专利名称：重组双歧杆菌-hRV/VP7表达载体及其口服疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体及其口服疫苗 背景技术人A组轮状病毒(human rotavirus, hRV)是引起新生儿严重腹泻的主要病原体，约60%的 严重腹泻由RV引起的，全球每年有大约50万的婴幼儿因感染RV而死亡，因此，WHO将RV疫苗 的研究放在优先发展的位置[1]。目前，全球RV疫苗研究的方向主要是人工重配减毒口服活疫苗，其中最有影响力的是 Wyeth-Ayerst公司生产的口服疫苗，但由于安全问题很快退出市场(商品名为Rotashield ，1999年6月因接种者出现肠套叠而主动撤回[1])。近两年RIX4414「12—③和RotaTeq「W相继 进行了临床3期试验的报道。在中国，目前只有兰州生物制品所的羊轮状病毒株PG1()W于 1998年获准生产应用[1]，这是我国目前唯一获国家批准的RV疫苗，但据临床反映，免疫效果 并不理想。因此，hRV疫苗的研制工作仍然任重道远。动物模型研究表明，用VP7的DNA疫苗或病毒样颗粒肌肉免疫小鼠，血液中虽然产生病毒 特异性中和抗体，却对小鼠没有保护作用，只有通过粘膜免疫系统接种的RV疫苗才有免疫保 护作用[1—6]。因此，最有效的RV疫苗必然是有能力刺激肠道产生消化道局部免疫的疫苗。由 此决定了RV疫苗的最佳剂型是引起粘膜免疫的口服疫苗。基因工程载体疫苗是利用载体系统表达病毒保护性抗原构建新型疫苗的一种模式，其优 点是避免了病毒身的毒副作用，缺点是难以找到理想的载体菌(表达系统)，即使有表达， 免疫原性也较弱。服V的主要保护性抗原是病毒蛋白(Virus Protein) VP4和病毒蛋白VP7。 VP7是分子量为34 kD的外壳糖蛋白，编码基因随病毒的不同型别而定，目前已经发现14个 VP7血清型(G1 G14)，其中常见的感染婴儿的RV为G1-G4型。研究证实，原核系统表达的 全长VP7多肽无免疫原性，用它做候选抗原的缺点是不同G血清型的病毒产生的抗体间没有交 叉保护，因此在临床上的保护范围较窄。但在天然的病毒中VP7蛋白的含量很高，经过去除 3端的部分序列，原核系统表达的VP7仍然可以具有免疫原性[15， 19]，因此，VP7仍然可以 做为基因工程亚单位活疫苗研究的侯选抗原之一。在PubMed中检索到单独把VP7作为亚单位 侯选疫苗抗原的在人腺病毒中表达报道[16]，鼻腔接种免疫小鼠后能够激发保护性免疫反应。Choi NW等则利用转基因烟草表达出了有免疫原性的VP7融合蛋白[17]。在国内，李晋涛等 用转基因马铃薯表达了hRV VP7蛋白[18]。但所用载体系统效率不够高，且均未能进入实用 阶段。据统计，在我国人群中流行的主要RV有Gl (P1A[8])占72.7%、 G2 (P1B[4]) 12. 1%、 G3(P1A[8])14. 2。/。和G4 (P1A[8]) 2.5%，可见，hRV流行株以Gl基因型为主[11]。肠道粘膜免疫系统是执行消化道免疫的第一道防线。由于RV的感染和复制仅局限在小肠 上皮细胞中，因此，肠道粘膜免疫在防止RV感染中有举足轻重的作用。双歧杆菌( Bifidobacterium sp.下文简写为B)属于革兰氏阳性菌[8]，是人类肠道的正常菌群，能通过 细胞表面的磷壁酸吸附在小肠上皮细胞表面的受体上，本身不会被肠道清除，能在肠道内稳 定定植，也对机体无害，具有很高的安全性，双歧杆菌还可能发挥粘膜免疫增效剂和辅助治 疗作用。Qiao等的工作证明m，用猴RV (RRV)感染小鼠5天后，实验组(B+RRV)在病毒感染 后每天饲喂一定量的双歧杆菌，对照组(RRV)饲喂等量的盐水，阴性对照不感染病毒，也 不给双歧杆菌，只饲喂等量的盐水，结果发现，实验组血清和粪便中的RRV特异性IgG和IgA 高于对照组。实验组的病愈期也比对照组有所提前。目前只有将双歧杆菌用于人实体瘤基因治疗的基因转移系统的研究报道[9]，但将双歧杆 菌用于制备重组RV病毒蛋白活疫苗在国内外均未见报道。发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体。 本发明重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体装载有人A组轮状病毒的病毒蛋白VP7的编码基因 序列。其中，上述的双歧杆菌表达载体为大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体。 其中，上述的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体具有SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列。 其中，上述人A组轮状病毒VP7亚单位具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。 进一步的，上述重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种含有上述的重组双歧杆菌hRV-VP7表达载 体的宿主细胞。进一步的，上述的宿主细胞为双歧杆菌。本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述的重组双歧杆菌-hRV/VP7表达载体或上述 的宿主细胞在制备预防或治疗人A组轮状病毒引起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫 佐剂中的用途。本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种预防或治疗人A组轮状病毒弓1起的疾病的口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂。该口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂是由上述的宿 主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的。进一步的，上述口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂的剂型为口服液、口服溶液、片剂 或胶囊剂。象流感病毒一样，自然界轮状病毒不同株之间的基因组节段重配和基因内部突变引起 RV的保护性抗原发生很高的变异，导致疫苗研究大大滞后于临床上流行病毒的变异，给疫苗 研究带来很大的困难[1<)]，因此，模拟病毒自然重配(reassortant)的规律发展RV疫苗是 最合理和有效的策略。但RV重配株的构建与筛选工作难度很大，花费大，耗时长，而最终产 品带有大量非免疫必需的活病毒成分，接种增殖后难免有一定的副作用如发热、腹泻、肠套 叠等，Rotashield的失败就是最好的例子。但是，人工模拟病毒自然重配方式的疫苗发展思 路和较理想的免疫保护效果，无疑为RV疫苗的研究指明了方向。但具体的模拟和重组方案要 有全新的思维。用自然病毒重配研制减毒活疫苗的老路，难以克服减毒活疫苗毒力回复的安 全性问题，以及减毒RV对HIV感染者等免疫缺陷患者的致命危险。同时也无法回避婴幼儿接 种后疫苗增殖导致的肠套叠、发热、腹泻、呕吐等副作用，而且也很难及时获得符合临床预 防要求的新变异株疫苗。本发明将保护性抗原成分单独"剥离"出来进行表达重组，探索出一条新的RV重组疫苗 研究之路。本发明技术方案模拟病毒自然变异，研制"保护性抗原重组"疫苗，该方案使疫 苗研制工作能够及时根据临床流行株的抗原变异而改变疫苗抗原的重组方式，达到以变应变 的主动效果。因此，用G1型的VP7做为重组疫苗的抗原，就可以预防72。/。以上的RV感染，如果 以G1 、 G2和G3三型的VP7制作重组活疫苗，其保护范围达流行株97. 5%以上，其临床应用 前景非常广阔。本发明中涉及使用的现有的核苷酸序列均能在已发表的本领域学术刊物及GenBank中检 索而得，本领域普通技术人员均能在参考本领域教科书或试验手册的基础上完成本发明涉及 的分子生物学和细胞生物学试验。本发明的有益效果为l.安全多效。双歧杆菌无副作用，能在肠道内稳定定植，也对机体无害，具有很高的安 全性，用它做重组活疫苗的表达系统，不存在载体菌产生外毒素、无致热原和毒力返祖等潜 在的致病危险，有利于直接把抗原表达在粘膜淋巴细胞表面而被识别和提呈，借助载体菌的 微生态学效应还有助于RV的治疗和肠道微生态的恢复；该疫苗安全性高，表达抗原肽亚单位 没有感染性，还能发挥粘膜免疫增效剂和辅助治疗作用。2. 快捷重组。该方案使疫苗研制工作能够及时根据临床流行株的抗原变异而改变疫苗抗 原的重组方式，达到以变应变的主动效果，以现有的基因克隆和测序技术， 一个星期就可完 成载体的构建工作，是hRV重组载体口服活疫苗研制的理想方案。3. 模块化研制，模块化组合。可将不同血清型的hRV流行株的VP7基因克隆到不同的双歧 杆菌中，建成hRV流行株的VP7亚单位疫苗库，当临床上出现不同的hRV流行株时，可根据实 际情况，从菌种库中调取相应的VP7亚单位的双歧杆菌疫苗，随时组合出能够有效应对临床 需要的疫苗，使hRV亚单位疫苗的研制走向模块化发展道路，彻底改变目前hRV疫苗研制周期 长、花费大、保护范围窄的不利局面。4. 经济实惠，口服方便。与重组减毒活疫苗相比，本发明活疫苗发明具有经济适用的特 点，发酵产品不需要进一步的纯化，其研制费用不足前者的十分之一。而剂型可为乳酸发酵 品或胶囊等剂型，便于儿童服用。综上所述，与现有技术的方案相比，本发明双歧杆菌-人轮状病毒VP7口服重组载体活疫 苗效果好，安全性强，使用方便，成本低，具有很好的应用前景。
图l为pBEX-VP7，其中的pAymO表示启动子，VP7表示VP7基因，R印B表示双歧杆菌复制子，bla表示氨苄青霉素抗性基因。图2为VP7基因的PCR结果，其中的1-2表示VP7基因的条带，3表示DNA Marker。 图3为VP7的SDS-PAGE图，其中的l表示pBEX转化双歧杆菌的空白对照，2表示蛋白质Marker, 3-5表示pBEX- hRV/VP7在不同时间的表达情况。图4为本发明？8￡乂- hRV/VP7表达载体的构建过程示意图。图5为本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建过程示意图。
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式
的描述说明但不限制本发明。 实施例一 本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建一.以双歧杆菌的a-淀粉酶(amylase)基因(GenBank No: AY240946)的启动子AmyO (位置599-690 nt)替换pGEX-5x-l上的Ptac启动子(183-932)，同时用PCR方法删除 pGEX-5x-l上的LacIq片段G立置3301-4420 nt)。 具体步骤如下1.用BamHI和Sacn酶切切取由上海生物工程技术公司合成的a -淀粉酶基因AmyO (启动 子)序列110个碱基对，其5'端添加了M13反向测序引物序列(taaaacgacggccagt) (SEQ IDNO. 4)以便于测序。其构建路线如下(1)双歧杆菌a-淀粉酶基因的启动子序歹(J: 599 ta aaataaacag catacgttcg caatagtgca aacgctatca aagaagatga acccccgtta aagggattga agaaaaggaa taaaggagcc 690 (SEQ ID NO. 5)(2) t￡I^S￡ggtaaaacgacggccagt (SEQ ID NO. 6)是加在599前的M13测序引物序列 (灰底)及Sacn酶切位点(下线)和保护碱基(方框)；(3) 在690号碱基后加BamH頂每切位点和保护碱基序列 因此，最后合成的a -淀粉酶基因的启动子序列为tcgaccgcggtaaaacgacggccagttaaaataaacagcatacgttcgcaatagtgcaaacgctatcaaag肌gat g肌cccccgttaaagggattgaagaaaaggaata肌ggagccggatccatc (127bp)(SEQ ID NO. 7)(如无特别标注，本发明中说明书中核苷酸序列的默认书写方式均为由从5'端到3'端 的方向)。2.以pGEX-5x-l质粒为模板，用高保真T叫DNA聚合酶通过PC財广增获得载体基本骨架。 PCR引物F为pGEX-5x-l上的多克隆位点(MCS)序列，引物R为LacIq上游序列。是删除 pGEX-5x-1上Lac I q的的引物序列。引物序列如下pFl: lgllg|ssatccccgaattcccg (SEQ ID N0.8)(位置pGEX-5x-1 934-949，含BamH頂每切位点)；pRl: ll￡I3l^iS￡attcaccaccctgaattgac (SEQ ID NO. 9) ({立置pGEX-5x-1 3320-3301，添加SacI頂每切位点)；PC財广增条件95°C 4 min， (95°C 40 Sec、 52°C 30Sec、 72°C 1 min)X30次循环。结果获得2387bp的pGEX-5x-l上包括氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起始位点在 内的骨架片段(过程示意图见附图5)。PCR产物用BamHI和SacII双酶切后与AmyO酶切产物连接转化，在氨苄青霉素抗性平板上 挑取单克隆，质粒用电泳鉴定，命名pGEX-pAymO，本次改造所得的质粒明显要比第一步所得 到的质粒pGEX-5x-1小1000多个碱基对，测序确认后以Aat I頂每切备用。二.合成长双歧杆菌KJ36质粒(GenBank No: AF139129)的复制蛋白B序列(序列如SEQ ID NO. 12所示，在两端添加Aat n酶切位点及保护碱基)，序列片段由上海生工合成，测序 确认无误。用PCR大量扩增该序列，正向弓l物为pRl: gcgacgtcgtacttagtacaaaagggga (SEQ ID NO. 10) (1-20 nt，添力口Aat n酶切位点)。反向引物为pR2: gcgacgtcatgatgttcgcggttgcg (SEQ ID NO. 11) (1020-1002 nt， 添加Aat n酶切位点)。PC財广增条件为95°C 3 min，再经95。C 50 Sec、 54°C 40Sec、 72°C lmin的30次循环pKJ36复制元件(r印B)序列如SEQ ID NO. 12所示，其中第5 1018位碱基序列为载入本 发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的序列。PCR产物经Aat n酶切后连接到第一步所得的质粒对应的Aat I頂每切位点。连接，转化 ，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认，命名为pBEX。至此，本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建成功，命名为pBEX。全长3509bp ( 附图5中3个片段的核苷酸之和本应为120 + 1014 + 2387 = 3521 bp，因有2个酶切位点重复， 所以应减去重复计算的酶切位点，即减去12个碱基，特此注明)，核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示。以sacll酶切位点序列记作l，该序列的特征如下(1) l-108bp为M13测序引物和a -淀粉酶基因的启动子序列区。(2) 114-150bp为多克隆位点，依次有BamHI， EcoRI， Smal， Sall， XhoI和NotI五个单酶切位点。(3) 1569-2429bp为beta-lactamase (bla，氨节青霉素酶)的编码序列。(4) 559-1410bp为长双歧杆菌的R印B(复制蛋白B)的编码序列。 实施例二构建pBEX- hRV/VP7表达载体(构建过程示意图见附图4) pBEX- hRV/VP7的构建1、先用RT-PCR方法从hRVWa株的基因组中扩增病毒蛋白VP7基因(GENBANK NO. M21843, VP7， hRV Wa strain,编码区49.1029，本发明中使用的VP7基因如SEQ ID NO. 2所示)。引物为VP7 F: atcggatccatgtatggtattgaatatac (SEQ ID NO. 13)(力口入BamHI位点)。 VP7 R: acggtcgacctatacctctataataa,gctg (SEQ ID NO. 14)(力口入SalI位点)。 方法为取提取的RNA 10 yl， 10(TC加热2分钟，使双链RNA变性，冰浴2分钟后瞬时离 心，再力卩入5XAMV Bufer 4yl， dNTPs 2yl，下游引物l y 1 (30yM/yl)， RNasin lyl ，反转录酶AMV 2yl，力nddH20补齐25y l的反应体系。42。C反转录l个小时。然后取一洁净灭菌的PCR管，在50y l反应体系中加人10XPCR Bufer 5y 1，dNTPs(2. 5mM)4y 1，上游引物lyl，下游引物lyl， cDNA 2 y 1， Taq酶0. 2 y 1， ddH20 36.8yl进行扩增。反应条件为94°C 5 min， ( 94°C 30s， 58°C 30s， 72 。C 90s)X30个循 环，72 。C 7min。反应结束后取3yl PCR产物在1X琼脂糖凝胶上进行电泳，纯化的PCR产物与pEASY-Tl进 行T-A连接，测序无误后记作pEASY-hVP7保存备用。2、用BamHI和SalI同时酶切pEASY-hVP7和实施例1制备的pBEX，凝胶电泳后回收VP7片段 和pBEX片段，按2: l体积比连接，转化大肠杆菌DH5a，在氨苄青霉素抗性LB平板上挑取单 克隆，摇菌后提取质粒，用VP7引物进行PCR鉴定(见附图2)，阳性克隆测序后命名为pBEX-hRV VP7 (序列如SEQ ID NO. 3所示)。本实施例构建的pBEX-hRV/VP7，可在大肠杆菌-双歧杆菌中穿梭进行质粒复制，并可通 过转化双歧杆菌，使之可以在含有50yg/ml氨苄青霉素的MRS培养基上生长，并表达 hRV/VP7蛋白质作为口服疫苗的抗原。显然pBEX- hRV/VP7可以作为外源基因在双歧杆菌中表 达的表达载体用于以双歧杆菌为受体菌的所有类型的VP7的表达及其基因工程产品的生产。实施例三本发明含pBEX- hRV/VP7重组载体的双歧杆菌种子菌的制备1、 筛选OD值0.6的双歧杆菌为受体菌，经去离子水配制的灭菌10%甘油处理后，用电转 化法将实施例二制备的pBEX- hRV/VP7重组质粒载体转化到受体菌中。转化条件为15KV、 200 Q、 25yF。2、 将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏60-120 min，然后在 含50yg/ml氨苄青霉素的MRS固体培养基上培养，选择抗性菌落，从而获得转ETEC CFA/I基 因的双歧杆菌，PCR和SDS-PAGE鉴定后的阳性克隆即为含有pBEX- hRV/VP7重组载体的双歧杆 菌种子菌。实施例四本发明种子菌的大规模液体接种扩增培养将实施例三经转基因转化处理后的双歧杆菌复苏后涂布于含50 y g/ml氨苄青霉素的双歧 杆菌MRS培养基上厌氧培养48-72小时，然后挑取单一的抗性菌落于抗性双歧杆菌液体培养基 中增菌培养，经PCR证实VP7阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于含氨苄青霉素的抗性培养 基平板上厌氧培养48-72小时，然后再挑取单一菌落于常规液体培养基中培养，如此反复接 种培养至继代培养不低于15代时PCR检测证实VP7仍然阳性的克隆可以作为种子菌用于大规模液体接种扩增培养的种子菌，保藏待用。实施例五本发明双歧杆菌-hRV/VP7重组载体口服活疫苗制剂的制备及药效验证 本发明双歧杆菌-hRV-VP7重组载体口服活疫苗具体制备过程如下a) 配方鲜牛奶 52 %、白砂糖7.8 %、磷酸二氢钠0.2 %、水40%、卡那霉素 0.005%;操作时先用热水溶解白糖和磷酸二氢钠，搅拌均匀，随后与鲜奶混合，通过双联 过滤器进入离心净乳机，除去杂质。b) 12(TC瞬时杀菌，时间10秒，为最大限度地保持牛奶的养分，物料进入平衡缸，经离 心式卫生泵送人板式热交换器，经过预热、高温杀菌、保温、冷却，达到杀菌的目的。c) 在高压均质机中进行均质，两次均质均采用两段均质。 一段均质压力为70kgf/cm2， 二段均质压力为30kgf/cm2 。d) 接种及发酵首先接种5%转化双歧杆菌发酵菌种液，37'C培养9小时左右，终止酸 度为800T。e) 罐装按5mL规格进行玻璃安培罐装，真空封口， 4'C保藏。 上述的双歧杆菌-hRV-VP7重组载体口服活疫苗微生物指标活性双歧杆菌数》107cfu/mL，大肠菌群数〈30cfu/100mL，致病菌不得检出。 2、 口服活疫苗的药效验证1) 试验分组(20日龄雄性昆明大鼠30只，随机分成下述3组) 疫苗免疫组、无重组载体的双歧杆菌对照组和PBS对照组。2) 昆明大鼠灌胃免疫试验(4.0Xl()9细菌/只)无重组载体的双歧杆菌对照组用不含VP7的pBEX转化的双歧杆菌灌胃，在第0d， 7d， 14d和第21d灌胃共4次；PBS对照组用PBS分别灌胃，在第0d， 7d， 14d和第21d灌胃共4次；疫苗免疫组用上述双歧杆菌-hRV-VP7重组载体口服活疫苗灌胃，在第Od， 7d， 14d和 第21d灌胃共4次；第28d后检测VP7特异的抗体。3) 试验结果疫苗免疫组10只大鼠的抗体滴度均为1: 256，而无重组载体的双歧杆菌对照组和PBS对 照组则没有特异性抗体产生。证明本发明重组口服活疫苗对hRV感染有较强的免疫效应。参考文献1. 李忠明主编.当代新疫苗.北京高等教育出版社，2000， 475-486.2. 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权利要求
1. 一种重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体，其特征在于装载有人A组轮状病毒的病毒蛋白VP7的编码基因序列。
全文摘要
本发明涉及一种重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体及其口服疫苗。属于基因工程领域。所要解决的技术问题为构建新hRV病毒VP7蛋白的双歧杆菌表达载体。本发明重组双歧杆菌hRV-VP7表达载体装载有人A组轮状病毒的病毒蛋白VP7的编码基因序列。本发明表达载体可转入双歧杆菌，发酵培养后进一步制备成转hRV/VP7基因的双歧杆菌-hRV/VP7重组载体口服活疫苗制剂。主要用于预防和辅助治疗人轮状病毒的感染引起的小儿腹泻，具有很好的市场前景。
文档编号C12N15/74GK101220372SQ20081030018
公开日2008年7月16日 申请日期2008年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者宋方洲, 马永平 申请人:重庆医科大学