口腔鳞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物的制作方法

专利名称：：口腔鳞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物的制作方法
技术领域：
：本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种口腔鳞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物
背景技术：
口腔鳞癌(oralsquamouscarcinoma,0SCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，是一种典型的口腔鳞癌，发病率占全身肿瘤的3%。每年全球有30万新发病例，而其中只有50%的患者生存时间大于5年。早期诊断的0SCC预后较好；而对于晚期病损，常规的手术治疗、放疗、化疗均效果不佳。早期诊断OSCC和防止其复发是提高鳞癌患者生存率的关键因素，因此，如何早期检测OSCC病损和寻找有效药物治疗晚期和复发患者，是临床亟待解决的难题。RACKl(rec印torforactivatedC-kinase1)(也叫鸟苷酸结合蛋白亚基或活化剂酶C受体)作为一个新近发现的蛋白激酶C(PKC)受体蛋白在近年来受到极大关注。它能与一系列关键信号分析进行交互作用，学者们认为它可能在重要的生物学反应如细胞生长分化转移侵袭方面发挥关键的调节作用。RACK1是一种具有WD端重复序列的蛋白，据预测有与G蛋白亚基同源的7螺旋结构。这个蛋白在真核生物中高度保守，它在哺乳动物和人类的脑肝脾中均有表达，提示其在大多数细胞中有重要作用。这个蛋白能与广泛的激酶和受体作用，包括PKC及其亚基，PDE4D5，Src激酶家族，EB病毒，HIV-1Nef蛋白，IGF-1受体等。有四条通路参与了RACK1的信号转导，包括PKC通路、PDE4D5通路、酪氨酸激酶/磷脂酶通路和STAT通路。正因为它与不同类型的激酶活受体结合参与多条信号通路，可能对生物体产生相反的结果。以对细胞生长的调控为例，有报道显示RACKl与抑癌基因Src酪氨酸激酶结合，诱导G1期部分阻滞，可抑制NIH3T3细胞生长RACKl抑制Src为非MAPK依赖性PDGF信号传导，最近研究表明stat3通路可能涉及此机制。而与之相反的是，RACK1与PKC结合则可促进细胞增殖。对RACK1与肿瘤的组织学研究，仅有报道运用原位杂交的方法显示在肿瘤血管生成中RACK1基因上调，基于血管生成在肿瘤发生中的作用，提示RACK1为癌变相关因子，但未见后续详尽的体内实验或临床样本报道。到目前为止，未见有通过检测RACKl蛋白的表达水平和其mRNA的含量来早期诊断口腔鳞癌疾病的诊断试剂及试剂盒的相关报道，也未见有可以有效防治口腔鳞癌的药物的相关报道
发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种通过检测RACKl蛋白的表达水平和其mRNA的含量来早期诊断口腔鳞癌疾病的诊断试剂。该口腔鳞癌诊断试剂含有可检测RACK1蛋白的表达水平和其mRNA的含量的试剂。其中，上述可检测RACK1蛋白的表达水平的试剂包括RACK1蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。进一步的，上述多克隆抗体或单克隆抗体上耦联有标记物。更进一步的，所述的标记物为同位素标记物或荧光标记物。其中，上述的检测RACKl蛋白mRNA含量的试剂包括能特异扩增RACKl蛋白mRNA的PCR引物进一步的，上述能特异扩增RACK1蛋白mRNA的PCR引物包括如下弓1物对Sense5'-GCTCTGCCATAAACTTCTAGCGTGTGC-3'(SEQIDNO.1)antisense5'-CTGTGCTTCTGGAGGCAAGGATGGCCA-3'(SEQIDN0.2)。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种上述诊断试剂在制备诊断口腔粘膜癌疾病的试剂中的用途。本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种可以早期诊断口腔鳞癌的诊断试剂盒或生物芯片。该口腔鳞癌诊断试剂盒或生物芯片含有上述的口腔鳞癌诊断试剂。本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种用于治疗口腔鳞癌的药物，该药物能改变RACK1蛋白的表达水平或其mRNA含量。进一步的，上述能改变RACKl蛋白的表达水平或其mRNA含量的药物可以是化学药、中药、化学药物组合物、中药组合物或生物制品中至少一种。进一步的，上述的生物制品可以是RACK1蛋白的RNA干扰分子。更进一步的，上述RACK1蛋白的RNA干扰分子包括下述核苷酸序列siRACKl-231:sense5'—CAGGGAUGAGACCAACUAUdTdT—3'(SEQIDNO.3)antisense5，—AUAGUUGGUCUCAUCCCUGdGdT—3(SEQIDNO.4)或者siRACKl-1036:sense5'—GGCACACGCUAGAAGUUUAdTdT—3(SEQIDNO.5)antisense5'—UAAACUUCUAGCGUGUGCCdAdA—3(SEQIDNO.6)中的至少一组。本发明的内容还包括能编码上述RNA干扰分子序列的DNA序列，以及能表达上述RNA干扰分子序列的表达载体或者细胞系。本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种筛选上述的治疗口腔鳞癌药物的方法，该方法包括以下步骤a、建立口腔鳞癌细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中RACKl蛋白的水平或其mRNA含c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中RACKl蛋白的水平或其mRNA含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。本发明的建立基于对口腔鳞癌发生发展相关蛋白的研究，先通过建立人正常口腔粘膜、口腔鳞癌的二维电泳图谱，对比研究发现口腔鳞癌与正常口腔粘膜间存在蛋白质表达的差异，对在多个样品间重复出现且有显著差异的蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析。双向电泳分离得到的蛋白点经差异软件分析后得到134个重复表达、差异量大于l.5倍的差异点。ESI-Q-T0F质谱成功鉴定120个蛋白点，合并相同蛋白共得到77个蛋白。其中，有十几种蛋白在口腔鳞癌中第一次检出，而4种蛋白在肿瘤组织中第一次检出，RACK1蛋白为4种在肿瘤组织中第一次检出的蛋白之一。并根据后继的试验结果，确定RACK1蛋白为口腔鳞癌发生发展相关蛋白。本发明还进一步应用免疫组织化学技术研究RACK1蛋白在口腔鳞癌及癌前病损中的表达，并且用RNA干扰技术沉默这些差异蛋白的编码基因，得到效果较好的RACK1蛋白的RNA干扰分子。对蛋白组筛选、验证均提示OSCC高表达，且功能研究提示与肿瘤密切相关的RACK1蛋白的标记物能应用于临床诊断、预后判断及药物开发中。正是在上述大量的开创性研究的基础上，发明了将上述RACKl蛋白或其mRNA作为检测目标的口腔鳞癌诊断试剂及试剂盒；同时也发明了以上述RACK1蛋白或其mRNA作为耙标的筛选治疗口腔鳞癌药物的方法；还发明了能防治口腔鳞癌的药物，比如得到防治效果好的RACK1蛋白的RNA干扰分子。本发明创新之处及有益效果在于本发明口腔鳞癌诊断试剂可以在早期有效诊断口腔鳞癌疾病，大大提高了鳞癌患者生存率。本发明防治口腔鳞癌疾病的药物，可以有效防治口腔鳞癌疾病，为临床口腔鳞癌疾病用药提供了一种新的选择。本发明筛选防治口腔鳞癌疾病的药物的方法，为寻找防治口腔鳞癌疾病的药物提供了一种新的途径，用该方法筛选出的RNA干扰分子的RNA干扰结果则第一次揭示RACK1蛋白的RNA干扰分子在口腔粘膜肿瘤凋亡调节和口腔粘膜肿瘤治疗中的作用，具有广阔的应用前景。图lA是mRNA水平验证RACKl的差异表达图；B是蛋白水平验证RACK1的差异表达图；图2是RACK1在正常组织中的表达图，A为正常口腔黏膜上皮组织200倍显微放大图，B为正常口腔黏膜上皮组织400倍显微放大图；图3是RACK1在0LK组织中的表达图，A为0LK伴轻度异常增生200倍显微放大图，B为0LK伴轻度异常增生400倍显微放大图，C为0LK伴重度异常增生200倍显微放大图，D为OLK伴重度异常增生400倍显微放大图；图4是RACK1在0SCC组织中的表达图，A为0SCC浸润癌一高分化200倍显微放大图，B为0SCC浸润癌一高分化400倍显微放大图，C为0SCC浸润癌一中分化200倍显微放大图，D为0SCC浸润癌一中分化400倍显微放大图，E为0SCC浸润癌一低分化200倍显微放大图，F为OSCC浸润癌一低分化400倍显微放大图；图5A是Tca8113细胞RACKlmRNA转录变化图；B是Tca8113细胞RACK1蛋白质表达变化图；图6是MTT检测细胞生长率变化图；图7是集落形成实验检测细胞增殖图；图8是流式细胞术检测细胞凋亡图。具体实施方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例一与口腔鳞癌变发生发展相关蛋白的初步确定本实验运用差异蛋白组学研究的经典方法，运用双向电泳-串联质谱-生物信息学为核心的蛋白组学技术分析20例手术切除的新鲜口腔鳞癌组织及其癌旁正常组织的蛋白表达谱，高通量地鉴定出与肿瘤相关的表达差异蛋白。经PDQuest分析软件选取差异点并定量分析，得到结果双向电泳分离得到的蛋白点经差异软件分析后得到134个重复表达、差异量大于1.5倍的差异点。ESI-Q-T0F质谱成功鉴定120个蛋白点，合并相同蛋白共得到77个蛋白。其中，有十几个蛋白在口腔鳞癌中第一次检出，4个蛋白在肿瘤组织中第一次检出，RACK1蛋白为4种在肿瘤组织中第一次检出的蛋白之一，其与正常组织中的表达量的差异为3.9±0.6倍。因此，初步确定RACK1蛋白为口腔鳞癌发生发展相关蛋白。实施例二RACK1为口腔鳞癌发生发展相关蛋白的进一步确定1、细胞系口腔舌癌细胞系Tca8113由华西口腔医院保种，人类永生化口腔角化上皮细胞系H0K16E6E7由XuanLin惠贝曾(CharlesR.DrewUni.ofMedicine,USA)2、主要试剂RT-PCR:AccessQuickRT-PCRSystem,购自Promega公司。Western印迹所用RACKl兔多克隆抗体，羊抗兔二抗购自Santacrus。3、提取细胞总RNA进行一步法半定量RT-PCR分别提取等量的Tca8113细胞和H0K16E6E7细胞中的总RNA，然后进行一步法半定量RT-PCR，引物设计见表l，以b-actin基因作为内参。表l一步法RT-PCR(引物及PCR条件)引物sense5"GCTCTGCCATAAACTTCTAGCGTGTCC-3(SEQIDNO.l〕antisense5~CTGTCCTTCTGGAGGCAAGGATGGCCA_3〔SEQIDNO.2)RT-PCR反应55°Cfor30min9化for2min循环27次C27cycles)94。Cf。r30s55。Cf。r30s72。Cforlmin72°Cfor10min结果及分析如图1A所示，半定量RT-PC財广增出条带大小为300bp。b-actin的差异表达量的直方图显示Tca8113细胞RACKl表达量明显高于H0K16E6E7细胞。4、提取细胞总蛋白进行Western印迹测定蛋白含量分别提取等量的Tca8113细胞禾胆0K16E6E7细胞中的总蛋白以SantaCruz的RACK1多克隆抗体进行Western印迹测定含量(Westernblotassay)，以b-actin蛋白作为内参。结果及分析图lB是总蛋白的westernblot验证结果，30KDa处为目的条带，相对b-actin的差异表达量的直方图显示Tca8113细胞RACKl表达量明显高于H0K16E6E7细胞。从上述的提取细胞总RNA进行一步法半定量RT-PCR和提取细胞总蛋白进行Western印迹测定蛋白含量的试验结果可以看出，口腔鳞癌细胞(Tca8113细胞)中的RACKl及其mRNA表达量都比正常细胞(HOK16E6E7细胞)明显偏高，因此，可以确定RACK1为口腔鳞癌发生发展相关蛋白。实施例三RACK1在正常组织、0LK组织、OSCC组织中的差异表达1、组织样品及试剂48例0LK(口腔白斑组织)及76例0SCC石蜡标本来源于华西口腔医院病理科2005-2006年收集的病例，临床病理资料通过病历记录和组织病理报告获得，见表2-l。20例正常组织来自于口腔颌面外科整形术丢弃组织。免疫组化所用RACK1兔多克隆抗体，羊抗兔二抗购自Santacrus，SABC试剂盒购自武汉博士德公司。2、免疫组化染色所有标本均在同一条件下采用SABC法进行免疫组化染色，然后对数据采用SPSS11.5软件进行组间比较单因素方差分析，以P值小于O.05具统计学差异。免疫组化染色结果判断方法免疫染色阳性物质呈棕黄色颗粒，2人双盲法观察切片。染色分值(stainingscore)由两指标衡量一是阳性细胞率(positiverate)，每例随机选择8个高倍镜视野取平均值共计算800个细胞，按阳性细胞数占总细胞数的比例计算阳性表达率，结果记录为1=1%-25%，2=25%-50%，3=50%-100%;另一是染色强度(stainingintensity):1=弱(weak)，2=中度(moderate)，3=强(strong)。染色分值由以下公式计算染色分值(stainingscore)=阳性细胞率(positiverate)X染色强度(stainingintensity)，所得值位于0-9之间。3、免疫组化染色结果及分析免疫组化染色结果如图2、3、4所示RACK1蛋白免疫阳性物质主要存在于细胞浆内，散在存在于细胞核，染色强度不均一。正常组织阳性着色主要集中在基底层和副基底层；0LK组织除着色于基底部外，其余上皮层散在着色，且随增生程度增加，上皮层着色细胞增多；肿瘤细胞弥散性着色。统计学分析结果因胞浆染色强度不均一，以同一视野中细胞比率大于50%的细胞染色强度值为统计数值。运用阳性率与染色强度综合得到的检测指标-染色分值进行统计分析。正常组织、0LK组织、0SCC组织中的平均阳性细胞率分别为0.65士0.58，1.28±0.28，2.5±0.60，而染色强度分别为l.21±0.77，1.63±0.76，2.25±0.82，染色分值为O.72±0.22，2.35±0.44，5.78±2.56，组间比较显示有统计学差异(P=0.00)。OLK组内比较未伴异常增生组与伴异常增生组的染色分值分别为0.98士0.32，3.11±1.04，差异具统计学意义(P=0.01)。OSCC不同分级间比较高、中、低分化0SCC染色分值分别为4.13±2.25，5.9±1.90，7.95±1.72，差异具统计学意义(P=0.00)，见表2-1。上述结果说明了RACK1蛋白在不同增生程度的组织中的表达情况。在正常组织表达仅限于基底层与副基底层，这两层为粘膜上皮增生最活跃的部位，RACK1在此部位的高表达表明其与细胞增殖有关，随之在0LK、0SCC组织上的表达显示RACK1表达量随着细胞增殖程度而递增。表^1样本临床资料及RACK1在不同病理组织间的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>A代表未伴异常增生的OLK组织与伴有异常增生的OLK组织组间比较的P值;B代表不同分化程度(高、中、低)OSCC组织组间比较的P值；C代表正常组、0LK组、OSCC组组间比较的P值4、RACK1阳性表达与OSCC临床病理分期及流行病学指标间的关系由表2—2可以看出，OSCC阳性表达与年龄、性别、肿瘤大小、吸烟饮酒史均无相关性(P〉0.05)，即年龄、性别、肿瘤大小、吸烟饮酒史不影响对结果的判断。淋巴结转移阳性表达与无淋巴结转移阳性表达呈正相关，即淋巴结转移组的阳性表达率显著高于无转移癌组(P=0.003)。表2-2RACK1表达与T丽分期、吸烟、饮f酉史的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例四本发明口腔鳞癌诊断试剂、诊断试剂盒及生物芯片的制备及检测效果在通过实施例一和实施例二确定了RACK1和口腔鳞癌的关系后，可通过本领域的常规技术将以制备得到RACKl蛋白的表达水平及其mRNA含量的试剂，比如耦联有标记物的RACK1蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体，以及能特异扩增RACKl蛋白mRNA的PCR引物，用这些作为主要原料制得到本发明口腔鳞癌诊断试剂、诊断试剂盒及生物芯片。用实施例二的引物对(SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示序列)、RACK1多克隆抗体和RT一PCR所需的缓冲液制得本发明口腔鳞癌诊断试剂，用实施例二的方法检测病人口腔黏膜上皮细胞中RACK1的表达量，如果病人口腔黏膜上皮细胞中的RACK1的表达量比正常水平明显偏高，则可确定病人已患有口腔黏膜癌疾病；通过比较免疫组化染色强度(与表2—1中数据比较)，即可确定患者口腔鳞癌疾病所处阶段，即疾病初、中、晚期。实施例五用本发明筛选防治OSCC的药物的方法筛选药物本实施例筛选治疗口腔鳞癌药物的方法的步骤如下a、建立口腔鳞癌细胞模型(如口腔舌癌细胞系Tca8113)，并设立正常对照组；b、用待筛选药物(普通化学药物，蛋白多肽药物，RNA干扰序列等)按设计的剂量梯度作用于模型组，然后检测各组模型中RACK1蛋白的表达量；c、将模型组与正常对照组的检测结果进行比较，那些能使模型组中RACK1蛋白的表达量明显下降的候选待筛选药物即被筛中。1、材料来源1.1细胞系口腔舌癌细胞系Tca8113由华西口腔医院保种。1.2siRNA和转染试剂设计合成siRNA干涉位点序列(4对siRNA，阴性对照siNC，阳性对照GAPDH)，序列见表3设计的siRNA序列)。脂质体转染使用Lipofectamine2000，购自Invitrogene公司。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2、建立细胞模型用口腔舌癌细胞系Tca8113按常规方法建立细胞模型，并设立三个阴性对照组PBS组(不加转染试剂)，liposome组(仅加脂质体Lipofectamine2000)，siNC组(转染时加入不具有沉默效能的siNC)。阳性对照为GAPDH，用以检验试剂和方法的有效性。带有绿色荧光的siNC-FAM用以测定转染效率。3、筛选有效干扰序列待筛选药物为表3所示的RNA干扰序列，用待筛选药物作用于上述的细胞模型(按常规方法对细胞接种、转染)，收集细胞提取总RNA和总蛋白，进行RT-PCR和Westernblot检测，筛选出能够使RACKl表达量明显下调的siRNA序列。4、筛选结果及分析4.1Tca8113细胞RACKlmRNA转录变化转染后24小时检观M对siRNA序列转染的Tca8113细胞RACKlmRNA的表达，RT-PCR电泳带显示各组内参表达相似，而siRNA-231序列组泳带亮度明显低于对照组(如图5A所示)，其余3对与对照组无明显差别(未显示)。4.2Tca8113细胞RACKl蛋白质表达变化转染后24小时检测4对siRNA序列转染的Tca8113细胞RACKl蛋白的表达。各序列内参照杂交带亮度相似，siRNA-231序列杂交条带明显低于对照组(如图5B所示)，其余3对与对照组无明显差别(未显示)。从4.1、4.2的试验结果可以确定siRNA-231为RACKl干扰效果最好的siRNA序列。实施例六筛选的防治OSCC的药物的药效验证使用实施例五筛选出的siRNA有效序列(siRNA-231)转染0SCC细胞，进行增殖与凋亡相关分析(MTTassay,流氏细胞术，集落形成实验)，以确定筛选的药物是否可以有效防治0SCC。1、MTT检测细胞生长率变化转染0、24、48、72小时后检测细胞活力，以0小时所测细胞活力数为100%，如图6所示，从图中可以看出对照组24、48、72小时的细胞活力无明显变化，而干扰组24、48、72小时的细胞活力分别为83%，30%，41%，干扰组48小时细胞生长率明显下降。2、集落形成实验检测细胞增殖如图7所示，对照组与干扰组集落数分别为304士5;275±14;264±5;141±4，干扰组集落生成数明显下降，组间比较显示有统计学差异(P=0.02)。3、流式细胞术检测细胞凋亡如图8所示，转染48小时后细胞凋亡率干扰组与三个对照组相比凋亡率(包括早期凋亡和晚期凋亡)由2.1%增加到18%，凋亡率明显增高。实施例五、六的结果表明由本发明筛选防治口腔鳞癌疾病的药物的方法能有效筛选出防治口腔鳞癌疾病的药物，如上述的siRNA-231干扰序列。且细胞试验结果证明筛选出的siRACKl-231序列可以抑制OSCC细胞生长和增殖，并能明显使OSCC细胞凋亡，即siRACKl-231干扰序列可以有效防治口腔鳞癌疾病。SEQUENCELISTING〈110>四川大学〈120>口腔鳞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物<130>A080053K〈160>12〈170>Patentlnversion3.4<210>1〈211>27〈212>DNA〈213>artificial<220><223>artificial〈400>1gctctgccataaacttctagcgtgtgc2了<210>2〈211>27〈212>DNA〈213>artificial<220>〈223>artificial〈400>2ctgtgcttctgga.ggcaaggatggcca.27<210>3〈211>21〈212>RNA<213>artificial<220><formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>ggcacacgcuagaaguuuann21〈210>6〈211>21〈212>RNA〈213>artificial〈220>〈223>nisdAMP〈220>〈221>misc—feature〈222>(20).(21)〈223>n是腺嘌呤脱氧核苷酸〈400>6uaaacuucuagcgugugcciin21〈210>7〈211>21〈212>RNA〈213>artificial〈220>〈223>nisdTMP〈220>〈221>misc—feature〈222>(20).(21)〈223>n是胸腺嘧啶脱氧核苷酸〈400>7cagggaugagaccaacua皿n21〈210>8〈211>21〈212>RNA〈213>artificial〈220>〈223>nisdGMP,misdTMP〈220>〈221>misc—feature〈222>(20).(21)〈223>n是鸟嘌呤脱氧核苷酸，m是胸腺嘧啶脱氧核苷酸〈400>8auaguuggucucaucccugnm21〈210>9〈211>21〈212>RNA〈213>artificial〈220>〈223>nisdTMP〈220>〈221>misc—feature〈222>(20).(21)〈223>n是胸腺嘧啶脱氧核苷酸〈400>9agguauggaaccuggcuaann21〈210>10〈211>21〈212>RNA〈213>artificial〈220>〈223>nisdTMP,misdGMP〈220>〈221>misc—feature〈222>(20).(21)〈223>n是胸腺嘧啶脱氧核苷酸，m是鸟嘌呤脱氧核苷酸〈400>10uuagccagguuccauacc皿m21〈210>11〈211>18〈212>RNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>11uucuccgaacgugucacg18〈210>12〈211>18〈212>RNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>12acgugacacguucggaga18权利要求1.一种口腔鳞癌诊断试剂，含有可检测RACK1蛋白的表达水平或其mRNA含量的试剂。全文摘要本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种口腔鳞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物。解决了现有药物和试剂不能早期诊断口腔鳞癌以及不能有效防治口腔粘膜癌的技术难题。本发明口腔鳞癌诊断试剂，含有可检测RACK1(即活化激酶C受体)蛋白的表达水平和其mRNA的含量的试剂。用本发明口腔鳞癌诊断试剂用常规技术即可制得口腔鳞癌诊断试剂盒。用本发明筛选治疗口腔鳞癌药物的方法可以筛选出防治口腔鳞癌的药物，如筛选得到了效果较好的RACK1基因的RNA干扰分子，而其RNA干扰结果则第一次揭示这些RNA干扰分子在口腔粘膜肿瘤凋亡调节和口腔粘膜肿瘤治疗中的作用，具有广阔的应用前景。文档编号C12Q1/68GK101246169SQ200810300608公开日2008年8月20日申请日期2008年3月17日优先权日2007年5月23日发明者昕曾,智王,陈谦明,黄灿华申请人:四川大学