专利名称：：靶向fak和egfr的rna干扰质粒-脂质体抗肿瘤复合物的制作方法
技术领域：
：本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及靶向FAK和EGFR的RNA干扰载体一脂质体抗肿瘤复合物。
背景技术：
：目前肿瘤的基因治疗获得了蓬勃快速的发展，但是至今为止，仍然存在许多需要解决的问题。而其中急需解决的问题是目前用于肿瘤基因治疗的基因太少，能抑制肿瘤生长的基因为数不多，急需提供更多可供利用的基因；另外，由于肿瘤的发生、发展、转移等过程是一个多基因参与、涉及多条信号通路的复杂网络系统，因此单个基因治疗或单一治疗方法往往疗效有限。因此，未来基因治疗发展的重点将在于挖掘并鉴定在临床上有治疗价值的基因，探索多个具有不同抗肿瘤作用机理的基因联合治疗以及将肿瘤基因治疗与化疗、放疗合用Focal-adhesionkinase(FAK)基因是一个整合素家族成员基因，是一种定位于黏着斑的非受体型酪氨酸激酶，参与调控细胞的运动与增殖等，它可促进细胞向细胞外基质附着，在肿瘤发生、发展、转移、预后过程中扮演重要功能。FAK基因可以促进肿瘤细胞迀移，从而导致肿瘤扩散、转移，同时也影响肿瘤治疗的预后效果。大量研究发现FAK基因在多种肿瘤组织中较正常组织表达明显增高，在发生肿瘤转移和预后差的病人组织中检测到FAK基因表达水平显著上调，如FAK基因在100。/。的结肠癌和88。/。的乳腺癌患者组织中表达上调，另外在肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、口腔上皮癌、头颈部鳞状上皮癌、黑色素瘤、急性髓细胞样白血病、甲状腺癌等恶性肿瘤中表达增加，而且FAK基因表达水平上调直接与肿瘤的发生、发展、转移、预后相关，因此，FAK基因是肿瘤治疗潜在的理想靶标。表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorrec印tor，EGFR)EGFR是一种跨膜蛋白质，属于ErbB家族的一员，由细胞外的结合区、跨膜区及主要由酪氨酸激酶组成的胞内区组成。当EGF以及其他生长因子与EGFR的胞外区相结合时，受体的酪氨酸激酶就会被活化，继而启动细胞内一连串的信号传导通路。大量研究发现EGFR基因在多种肿瘤中过表达或异常活化，从而使肿瘤细胞增殖、侵袭和转移能力增强，在非小细胞肺癌中，EGFR基因异常高表达，而且活性增高，EGFR已成为目前肺癌治疗的重要靶分子。目前，RNA干扰已经广泛用于肿瘤治疗研究，但大多数是利用化学合成的siRNA对肿瘤进行治疗，而化学合成的siRNA治疗存在以下缺点化学合成的siRNA用量大，使用成本高，产业化难度大；化学合成的siRNA在体内作用的稳定性差，时间短，每次使用时对操作人员的技术要求较高；多次输注对患者的生活质量也有不好的影响。同时从文献报导来看，单个基因的RNA干扰效果往往不是十分理想，因为肿瘤的发生、发展、转移、侵袭等是一个涉及多基因、多步骤复杂的过程，可能涉及的是多个基因、多条信号通路，所以针对多个耙点基因进行RNA干扰治疗可能是一个更好的选择，效果也有可能更好，同时将双基因甚至多基因的RNA干扰治疗与化疗、放疗合用在临床肿瘤治疗方面可能更有前景，但目前未见相关报道。
发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能靶向FAK和EGFR双基因的RNA干扰表达载体。该RNA干扰表达载体能在体内表达FAK基因的RNA干扰序列5-'AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3'(SEQIDNO.1)禾nEGFR基因的RNA干扰序列5'-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3'(SEQIDNO.2)。其中，上述的表达载体为质粒。其中，上述质粒的骨架为pGensil-2，含有人的U6和H1启动子，分别用于启动FAK基因RNA干扰表达框架和EGFR基因RNA干扰表达框架。其中，表达FAK基因的RNA干扰序列的表达框架序列为SEQIDNO.7所示。其中，表达EGFR基因的RNA干扰序列的表达框架序列为SEQIDNO.8所示。进一步的，上述RNA干扰表达载体具有SEQIDN0.9所示的序列。本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述的RNA干扰表达载体的脂质体复合物。其中，上述的脂质体为阳离子脂质体。其中，上述阳离子脂质体是由摩尔比为1:1的D0TAP和胆固醇(Choi)组成。本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述RNA干扰表达载体或上述的脂质体复合物在制备抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物中的用途。本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物，是由上述的RNA干扰表达载体或上述的脂质体复合物作为主要活性成分添加药学上可以接受的辅料制备而成的。其中，上述抗肿瘤药物组合物还含有肿瘤化疗药物作为活性成分。进一步的，上述肿瘤化疗药物为顺铂。本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种制备上述RNA干扰表达载体的方法，该方法包括以下步骤a、分别设计并合成能表达FAK基因的RNA干扰序列5」AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3'(SEQIDNO.1)和EGFR基因的RNA干扰序列5'-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3'(SEQIDNO.2)的表达框架序列；b、将a步骤所得表达框架序列转入目标表达载体，使表达框架序列能由启动子操作表达，扩增筛选即得。本发明所要解决的第六个技术问题是提供一种制备上述脂质体复合物的方法，该方法包括以下步骤a、将DOTAP与胆固醇Chol按l:l的摩尔比进行混合，制成DOTAP/Chol阳离子脂质体混悬液；b、将RNA干扰表达载体包裹到DOTAP/Cho1阳离子脂质体中形成表达载体-阳离子脂质体复合物，将该复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖浓度最终为5%并混合均匀，即得。需要说明的是，以上生产和操作本发明公开的基因、重组载体和脂质体复合物的具体常规技术方法和设备是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的技术方案根据相应的操作手册完成。本发明具有的有益效果在于本发明靶向FAK和EGFR的双基因RNA干扰载体可以大大降低生产成本，具有更持久的体内作用时间；本发明靶向FAK和EGFR的双基因RNA干扰载体的脂质体复合物，可以更稳定地将shRNA表达载体导入到体内，对shRNA载体起到了保护和缓释作用，使其在体内的作用时间更持久，效果更好。并且本发明靶向FAK和EGFR的双基因RNA干扰载体的阳离子脂质体复合物具有被动耙向肿瘤血管内皮细胞的作用，而肿瘤血管内皮细胞是肿瘤细胞营养物质的主要来源，这样能使抗肿瘤作用更为显著，同时试验也表明其具有明显的肺内耙向作用，对肺部肿瘤的治疗更具优势。另外，现有的肿瘤生物治疗产品均需要采用肿瘤内、腹腔内等给药方式，而本发明靶向FAK和EGFR的双基因RNA干扰载体及其脂质体复合物均能采用的静脉注射方式，并有显著的疗效，更适合进行临床使用，尤其难能可贵的是对非实体肿瘤或转移肿瘤是会有较好的疗效，为本领域当前的这一难题的解决提供了一种新的解决途径。同时，本发明FAK+EGFR双基因RNA干扰载体的阳离子脂质体复合物和化疗药物——顺铂、放射治疗共同作为抗肿瘤综合治疗比各自单独使用明显具有更优的效果，能降低两者的使用量。本发明产品功效明显，毒副作用小，制备方法简单，能克服化疗药物、放射治疗毒副作用大、疗效难持久等缺陷，能大大减少给药量、减轻患者经济负担并提高患者的生活质量，具有很好的市场前景。以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。图l为pGenesi1-2的结构图；图2为PG6-1载体的结构图；图3为PG6-4-hHl载体的结构图；图4为PG6-l-F质粒用EcoR頂每切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中1表示DL2000Marker从右至左依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;2表示PG6-1-F的EcoR頂每切结果；图5为PG6-4-hHl-E质粒用Sal頂每切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中1表示DL2000Marker从左至右依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;2表示质粒pG6-4-hHl-E;3表示PG6-4-hHl-E的Sal頂每切结果；图6为PGen-FAK+EGFR质粒用BamH頂每切鉴定鉴定的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中l表示DL2000Marker从左至右依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;2表示PGen-FAK+EGFR质粒用BamH頂每切的结果；图7为肿瘤生长曲线图；图8为各组肿瘤重量称量结果图。具体实施方式实施例一耙向FAK和EGFR双基因的shRNA表达质粒的构建初步筛选得到具有明显抑制FAK基因表达功能的siRNA序列5'-AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3'(SEQIDNO.1)(humanFAK:GenBankaccessionno:NM—153831)和明显抑制EGFR基因表达功能的siRNA序列5'-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3'(SEQIDNO.2)(humanEGFR:GenBankaccessionno:x00588)。表达双基因RNA干扰序列的shRNA质粒表达载体构建过程如下1、按如下结构设计并合成RNA干扰表达框架表达框架结构|BamHl|+Sense+L。。i3+Antisense~^^bfi"^+Ec。Rl/SalI^HindIIl|(其中的LOOP指连接序列)。(1)、FAK基因的RNA干扰耙序列(SEQIDNO.1)5'-AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3'合成以下FAK基因的RNA干扰表达框架Sensestrand(SEQIDNO.3):5'如TCCbcCACCTGGGCCAGTATTmTCAAGACGATAATACTGGCCCAGGTGGTTTTTTGAATTC0-3'(设计有^^。yf/酶切位点)Anti-sensestrand(SEQIDNO.4):5'-AGCTTGAATTCAAAAAACCACCTGGGCCAGTATTATCGTCTT((2)、EGFR基因的RNA干扰耙序列(SEQIDNO.2):5'-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3'合成以下EGFR基因的RNA干扰表达框架Sensestrand(SEQIDNO.5):5'-3ATCCACAGTGGAGCGAATTCCTTTCAAGACGAGGMTTCGCTCCACTCTGTTTTTTg7g&3C0_3'(设计有W/酶切位点)Anti-sensestrand(SEQIDNO.6):2、用上述合成的序列构建PGen-FAK+EGFR载体1)单链目的基因片段的退火连接分别取上述合成的FAK和EGFR基因的单链RNA干扰表达框架目的片段进行退火连接分别得到双链的FAK和EGFR的RNA干扰表达框架。2)将与质粒pGenesil-2(其结构见图l)基本骨架相同的PG6-1(其结构见图2)和PG6-4-hHl(其结构见图3)分别进行BamHI+HindIII双酶切，并凝胶回收大片段(PG6-1和PG6-4-hHl质粒除多克隆位点不同外，其余序列完全相同)。3)将双链的FAK干扰引物序列片段与线性化的PG6-1连接，得到PG6-1-F质粒；双链的EGFR干扰引物序列片段与线性化的PG6-4-hHl连接，得到PG6-1-hHl-E质粒。4)将PG6-l-F质粒和PG6-l-hHl-E质粒分别用EcoRI和SalI进行酶切鉴定，酶切图分别见图4和图5，结果表明连接成功。5)将PG6-1-F质粒和PG6-1-hHl-E质粒都用SalI+Pstl进行双酶切，分别回收大片段和小片段。6)将质粒PG6-1-F经SalI+Pstl双酶切所回收的大片段与PG6-4-hHl-E经SalI+Pstl双酶切所回收的小片段进行连接，得到PG6-hU6-F+hHl-E质粒(简称为PGen-FAK+EGFR)7)利用BamH頂每切鉴定PGen-FAK+EGFR质粒，见图6，并测序，与预期序列一致，表明构建成功。所构建的PGen-FAK+EGFR载体全长4115bp，全序列如SEQIDNO.9所示。其中所插入的siRNA表达框架为第一个表达框架为FAK基因的siRNA表达框架(SEQIDNO.7):第二个表达框架为EGFR基因的siRNA表达框架(SEQIDNO.8):(标记为灰色的分别为FAK基因和EGFR基因RNA干扰耙序列，)实施例二、质粒DNA/D0TAP-Chol阳离子脂质体复合物的制备1、DOTAP-Chol阳离子脂质体的制备将阳离子脂质体DOTAP与中性脂质体胆固醇(Choi)按l:l的摩尔比进行混合，并将混合物用HPLC级的氯仿进行溶解，并置于旋转蒸发仪上3(TC下旋蒸45min后成膜，成膜后真空干燥过夜。所成的膜取出后溶解于5%的葡萄糖溶液中，然后在5(TC水浴条件下震荡45min和35i:水浴条件下震荡10min，混合物在3(TC下经400w超声破碎5min，将混合物转到一个试管中，并在5(TC下加热10min，最后依次经450nm、220nm、100nm聚碳酸酯膜挤压，最后将混合物溶解在适量的5%的葡萄糖溶液中，得到5mg/ml的DOTAP-Chol阳离子脂质体混悬液。2、制备pGen-(FAK+EGFR)质粒DNA利用50L的细菌高密度发酵罐和质粒DNA大规模纯化的仪器-AKTAPliot(美国通用电器公司)，用碱裂解法制备并纯化符合国家GMP标准的质粒DNA，经过检测所纯化的质粒能够符合体内外实验的要求。3、质粒DNA/阳离子脂质体复合物的制备将质粒pGen-(FAK+EGFR)按一定比例稀释，再按脂质体DNA=3:1(W/W)的比例将脂质体溶液加入到pGen-(FAK+EGFR)溶液中，之后立刻涡流振荡2min，再在4摄氏度下孵化lh，即得本发明阳离子脂质体一质粒DNA复合物。试验例一本发明pGen-(FAK+EGFR)质粒的体外实验抗肿瘤实验1、pGen-(FAK+EGFR)质粒诱导人肺癌细胞的凋亡。本试验使用的人肺癌细胞株A549和SPC-A1，以下是A549细胞株的详细实验结果，SPC-A1也得到趋势相同的结果。实验按如下分组进行(6孔板)A)空白对照B)无关序列+Liposome(2ygpGen-NC+5ygLiposome)C)pGen-FAK+Liposome(2ygpGen-FAK+5ygLiposome)D)pGen-EGFR+Liposome(2ygpGen-EGFR+5ygLiposome)E)pGen-(FAK+EGFR)+liposome(2ygpGen-(FAK+EGFR)+5ygLiposome)实验过程如下，在转染前24小时将A549细胞接种在6孔板(2X1()5细胞/L)，转染时细胞密度为40-50%，在转染前l-2小时将6孔板中的培养基更换为无血清、无抗生素的RPMI1640培养基，按以上分组和各组所加的剂量进行实验，具体的操作过程见质粒DNA的操作流程，转染后6小时将孔中的培养基换成RPMI1640+10%胎牛血清的完全培养基进行培养实验结果如下转染48小时后，将6孔板置于倒置显微镜下观察，发现空白对照组和无关序列对照组A549细胞生长良好，pGen-FAK质粒或pGen-EGFR转染组细胞有10-15%细胞死亡，而pGen-(FAK+EGFR)质粒转染组50-70%的细胞死亡，表现出很强的抑制肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡作用。转染48小时后，将各孔培养基轻轻吸掉，每孔加入500yl的Hoechst33342染色液，然后置于倒置荧光显微镜下观察，实验发现pGen-(FAK+EGFR)质粒转染能够明显诱导A549细胞产生凋亡，Hoechst33342染色可见核固縮的凋亡小体，而pGen-FAK和pGen-EGFR质粒转染有部分细胞产生凋亡，故pGen-(FAK+EGFR)质粒具有最强的诱导肿瘤细胞凋亡作用。试验例二pGen-(FAK+EGFR)质粒-阳离子脂质体复合物抗人肺癌动物实验研究为了研究pGen-(FAK+EGFR)质粒-阳离子脂质体复合物在体内的抗肿瘤效应，在BALB/c裸鼠(6-8周龄，雌性)皮下建立了人肺癌移植瘤模型，简言之，将体外培养的人肺癌细胞A549用胰酶消化，并定容在无血清、无抗生素的1640培养基中，调整的细胞浓度为5X107cellS/ml，在每只裸鼠的右侧背腹部皮下接种5X106cells(0.1ml)，细胞接种7天后可以扪及到肿瘤，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)A)空白对照组5%的葡萄糖溶液；B)无关序列组阳离子脂质体/pGen-NC复合物置于5%的葡萄糖溶液中；C)pGen-FAK治疗组阳离子脂质体/pGen-FAK复合物置于5。/。的葡萄糖溶液中；D)pGen-EGFR治疗组阳离子脂质体/pGen-EGFR复合物置于5。/。的葡萄糖溶液中；E)pGen-(FAK+EGFR)治疗组阳离子脂质体/pGen-(FAK+EGFR)复合物置于5%的葡萄糖溶液中。采取尾静脉注射方式进行治疗，质粒DNA-阳离子脂质体复合物配比如下质粒DNA(5yg):阳离子脂质体(15ug)=3:1(质量比)，并将质粒DNA-阳离子脂质体复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖终浓度为5%。每次注射体积为200yl，每隔一天进行治疗，共治疗12次，每3天测量1次肿瘤体积(结果见图7)，肿瘤体积按以下方法计算体积(mm3)=0.52X长(length)X宽2(width2)。肿瘤生长抑制用方差分析，P〈0.05则认为有统计学意义。处死动物取肿瘤组织时将各组肿瘤进行称重，结果如下。实验各组都没有观察到明显的毒副作用，观察39天将小鼠全部处死。从以上的各组动物的肿瘤体积曲线(见图7)、肿瘤重量(见图8)情况分析发现双基因RNA干扰治疗组肿瘤生长缓慢，而两个单基因RNA干扰治疗组和对照组肿瘤生长较快，故阳离子脂质体/pGen-(FAK+EGFR)复合物表现出极强的抗肿瘤作用，与对照组相比抑瘤率达到86.2%，而阳离子脂质体/pGen-FAK和阳离子脂质体/pGen-EGFR组也表现出了一定的抗肿瘤作用，抑瘤率分别达到36.3%和29.9%，由此结果可以看出，pGen-(FAK+EGFR)/阳离子脂质体复合物比任何单一基因RNA干扰治疗都具有更强的抗人肺癌作用。以上结果表明，在人肺癌模型中pGen-(FAK+EGFR)/阳离子脂质体复合物能有效抑制肿瘤的生长，而且，我们使用的是一个很低的治疗剂量。这提示我们，在以后的临床应用中，可以大大降低pGen-(FAK+EGFR)/阳离子脂质体复合物的使用剂量，提高治疗效果，同时降低毒副作用。试验例三本发明产品pGen-(FAK+EGFR)与顺铂(cisplatin)联用抗肿瘤试验为了研究pGen-(FAK+EGFR)质粒/阳离子脂质体复合物加化疗的抗肺癌效应，我们如前所述在BALB/c裸鼠(6-8周龄，雌性)皮下建立了人肺癌移植瘤模型，于细胞接种l周后可以扪及到肿瘤，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)A)空白对照组5%的葡萄糖溶液；B)无关序列对照组阳离子脂质体/pGen-NC复合物置于5。/。的葡萄糖溶液中；C)pGen-(FAK+EGFR)干扰治疗组阳离子脂质体/pGen-(FAK+EGFR)复合物置于5%的葡萄糖溶液中；D)化疗组:0.lmg顺铂(DDP);E)无关序列加化疗组阳离子脂质体/pGen-NC复合物置于5。/。的葡萄糖溶液中，化疗药物顺铂DDP的使用如下所述；F)pGen-(FAK+EGFR)RNA干扰加化疗组阳离子脂质体/pGen-(FAK+EGFR)复合物置于5%的葡萄糖溶液中，化疗药物顺铂DDP的使用如下所述。阳离子脂质体-质粒DNA复合物采取尾静脉注射方式进行体内给药，质粒DNA(5yg):阳离子脂质体(15ug)=3:1(质量比)，每次注射200yl体积，每隔一天进行治疗，共治疗12次，每3天测量1次肿瘤体积。DDP采取腹腔给药方式进行治疗，在第一次RNA干扰治疗后2天开始进行化疗，每周两次，连续2周，注射剂量为5mg/kg体重，每只小鼠每次注射O.1mg的DDP。最后处死动物取肿瘤组织，并对各组肿瘤进行称重。分析结果发现pGen-(FAK+EGFR)/阳离子脂质体-复合物加化疗药物——顺铂比这两种药物单用具有更强的抗肿瘤效果，总抑瘤率达到90.2%，而单纯的pGen-(FAK+EGFR)治疗组(抑瘤率达到81.7%)和顺铂治疗组(抑瘤率达到46.47%)，由此可见，双基因的RNA干扰治疗可以增强肿瘤对化疗药物的敏感性。试验例四本发明产品pGen-(FAK+EGFR)与放疗联用抗肿瘤试验为了研究pGen-(FAK+EGFR)质粒/阳离子脂质体复合物加放射治疗的抗肺癌效应，我们如前所述在BALB/c裸鼠(6-8周龄，雌性)皮下建立了人肺癌移植瘤模型，于细胞接种l周后可以扪及到肿瘤，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)A)空白对照组5%的葡萄糖溶液；B)无关序列对照组阳离子脂质体/pGen-NC复合物置于5。/。的葡萄糖溶液中；C)pGen-(FAK+EGFR)干扰治疗组阳离子脂质体/pGen-(FAK+EGFR)复合物置于5%的葡萄糖溶液中；D)放疗组:每次5Gy/次;E)无关序列加放疗组阳离子脂质体/pGen-NC复合物置于5。/。的葡萄糖溶液中，放疗剂量的使用如下所述；F)pGen-(FAK+EGFR)RNA干扰加放疗组阳离子脂质体/pGen-(FAK+EGFR)复合物置于5%的葡萄糖溶液中，放疗剂量的使用如下所述。阳离子脂质体-质粒DNA复合物采取尾静脉注射方式进行体内给药，质粒DNA(5yg):阳离子脂质体(15ug)=3:1(质量比)，每次注射200yl体积，每隔一天进行治疗，共治疗12次，每3天测量1次肿瘤体积。在第一次RNA干扰治疗2天后开始进行放疗，每周两次，每次5Gy，连续2周，总放射剂量为20Gy。最后处死动物取肿瘤组织，并对各组肿瘤进行称重。分析结果发现pGen-(FAK+EGFR)/阳离子脂质体-复合物加放疗疗比这两种治疗方式单用具有更强的抗肿瘤效果，总抑瘤率达到92.1%，而单纯的pGen-(FAK+EGFR)治疗组(抑瘤率达到82.4%)和放射治疗组(抑瘤率达到56.4%)，由此可见，双基因的RNA干扰治疗可以增强肿瘤对放疗的敏感性。以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进。比如由本领域常识可知，本发明中的表达框架结构中Loop(连接序列)的长度和组成可以有一定的变化。而若有不同的要求，本发明的抗肿瘤药物组合物和抗肿瘤辅助药物组合物的用量和使用方式可以在一个较大范围内变动。本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型，所选用药途径等很容易地加以确定。只要不脱离本发明的基本思想，这些变动均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。SEQUENCELISTING<110>四川大学<120>耙向FAK和EGFR的RNA干扰质粒-脂质体抗肿瘤复合物〈130>A080076K<160>9<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>21〈212>DNA〈213>artificial<220><223>artificial<400>1aaccacctgggccagtattat21〈210>2〈211>19<212>DNA<213>artificial<220><223>artificial〈400>2cacagtggagcgaattcct19<210>3<211>66<212>DNA<213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>3gatccgccacctgggccagtattatttcaagacgataatactggcccaggtggttttttg60aattca66〈210>4〈211>66〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>4agcttgaattcaaaaaaccacctgggccagtattatcgtcttgaaataatactggcccag60gtggcg66〈210>5〈211>66〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>5gatccgcacagtggagcgaattcctttcaagacgaggaattcgctccactgtgttttttg60tcgaca66〈210>6〈211>66〈212>DNA〈213>artificial〈220>artificial〈400>6agcttgtcgacaaaaaacacagtggagcgaattcctcgtcttgaaaggaattcgctccac60tgtgcg66〈210>7〈211>93〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>7agcttgtcgacaaaaaaccacctgggccagtattatcgtcttgaaataatactggcccag60gtggcg66〈210>8〈211>61〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>8aaaaaacacagtggagcgaattcctcgtcttgaaaggaattcgctccactgtgcg55〈210>9〈211>4115〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>9<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccatt1860ctccgccccatggctgactatttatgcagaggccgaggccgcctcggcct1920ctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgca肌gatc1980gatc肌gag3caggatgaggatcgtttcgcaagatggattgcacgcaggt2040tctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggc2100tgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaag2160accgacctgtccggtgccctgaatgaactgca卿cgaggcagcgcggctatcgtggctg2220gccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgg,gggac2280tggctgctattgggcg肌gtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgcc2340gag肌3gtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacc2400tgcccattcg3CC3CC肌gCg肌3C3tCgCatcgagcgagcacgtactcggatgg肌gcc2460ggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactg2520ttcgccaggctc肌ggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgat2580gcctgcttgccg肌tatcatggtgg肌肌tggccgcttttctggattcatcgactgtggc2640cggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaa2700gagcttggcggcg肌tgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgat2760tcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggt2820tcga肌tgaccgaccaagcg3CgCCC肌CCtgccatcacgagatttcgattccaccgccg2880ccttctatga肌ggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctcc2940agcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccctag3000gg肌gg卿c肌taccgg肌gg肌cccgcgctatgacggc3060cgcacggtgttgggtcgtttgcggggttcggtcccagggctggcactctg3120tcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccac3180CCC3CCCCCC肌gttcgggtg肌ggcccagggctcgcagcc肌cgtcggggcggcaggcc3240ctgccatagcctcaggttactcatatatactttagattgacatttttaat3300ctaggtg肌gatcctttttggacc肌肌tcccttaacgtg3360agttttcgttccactgagcgtcagaccccgca肌ggatcttcttgagatc3420ctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaccaccgctaccagcggtgg3480tttgtttgccggatca卿gctaccaactctttttccgaaggt肌ctggcttcagcagag3540cgcagatacccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttc肌g肌ct3600ctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtg3660gcgataagtcgtgtcttaccgggttggactgttaccggat肌ggcgcagc3720ggtcgggctgtcgtgcacacagcccagcttggagcg肌cgacctacaccg3780cctacagcgtgagctatgag肌3gCgCC3Cgcttcccgaaggg卿肌gg3840cggacaggtatccggtaagcggcagggtcggcgcacgagggagcttccag3900gggga肌cgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtc3960gatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaa肌3CgCC3gCaacgcggcct4020ttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatccc4080ctgattctgtggataaccgtattaccgccatgcat411权利要求1.一种RNA干扰表达载体，其特征在于它能在体内表达SEQIDNO.1所示的FAK基因RNA干扰序列和SEQIDNO.2所示的EGFR基因RNA干扰序列。13.一种制备权利要求15任一项所述的RNA干扰表达载体的方法，其特征在于包括以下步骤a、分别设计并合成能表达SEQIDNO.1所示的FAK基因的RNA干扰序列的表达框架序列和SEQIDNO.2所示的EGFR基因的RNA干扰序列的表达框架序列；b、将a步骤所得表达框架序列转入目标表达载体，使表达框架序列能由启动子操作表达，扩增筛选即得。14.一种制备权利要求8所述脂质体复合物的方法，其特征在于包括以下步骤a、将DOTAP与胆固醇Chol按l:l的摩尔比进行混合，制成DOTAP/Chol阳离子脂质体混悬液；b、将RNA干扰表达载体包裹到DOTAP/Cho1阳离子脂质体中形成表达载体-阳离子脂质体复合物，将该复合物稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖浓度最终为5%并混合均匀，即得。全文摘要本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及靶向FAK和EGFR的RNA干扰质粒-脂质体抗肿瘤复合物。本发明所制备的FAK和EGFR双基因RNA干扰载体能有效地抑制人肺癌细胞的生长并诱导其凋亡；体内的抑瘤实验也表明FAK和EGFR双基因RNA干扰载体-脂质体复合物能够显著抑制多种肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期。本发明以阳离子脂质体包裹FAK和EGFR双基因RNA干扰载体和化疗及放疗共同作为活性成分的抗肿瘤药物比各自单独使用明显具有更优的抗肿瘤效果，并能降低两者的使用量。本发明产品功效明显，能大大减少给药量、提高患者的生活质量，因此具有很好的市场开发前景。文档编号C12N15/63GK101280317SQ20081030078公开日2008年10月8日申请日期2008年3月28日优先权日2008年3月28日发明者邓洪新,陈俐娟,魏于全申请人:四川大学