专利名称：：一种蜈蚣草经绿色球状体再生植株的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种蜈蚣草经绿色球状体再生植株的方法及其专用培养基。
背景技术：
：土壤和水中砷污染已成为一个全球性主要环境问题(Meharg，2004)。目前世界上有数千万人正遭受砷污染的土壤、地下水和各种食物的慢性毒性效应的威胁(Smithetal.，1992)。蕨类植物蜈蛇草(尸z^rAL)作为第一个被报道具有砷超富集功能的植物，可以被应用于砷污染土壤的植物修复(Maetal.,2001)。然而到目前为止，蜈蚣草对砷的积累和解毒机制并不清楚，其重要原因一方面在于蜈蚣草孢子体是一种基因组大且生长缓慢的植物，难以用突变体诱导等遗传学方法对其进行研究，另一方面在于蜈蚣草的组织培养植株再生和遗传转化的系统尚未建、,:通过建立植物高效组织培养再生体系和生物遗传转化方法可以有效地改善植物性状并为研究这些性状发生的分子机制提供实验系统。对于蕨类植物，目前已有一些通过孢子再生植物的方法，研究表明，其中所用的原料(如带有孢子的羽叶或者分离的孢子)(Pieriketal.，1986)、不同的表面消毒剂(如次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞或过氧化氢)(Fay，1994)、矿质营养以及光照、pH、培养基的物理状态和植物生长调节剂等都会影响蕨类植物配子体的发育(SwamiandRaghav肌，1980;SheffieldandBell，1987;Ferndndezetal.，1997a，b,1999)。尽管有人利用蜈蚣草孢子进行了快速组培繁殖以提供足够的种苗用于土壤砷污染的修复(陈同斌，2007;BreznovitsandMohay，1987)，但到目前为止仍没有建立一个有效的用于蜈蚣草遗传转化的植株再生系统。
发明内容本发明的一个目的是提供一种培育蕨类植物绿色球状体的方法。本发明所提供的培育蕨类植物绿色球状体的方法，是以蕨类植物的根状茎为外植体，用植物组织培养基进行培养，得到绿色球状体；所述植物组织培养基是通过向1/2MS-MS培养基中添加终浓度为18-22g/L的蔗糖、终浓度为4-6g/L的琼脂、终浓度为0.3-0.7mg/L的GA和终浓度为0.4-0.6mg/L的6-BA得到的培养基；所述终浓度为在所述植物组织培养基中的浓度。所述植物组织培养基优选为通过向1/2MS培养基中添加终浓度为20g/L的蔗糖、终浓度为5g/L的琼脂、终浓度为0.5mg/L的GA和终浓度为0.5mg/L的6-BA得到的培养基。所述植物组织培养基的pH值为5.8-6.0。所述培养的条件为温度为23-27t:、光周期为14一16h光照/10-8h黑暗、光照强度为2500-2300lux;所述温度优选为25°C，所述光周期优选为15h光照/9h黑暗，所述光照强度优选为24001ux。其中，所述根状茎具体可以是通过组织培养得到的。所述组织培养的方法可为将所述蕨类植物的孢子接种于孢子萌发培养基，培养得到所述根状茎。所述孢子萌发培养基是通过向1/8MS-MS培养基中添加终浓度为10-40g/L的蔗糖、终浓度为3-7g/L的琼脂得到的培养基；所述终浓度为在所述孢子萌发培养基中的浓度；所述孢子萌发培养基优选为通过向1/2MS培养基中添加终浓度为20g/L的蔗糖、终浓度为5g/L的琼脂得到的培养基。上述蕨类植物具体可为蜈蚣草(尸ter^L)。本发明的另一个目的是提供一种植物组织培养基。本发明所提供的植物组织培养基，是通过向1/2MS-MS培养基中添加终浓度为18-22g/L的蔗糖、终浓度为4-6g/L的琼脂、终浓度为0.3-0.7mg/L的GA和终浓度为0.4-0.6mg/L的6-BA得到的培养基；所述终浓度为在所述植物组织培养基中的浓度；所述植物组织培养基优选为向y2MS培养基中添加终浓度为20g/L的蔗糖、终浓度为5g/L的琼脂、终浓度为0.5mg/L的GA、终浓度为0.5mg/L的6-BA得到的土肯养基o所述植物组织培养基适应于蕨类植物绿色球状体的诱导。本发明的另一个目的是提供一种培育蜈蚣草的方法，即蕨类植物经绿色球状体再生植株的方法。本发明所提供的培育蜈蚣草的方法，是用上述任一所述方法培育得到蜈蚣草绿色球状体，再对所述绿色球状体进行培养，得到蜈蚣草再生植株。其中，对所述绿色球状体进行培养的方法是对绿色球状体逐步进行芽和根的诱导。本发明建立了一套以蜈蚣草无菌孢子体根状茎为外植体、诱导得到绿色球状体、再诱导绿色球状体分化再生孢子体的培养体系。实验证明，用本发明的培养基及培养方法诱导得到绿色球状体的诱导率可达70%以上，绿色球状体进行芽分化的分化率可达98%;而且本发明方法具有时间短、成本低、操作简单的特点。因此，用本发明方法可以大量快速繁殖得到绿色球状体，为各种遗传转化研究操作(如农杆菌介导法、基因枪法等)提供理想的材料，为研究蜈蚣草砷富集和解毒的分子机制提供理想的研究系统。本发明方法及培养基适于在蜈蚣草的组织培养和快速繁殖中也可推广应用。图1为蜈蚣草绿色球状体。图2为由绿色球状体分化再生的具有根和芽的蜈蚣草孢子体。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料试剂等如无特殊说明，均可从市面公司购买。下述实施例中使用MS、'/2MS、％MS、1/8MS培养基；其中，'AMS、％MS、1/8MS中各物质的浓度是MS培养基中相应各物质浓度的1/2、％、1/8，培养基的pH用NaOH或者HC1调到5.8—6.0。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>CoCl26H200.025Na2-EDTA37.3FeS04.7H2O27.8有机成分烟酸0.5盐酸吡哆醇(VB6)0.5烟酸硫胺素(VB。0.1甘氨酸2.0肌醇100.0实施例l、蜈蚣草的植株再生一、蜈蚣草的植株再生I1、蜈蚣草孢子萌发及配子体、孢子体培养从温室中采集成熟的蜈蚣草(尸"2^sw'"3tsL)孢子0.lg，在1.5ml的离心管中采用0.3%NaCIO消毒10min，然后在13，000g/min离心5min，离心后收集底部孢子采用无菌水冲洗4次，悬浮于0.5ml无菌水中，然后接种在如下孢子萌发及配子体、孢子体培养基，在25。C、光周期为15h光照/9h黑暗的、光照强度为24001ux的条件下进行培养。孢子萌发及配子体、孢子体生长培养基组成如下^MS+20§几蔗糖+5g/L琼脂；pH值为5.9。实验设3次重复，平均18d孢子开始萌动，培养45d后产生的配子体的鲜重平均每瓶6.15±0.07g(每瓶接种0.1ml孢子悬浮液)，平均培养70d后形成带有根状茎的孢子体苗。2、绿色球状体(Greenglobularbodies,GGB)的诱导取步骤1中得到的蜈蚣草无菌孢子体根状茎作为外殖体；将无菌的蜈蚣草孢子体根状茎放在诱导培养基中，在25'C、光周期为15h光照/9小时黑暗的、光照强度为24001ux的条件下进行培养。共培养了50个外殖体。诱导培养基组成如下'AMS+20g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.5mg/LGA+0.5mg/L6-BA;pH值为5.9。实验设3次重复，培养20天后，根状茎顶端部位逐渐产生单个绿色球状体，绿色球状体呈紧实绿色毛状颗粒状(图l)，其结构与愈伤组织不同，而与兰花的原球茎相似。之后绿色球状体不断增大或不断产生新的绿色球状体并多个密集在一起，50天后，绿色球状体诱导率基本达到最大值，平均诱导率为76%。平均诱导率二产生绿色球状体外殖体的数目/总的外殖体数目X100%。2、芽的诱导在培养蜈蚣草产生绿色球状体后，将绿色球状体转移到分化培养基上，在25°C、光周期为15h光照/9h黑暗的、光照强度为24001ux的条件下进行培养。分化培养基组成如下％MS+20§几蔗糖+5g/L琼脂；pH值为5.9。实验设3次重复，平均30d后绿色球状体开始发生芽的分化，产生绿点，随后绿点向上生长而产生叶片，形成无根小苗。平均分化率为98%。分化率=产生芽的绿色球状体的数目/总的绿色球状体的数目。3、根的诱导从绿色球状体诱导形成无根小苗后，将小苗转移至生根培养基中，在25'C、光周期为15h光照/9h黑暗的、光照强度为24001ux的条件下进行培养。生根培养基组成如下'AMS+20§几蔗糖+5g/L琼脂；pH值为5.1。实验设3次重复，结果表明，继续培养12个月，随着孢子体地上部分的生长，地下部分逐渐长出不定根(图2)。二、蜈蚣草的植株再生II1、蜈蚣草孢子萌发及配子体、孢子体培养从温室中采集成熟的蜈蚣草孢子0.lg，在1.5ml的离心管中采用0.3%NaClO消毒IOmin，然后在13，000g/min离心5min，离心后收集底部孢子采用无菌水冲洗4次，悬浮于0.5ml无菌水中，然后接种在附加蔗糖10g/L的1/8MS基本培养基上，在23。C、光周期为14h光照/10h黑暗的、光照强度为2300lux的条件下进行培养。孢子萌发培养基组成如下1/8MS+10§几蔗糖+3g/L琼脂；pH值为5.8。实验设3次重复，平均30d孢子开始萌动，培养45d后产生的配子体的鲜重平均每瓶4.35士0.12(每瓶接种O.1ml孢子悬浮液)，平均培养70d后形成带有根状茎的孢子体苗。2、绿色球状体的诱导取蜈蚣草无菌孢子体根状茎作为外殖体；将无菌的蜈蚣草孢子体根状茎放在诱导培养基中，在23X:、光周期为14h光照/10小时黑暗的、光照强度为23001ux的条件下进行培养。共培养了50个外殖体。诱导培养基组成如下1/2MS+18g/L蔗糖+4g/L琼脂+0.3mg/LGA+0.4mg/L6-BA;pH值为5.8。实验设3次重复，培养20天后，根状茎顶端部位逐渐产生单个绿色球状体，绿色球状体呈紧实绿色毛状颗粒状，其结构与愈伤组织不同，而与兰花的原球茎相似。之后绿色球状体不断增大或不断产生新的绿色球状体并多个密集在一起，50天后，绿色球状体诱导率基本达到最大值，平均诱导率为46%。平均诱导率=产生绿色球状体外殖体的数目/总的外殖体数目X100%。2、芽的诱导在培养蜈蚣草产生绿色球状体后，将绿色球状体转移到分化培养基上，在23°C、光周期为14h光照/10h黑暗的、光照强度为23001ux的条件下进行培养。分化培养基组成如下1/2MS+188几蔗糖+4g/L琼脂；pH值为5.8。实验设3次重复，平均30d后绿色球状体开始发生芽的分化，产生绿点，随后绿点向上生长而产生叶片，形成无根小苗。平均分化率为98%。分化率=产生芽的绿色球状体的数目/总的绿色球状体的数目。3、根的诱导从绿色球状体诱导形成无根小苗后，将小苗转移至生根培养基中，在23t:、光周期为14h光照/10h黑暗的、光照强度为23001ux的条件下进行培养。生根培养基组成如下1/2MS+18§/1蔗糖+4g/L琼脂;pH值为5.0。实验设3次重复，结果表明，继续培养12个月，随着孢子体地上部分的生长，地下部分逐渐长出不定根。三、蜈蚣草的植株再生III1、蜈蚣草孢子萌发及配子体、孢子体培养从温室中采集成熟的蜈蚣草孢子0.1g，在1.5ml的离心管中采用0.3%NaC10消毒IOmin，然后在13，000g/min离心5min，离心后收集底部孢子采用无菌水冲洗4次，悬浮于0.5ml无菌水中，然后接种在附加蔗糖40g/L的MS基本培养基上，在27。C、光周期为16h光照/8h黑暗的、光照强度为2500lux的条件下进行培养。孢子萌发培养基组成如下MS+40§几蔗糖+7g/L琼脂；pH值为6.0。实验设3次重复，平均30d孢子开始萌动，培养45d后产生的配子体的鲜重平均每瓶4.75士0.15(每瓶接种O.1ral孢子悬浮液)，平均培养55d后形成带有根状茎的孢子体苗。2、绿色球状体的诱导取蜈蚣草无菌孢子体根状茎作为外殖体；将无菌的蜈蚣草孢子体根状茎放在诱导培养基中，在27X:、光周期为16h光照/8小时黑暗的、光照强度为25001ux的条件下进行培养。共培养了50个外殖体。诱导培养基组成如下MS+228几蔗糖+6§几琼脂+0.7mg/LGA+0.6mg/L6-BA;pH值为6.0。实验设3次重复，培养20天后，根状茎顶端部位逐渐产生单个绿色球状体，绿色球状体呈紧实绿色毛状颗粒状，其结构与愈伤组织不同，而与兰花的原球茎相似。之后绿色球状体不断增大或不断产生新的绿色球状体并多个密集在一起，50天后，绿色球状体诱导率基本达到最大值，平均诱导率为63%。平均诱导率=产生绿色球状体外殖体的数目/总的外殖体数目X100%。2、芽的诱导在培养蜈蚣草产生绿色球状体后，将绿色球状体转移到分化培养基上，在27°C、光周期为16h光照/8h黑暗的、光照强度为25001ux的条件下进行培养。分化培养基组成如下MS+22§几蔗糖+6g/L琼脂；pH值为6.0。实验设3次重复，平均30d后绿色球状体开始发生芽的分化，产生绿点，随后绿点向上生长而产生叶片，形成无根小苗。平均分化率为80%。分化率=产生芽的绿色球状体的数目/总的绿色球状体的数目。3、根的诱导从绿色球状体诱导形成无根小苗后，将小苗转移至生根培养基中，在27'C、光周期为16h光照/8h黑暗的、光照强度为25001ux的条件下进行培养。生根培养基组成如下MS+22§几蔗糖+6g/L琼脂；pH值为5.0。实验设3次重复，结果表明，继续培养12个月，随着孢子体地上部分的生长，地下部分逐渐长出不定根。权利要求1、一种培育蕨类植物绿色球状体的方法，是以蕨类植物的根状茎为外植体，用植物组织培养基进行培养，得到绿色球状体；所述植物组织培养基是通过向1/2MS-MS培养基中添加终浓度为18-22g/L的蔗糖、终浓度为4-6g/L的琼脂、终浓度为0.3-0.7mg/L的GA和终浓度为0.4-0.6mg/L的6-BA得到的培养基；所述终浓度为在所述植物组织培养基中的浓度。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物组织培养基是通过向1/2MS培养基中添加终浓度为20g/L的蔗糖、终浓度为5g/L的琼脂、终浓度为0.5mg/L的GA和终浓度为0.5rag/L的6-BA得到的培养基。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述培养的条件为温度为23-27。C、光周期为14—16h光照/10-8h黑暗、光照强度为2500-2300lux;所述温度优选为25°C，所述光周期优选为15h光照/9h黑暗，所述光照强度优选为24001ux。4、根据权利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述根状茎是通过组织培养得到的。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述组织培养的方法为将所述蕨类植物的孢子接种于孢子萌发及配子体、孢子体生长培养基，培养得到所述根状茎；所述孢子萌发及配子体、孢子体生长培养基是通过向1/脂S-MS培养基中添加终浓度为10-40g/L的蔗糖、终浓度为3-7g/L的琼脂得到的培养基；所述终浓度为在所述孢子萌发及配子体、孢子体生长培养基中的浓度。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述孢子萌发及配子体、孢子体生长培养基是通过向1/2MS培养基中添加终浓度为20g/L的蔗糖、终浓度为5g/L的琼脂得到的培养基。7、根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述蕨类植物为蜈蚣草(尸terz'sp^'ftafsU。8、一种植物组织培养基，是通过向1/2MS-MS培养基中添加终浓度为18-22g/L的蔗糖、终浓度为4-6g/L的琼脂、终浓度为0.3-0.7mg/L的GA和终浓度为0.4-0.6mg/L的6-BA得到的培养基；所述终浓度为在所述植物组织培养基中的浓度。9、根据权利要求8所述的植物组织培养基，其特征在于所述植物组织培养基是向y2MS培养基中添加终浓度为20g/L的蔗糖、终浓度为5g/L的琼脂、终浓度为0.5mg/L的GA、终浓度为0.5mg/L的6-BA得到的培养基。10、一种培育蜈蚣草的方法，是用权利要求1-7中任一所述方法培育得到蜈松草绿色球状体，再对所述绿色球状体进行培养，得到蜈蛇草。全文摘要本发明公开了一种培育蜈蚣草绿色球状体的方法及其专用培养基。该方法是以蕨类植物的根状茎为外植体，用植物组织培养基进行培养，得到绿色球状体；所述植物组织培养基是通过向1/2MS-MS培养基中添加终浓度为18-22g/L的蔗糖、终浓度为4-6g/L的琼脂、终浓度为0.3-0.7mg/L的GA和终浓度为0.4-0.6mg/L的6-BA得到的培养基；所述终浓度为在所述植物组织培养基中的浓度。实验证明，用本发明的培养基及培养方法诱导得到绿色球状体的诱导率可达70％以上，绿色球状体进行芽分化的分化率可达98％；而且本发明方法具有时间短、成本低、操作简单的特点。文档编号C12N5/04GK101422135SQ20081023994公开日2009年5月6日申请日期2008年12月15日优先权日2008年12月15日发明者何振艳,徐文忠,戴晓静,郑永强,密麻申请人:中国科学院植物研究所