG;下游引物序列为P2 5' - GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTG - 3'，含 Xba I酶切位点和终止密码子CTA;(2) 以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板，用歩骤(1)设计的引物Pl和 P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65-1 inker-Esat6;(3) pCR-G载体的构建用HindIII和BamHI分别双酶切质粒pUBCG和pCR 2. 1，经琼脂糖电泳 分离，从pUBCG酶切产物回收1.4kb的玉米种子特异表达启动子globulin-l， 从PCR 2. 1酶切产物回收3. 9kb的载体片段，将两个回收片段连接、转化获 得重组质粒pCR-G;(4) pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建用Sacl和EcoRI分别双酶切质粒pGFP-2和pUC18，经琼脂糖电泳分离， 从pGFP-2酶切产物中回收270bp的nos片段，从pUC18酶切产物中回收2. 6kb 的载体片段，将两个回收片段连接、转化获得重组质粒pUC18-nos;用XbaI 和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位点的DNA片段，与经相 同处理的质粒pCAMBIA-1300连接、转化获得重组质粒pCAMBIA-1300-nos;用XhoI酶切质粒pMDXl，回收560bp的bar基因片段，用Xhol切除质 粒pC扁BIA-1300-nos内潮霉素抗性基因，回收pCAMBIA-1300-nos并进行末 端脱磷酸；将bar基因片段与pCAMBIA-1300-nos连接、转化获得重组质粒 pCAMBIA1300-nos-bar;(5)中间载体pCRGHLE的克隆与构建用BamHI和Xbal分别双酶切步骤(3)所得质粒pCR-G和步骤(2)所 得Hsp65-linker-Esat6，经琼脂糖电泳分离，纯化后进行连接、转化筛选获得重组载体pCRGHLE;(6)目的载体pCAMBIA1300GHLE的克隆与构建用HindIII和Xbal双酶切步骤(5)所得重组载体pCRGHLE，得到 globulin-l和Hsp65-linker-Esat6的联合片段，将HindIII和Xbal双酶切 步骤(4)所得pCAMBIA1300-nos-bar后的片段与上述联合片段连接、转化 筛选获得目的载体pCAMBIA1300GHLE。
3、 根据权利要求2所述玉米表达载体的构建方法，其特征在于步骤 (2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下将混合液在95'C预变性5 min，然后进入下列循环95°C、 30 s，56。C、 50 s， 72°C、 90 s,共进行40个循 环，最后72。C延伸10min，扩增完毕后置4。C终止反应；所述混合液组成如下浓度为10umo1/1的上游引物Pl 1 " 1浓度为lOumol/l的下游引物P2 1 u 1 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的浓度各为2.5 mM的dNTP混合物 4 u 1pEGFPHsp65-Esat6 1 ti 1Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液 5 u 1Ex耐热性DNA聚合酶 0. 3 p 1灭菌水 37. 7 y 1
4、 根据权利要求2所述方法构建的玉米表达载体作为制备疫苗的用途。
全文摘要
本发明公开了一种结核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表达载体和应用。该玉米表达载体的构建方法是(1)根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的编码序列设计融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1对引物P1和P2；(2)以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板，用引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65-linker-Esat6；(3)pCR-G载体的构建；(4)pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建；(5)中间载体pCRGHLE的克隆与构建；(6)目的载体pCAMBIA1300GHLE的克隆与构建。本发明结核Hsp65和Esat6融合抗原基因的表达载体可用于制备疫苗。
文档编号C12N15/31GK101613701SQ20081022069
公开日2009年12月30日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者李君武, 胡建广 申请人:暨南大学