专利名称：双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方 法和用途。
背景技术：
双歧杆菌质粒的研究相对较少。1982年，Sgortati等对1461株共24个种的双歧杆菌进行 了质粒的检测，发现四个种(总菌株数的20%)的双歧杆菌即长双歧杆菌、球双歧杆菌、星状 双歧杆菌以及印度双歧杆菌含有质粒。在GenBank中检索到双歧杆菌质粒的记录也只有16个 [NC006843、 NC004978、 NC004770、 NC004769、 NC004768、 NC004253、 NC004252、 NC00443、 NC004943、 NC002635、 NC002133、 NC003527、 Y11549、 E17316、 X84655、 DQ093580]但没有 一个是可以直接用于外源基因表达的载体。由于自然界双歧杆菌质粒的稀有性，关于双歧杆 菌表达质粒的研究无论从数量还是质量均很薄弱。穿梭质粒是能在两种或两种以上宿主中复制的质粒，大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒是指 在大肠杆菌和双歧杆菌中均能够复制的人工构建的质粒。以大肠杆菌为宿主，有利于转化和 重组子的筛选，并能增加所需DNA克隆片段的检出率，利于保存和操作等优势。1990年 Marteuzzi等从长双歧杆菌B2577菌株中分离出的隐性质粒pMBl，通过限制性内切酶将pMBl质 粒酶切后连接到质粒载体上，对其复制区域的进行了研究，1994年Missich等将pMBl质粒经 限制性酶切和连接酶作用，在体外与pcEM—5zf (+)质粒重组，成功地构建了大肠杆菌-长双 歧杆菌的穿梭载体pRMl和pRM2[3]。 1996年Rossi， Marteuzzi等以pMBl复制子为基础，构建了 大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体pDG7，这是最早关于双歧杆菌表达质粒的报道[4]。 1998年 Rossi等以pDG7为基础进一步将此质粒载体改建为质粒pDLI41， pDGA7和pDC07，分别用以表 达荧光假单胞菌脂酶，芽胞杆菌淀粉酶和链霉菌胆固醇氧化酶[5]，这是最早报道具有实用 价值的双歧杆菌表达载体的例子。此后的双歧杆菌表达载体大多以此为骨架进行改造。1997 年Matsumura H等以长双歧杆菌质粒为骨架构建了pBLES100表达载体[6] ， 2002年T0SHIYUKI Nakamura等用它表达胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)基因用于实体瘤的基因治疗研 究[7]。国内对大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体的研究非常有限。2006年韩庆旺等以质粒 pDG7、 pBCSK(+)、 pET-9C为基础，构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128，并将人内皮抑素基因插入到新构建的表达载体中表达"」。2006年，侯鑫等以pMBl复制基因片段和 hu启动子为元件，以pMD18-T为骨架，构建了大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pMB-HU，并 表达了抑癌基因PTEN，但从源流上讲，与pET-1128—样，均属于pMBl质粒系列[8]。至于2001 年刘文华等报道的转内皮抑素基因双歧杆菌制剂对肺癌的疗效[9]和任启伟等2004年报道的重 组胞嘧啶脱氨酶基因的婴儿双歧杆菌表达胞嘧啶脱氨酶对鼠黑色素瘤B16—F10细胞的杀伤效 应研究[1<)]，质粒分别是大肠杆菌质粒pBV220和pGEX-lLambdaT，其复制元件均为pBR322的复 制序列，稳定性差。虽然pMBl的复制序列来自双歧杆菌，使质粒的稳定性大大改善，但删除 了pMBl的复制序列的复制起始位点W ，使质粒复制的调控受到影响，在一定程度上影响了质 粒的稳定性。而且在上述的报道中，除侯鑫等以双歧杆菌的hu启动子构建的pMBl重组载体外 ，其余的载体均以大肠杆菌的LacZ或其衍生序列Tac[如pGEX系列载体]制成，需要用IPTG ( Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，异丙基-B-D硫代半乳糖苷)调控才能表达， 而IPTG具有一定的毒性，这在很大程度上限制了它在基因治疗和口服疫苗研制中的应用。总体而言，大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体的构建和优化筛选仍然是双歧杆菌基因工程研 究和发展的弱点和重点，上述穿梭载体转化大肠杆菌与双歧杆菌的效率不同，对双歧杆菌转 化效率还有待于提高，稳定性也有所欠缺；而且目前的穿梭载体的来源单一，需要有使用新 的思路和基本元件构建效率更高、更稳定的穿梭载体，为本领域提供新的载体工具。发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。 本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，以pGEX-5x-l质粒为骨架，含有双歧杆菌的a -淀粉酶基因的启动子Amy0，还含有长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列。其中，所述双歧杆菌的a -淀粉酶基因的启动子八1^0替换了口0￡乂-5^1上的启动子？1￡^。 进一步的，上述的pGEX-5x-l质粒缺失了LacIq片段。进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体具有SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体还带有抗性筛选基因。比如带有 氨苄青霉素抗性筛选基因，能使转入上述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的重组菌在含有 50y g/ml氨苄青霉素的MRS培养基上生长，用于筛选重组菌。进一步的，上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体还含有可表达的外源基因。更进一 步的，上述的外源基因为人产肠毒素大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位基因。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种制备上述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的方法，该方法包括以下步骤a、 以双歧杆菌的a -淀粉酶基因的启动子AmyO替换pGEX-5x-l上的Ptac启动子；b、 将长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列酶切后连接到步骤a所得的质粒上，转化大 肠杆菌，筛选，检测确认后即得。进一步的，上述方法的步骤a中还要删除pGEX-5x-l质粒的LacIq片段。本发明所要解决的第三个技术问题是提供了含有上述所述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达 载体的宿主细胞。进一步的，所述的宿主细胞为双歧杆菌或大肠杆菌。本发明所要解决的第四个技术问题是提供上述的宿主细胞在制备口服疫苗或口服疫苗的 粘膜免疫佐剂中的用途。本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，该 口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂是上述的宿主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成 分制备而成的。本发明中涉及使用的现有的核苷酸序列均能在已发表的本领域学术刊物及GenBank中检 索而得，本领域普通技术人员均能在参考本领域教科书或试验手册的基础上完成本发明涉及 的分子生物学和细胞生物学试验。本发明的有益效果为本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体创造性地采用双歧杆菌 质粒pKJ36的复制子作为重组载体在双歧杆菌中稳定复制的基本复制元件，与现有技术中使 用的pMBl系列相比，保留了复制起始位点的重复序列，重组质粒的复制受到严格的调控，因 此，增加了重组质粒的稳定性，并同时具有双歧杆菌质粒的复制起始元件和大肠杆菌的复制 起始元件。另外还创造性地使用双歧杆菌a -淀粉酶基因的启动子作为重组质粒驱动外源基 因表达的启动子， 一方面该启动子在双歧杆菌中广泛存在，是淀粉代谢的主要酶类，因此， 在双歧杆菌中很容易使外源基因高效地表达；另一方面，该启动子不需要特殊的调控因子， 很适合在体内表达外源基因，免去了调控因子的毒性(如ITPG)和增加的生产成本，具有良 好的生物安全性。本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体中可以用来携带如人产肠毒素大 肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位基因等各种外源基因在双歧杆菌或大肠杆菌中表达，使生产 得到的重组工程菌具有更高的表达效率，表达量也更为稳定，能广泛应用于制备口服疫苗或 口服疫苗的粘膜免疫佐剂中，为本领域的相关应用提供了一种新的载体工具，具有很好的应 用前景。
图l为pGEX-5x-l，其中的ptac表示tac启动子，引物F表示正向引物，引物R表示正反引 物，MCS表示多克隆位点，laclq表示阻遏蛋白编码区。图2为pBEX，其中的pAymO表示a-淀粉酶基因启动子，MCS表示多克隆位点，R印B表示 长双歧杆菌复制子序列区，bla表示氨苄青霉素抗性基因编码区。图3为MCS序列及酶切位点，图4为pGEX-pAymO电泳图谱，其中的P表示质粒pGEX-pAymO (2. 5kb) ， M表示DNA marker(1DNA/Hind11)。图5为pBEX电泳图谱，其中的P表示质粒pBEX (3. 5kb)， M表示DNA marker(自制PCR产 物Marker)。图6为pBEX-LTB电泳图，其中的M表示DNA marker (自制PCR产物Marker) ， l为ltB的PCR 产物(390bp) ， 2为pBEX-LTB质粒与ltB的PCR产物的混合物，3为pBEX-LTB质粒。 图7为pBEX-LTB，其中的1 tB表示ETEC-1 tB编码区。图8为pBEX-LTB在双歧杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图，其中的2表示蛋白质marker(上海 生工)，1， 3-5表示ltB基因在不同时间表达的LTB的产物(8h， 4h) ， 6表示pBEX空白对照。图9为pBEX-LTB口服活疫苗的保护性试验，其中的A为无重组载体双歧杆菌组大鼠经 E44815攻毒后的结果，B为疫苗免疫组大鼠经E44815攻毒后的结果，可见A组较B组出现了严 重的小肠涨气。图io为本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建过程示意图。图11为用本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建表达LTB基因的工程菌的流程图。
具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式
的描述说明但不限制本发明。 实施例一 本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建一.以双歧杆菌的a-淀粉酶(amylase)基因(GenBank No: AY240946)的启动子AmyO (位置599-690 nt)替换pGEX-5x-l上的Ptac启动子(183-932)，同时用PCR方法删除 pGEX-5x-l上的LacIq片段G立置3301-4420 nt)。 具体步骤如下1.用BamHI和Sacn酶切切取由上海生物工程技术公司合成的a -淀粉酶基因AmyO (启动 子)序列110个碱基对，其5'端添加了M13反向测序引物序列(taaaacgacggccagt) (SEQ ID NO. 6)以便于测序。其构建路线如下(1) 双歧杆菌a-淀粉酶基因的启动子序歹(J: 599 ta aaataaacag catacgttcg caatagtgca aacgctatca aagaagatga acccccgtta aagggattga agaaaaggaa taaaggagcc 690 (SEQ ID NO.7);(2)^^^Egtaaaacgacggcx蹈t (SEQ ID N0.8)是加在599前的肌3测序引物序列及Sacn酶切位点(下划线)和保护碱基(方框)；(3)在690号碱基后加Bamm酶切位点和保护碱基序列^^^因此，最后合成的a -淀粉酶基因的启动子序列为tCg3CCgCggt肌肌Cg3CggCC3gtt肌肌t肌3C3gC3t3CgttCgC肌t3gtgC肌3CgCt3tC肌3g肌g3tg肌Cccccgtt肌agggattgaagaaaaggaata肌ggagccggatccatc (127bp)(SEQ ID NO. 9)(如无特别标注，本发明中说明书中核苷酸序列的默认书写方式均为由从5'端到3'端的 方向)。2.以pGEX-5x-l质粒(序列如SEQ ID NO. 2所示，结构简图见附图l)为模板，用高保真 T叫DNA聚合酶通过PC財广增获得载体基本骨架。PCR引物F为pGEX-5x-l上的多克隆位点(MCS)序列，引物R为LacIq上游序列。是删除 pGEX-5x-1上Lac I q的的引物序列。引物序列如下PF1: ^!^g辟tccccgaattcccg (SEQ ID N0. 10)(位置 pGEX-5x-1 934-949，含BamH頂每切位点)； pRl:teg咖egeggatte謡accxtgaattgac (seq m nq.u)(位置pGEX—5x—工3320-3301，添加SacI頂每切位点)；PC財广增条件95°C 4 min， (95°C 40 Sec、 52°C 30Sec、 72°C 1 min)X30次循环。结果获得2387bp的pGEX-5x-l上包括氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起始位点在 内的骨架片段。(骨架片段序列如SEQ ID NO. 3所示，过程示意图见附图IO)PCR产物用BamHI和SacII双酶切后与AmyO酶切产物连接转化，在氨苄青霉素抗性平板上 挑取单克隆，质粒用电泳鉴定，命名pGEX-pAymO (见附图4)，本次改造所得的质粒明显要 比第一步所得到的质粒pGEX-5x-1小1000多个碱基对，测序确认后以Aat I頂每切备用。第二步合成长双歧杆菌KJ36质粒(GenBank No: AF139129)的复制蛋白B序列(位置SEQ ID N0.4所示，在两端添加Aat n酶切位点及保护碱基)，序列片段由上海生工合成，测序确认 无误。用PCR大量扩增该序列，正向弓l物为pRl: gcgacgtcgtacttagtacaaaagggga (SEQ ID NO. 12) (1-20 nt，添力口 Aat n酶切位点)。反向引物为pR2: gcgacgtcatgatgttcgcggttgcg (SEQ ID NO. 13) (1020-1002 nt， 添加Aat n酶切位点)。PC財广增条件为95°C 3 min，再经95。C 50 Sec、 54°C 40Sec、 72°C lmin的30次循环pKJ36复制元件(r印B)序列如SEQ ID NO. 4所示，其中第5 1018位碱基序列为载入本发 明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的序列。PCR产物经Aat n酶切后连接到第一步所得的质粒对应的Aat I頂每切位点。连接，转化 ，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认，命名为pBEX (电泳检 测结果见附图5)。至此，本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建成功，命名为pBEX。全长3509bp ( 附图10中3个片段的核苷酸之和本应为120 + 1014 + 2387 = 3521 bp，因有2个酶切位点重复， 所以应减去重复计算的酶切位点，即减去12个碱基，特此注明)，核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示。以sacll酶切位点起始序列记作l，该穿梭表达载体的主要特征如下(1) l-108bp为M13测序引物和a -淀粉酶基因的启动子序列区。(2) 114-150bp为多克隆位点，依次有BamHI， EcoRI， Smal， Sall， XhoI和NotI五个单酶切位点。(3) 1569-2429bp为beta-lactamase (bla，氨苄青霉素酶)编码序列，作抗性筛选基因。(4) 559-1410bp为长双歧杆菌的R印B(复制蛋白B)的编码序列。实施例二使用本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建表达LTB基因的工程菌 本实施例是将人产肠毒素大肠杆菌(縮写ETEC，卫生部药品鉴定所菌种保藏号 EC44815)的不耐热肠毒素B亚单位(縮写为LTB)的基因(GenBank No: M17874;位置 79-391 nt)连接到实施例一制备得到的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBEX中构建表达 LTB基因的穿梭载体pBEX-LTB (见附图ll)。显然，实施例一中制备得到的双歧杆菌-大肠杆 菌穿梭表达载体pBEX还可用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基因的表达及其基因工程产品 的生产。1、使用本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体构建表达LTB基因的工程菌的步骤如下(1) 用PC財广增ETEC LTB基因并经测序证明无误后用BamHI和EcoRI双酶切后连接到双 歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBEX的多克隆位点上，构建成转化载体。PCR正向弓1物为LTF : aaggtcgacggatccatgaataaagtaaaatg (SEQ ID NO. 14)(力口入 了BamH頂每切位点)。反向弓1物为LTR: acggagctcgaattcttag織tgctttt,g (SEQ ID NO. 15)(力口入EcoRI 酶切位点)。PC財广增条件为95°C 5 min， (95°C 50 Sec、 53°C 30Sec、 72°C 1 min)X30次循环。 PCR产物经Aat n酶切后连接到第一步所得的质粒对应的Aat I頂每切位点。连接转化，在氨苄青霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认(见附图6)。至此，本发明含ETEC LTB基因的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBEX-LTB构建成功，全长3881bp (结构简图如附图7所示)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。(2) 以双歧杆菌为受体菌，经去离子水配制的灭菌10%甘油处理后，用电转化法将质粒 载体转化到受体菌中。转化条件为15KV、 200 Q、 25yF。(3) 将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏60-120 min，然后 在含50yg/ ml氨苄青霉素的MRS固体培养基上厌氧培养，选择抗性菌落，从而获得转ETEC LTB基因的双歧杆菌。PCR和SDS-PAGE鉴定后的阳性克隆即为双歧杆菌-ETEC LTB重组载体的种子菌。如此反复 接种培养至继代培养不低于15代时PCR检测证实LTB仍然阳性的克隆作为种子菌用于大规模液 体接种扩增培养，培养物经离心浓縮，进一步制备成转ETEC LTB基因的双歧杆菌-ETEC LTB 重组菌。2、用SDS-PAGE电泳试验检测LTB是否在上述大规模液体接种扩增培养的双歧杆菌-ETEC LTB重组菌中的稳定表达，结果见附图8。从附图8中可以看出LTB在受体双歧杆菌中能够稳定 和高效率的表达。实施例三使用本发明双歧杆菌-ETEC LTB重组菌制备口服活疫苗及该疫苗的药效验证1、 将实施例2制备的双歧杆菌-ETEC LTB重组菌制成乳酸发酵制剂、片剂和胶囊制剂的 双歧杆菌-ETEC LTB重组载体口服活疫苗，用于预防和治疗ETEC引发腹泻性疾病。也可以作 为所有口服疫苗的粘膜免疫佐剂。2、 口服活疫苗的药效验证1)试验分组(20日龄雄性昆明大鼠30只，随机分成下述3组) 疫苗免疫组、无重组载体的双歧杆菌对照组和PBS对照组。2) 昆明大鼠灌胃免疫试验(4.0乂109细菌/只)无重组载体的双歧杆菌对照组用不含LTB的pBEX转化的双歧杆菌灌胃，在第Od， 7d， 14d和第21d灌胃共4次；PBS对照组用PBS分别灌胃，在第Od， 7d， 14d和第21d灌胃共4次；疫苗免疫组用上述双歧杆菌-ETEC LTB重组载体口服活疫苗(胶囊)灌胃，在第Od， 7d， 14d和第21d灌胃共4次；第21d后用E44815大肠杆菌(4.0X10H细菌/只)对疫苗免疫组、PBS对照组和无重组 载体的双歧杆菌对照组的大鼠进行灌胃攻毒试验，24h后解剖观察。3) 试验结果无重组载体的双歧杆菌对照组和PBS对照组的大鼠100%出现了很严重的小肠涨气，且肠 液分泌较多(由于种属差异，不产生腹泻症状)，而疫苗免疫组有明显的保护作用，小肠涨 气均很轻微，100%没有明显的肠液分泌(对比结果见附图9)，证明本发明双歧杆菌-ETEC LTB重组菌口服活疫苗对大肠杆菌产生的LT肠毒素产生了较好的免疫保护作用。由上述实施例可见，本发明穿梭表达载体稳定性高，在双歧杆菌中很容易使外源基因高 效地表达，免去了调控因子的毒性(如IPTG)和增加的生产成本，具有良好的生物安全性， 在基因治疗和口服疫苗研制中有很好的应用前景，为相关领域的应用提供了新的选择。参考文献[l]Sgorbati B， Scardovi V， Leblanc DJ. Plasmids in the genus Bifidobaeterlum [J].J Gen Microbiol. 1982， 128 (Pt9) : 2121—2131.[2]Matteuzzi D， Brigidi P， RossiM， et al. Characterization and molecular cloning of Bifidobactefium longum cryptic plasmid pMBl[J]. Lett Appl Microbiol. 1990; 11 (4): 220—223.[3] Missich R， Sgorti B， Leblanc DJ. Tmnsformation of Bifidobacterium longum with pRM2， a constructed Eseherichia coli—B. longum suttle vector[J]. Plasmid. 1994 s印；32(2): 208—211.[4]Rossi M， Brigidi P， Gonzalez Vara y Rodriguez A， Matteuzzi D. Characterization of the plasmid pMBl from Bifidobacterium longum and its use for shuttle vector construction. Res Microbiol. 1996;147③133-43.[5]Rossi M， Brigidi P， Matteuzzi D. Improved cloning vector forBifidobaeterium spp[J]. Lett A卯l Microbiol 1998; 26(2): 101一104.[6] Matsumura H， Takeuchi A， Kano Y.Construction of Escherichia coli-Bifidobacterium longum shuttle vector transforming B. longum 105-A and 108-A. Biosci Biotechnol Biochem. 1997 Jul;61(7):1211-2.[7] Takeuchi A， Matsumura H， Kano Y. et al. Cloning and expression in Escherichia coli of a gene， hup， encoding the histone-like protein HU of Bifidobacterium longum. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 Mar;66③598-603.[7]韩庆旺，徐叶芬，傅更锋，张洪英，樊燕蓉，刘新巻，徐根兴，大肠杆菌-双 歧杆菌穿梭表达载体的构建及内皮抑素基因的表达，生物技术通讯，2006， 17 (1) : 18-21[8]侯鑫，刘俊娥，大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭载体的构建及PTEN在长双歧杆菌中的表 达，微生物学报，2006， 46 (3) : 347-352[9]刘文华、董文度、徐根兴等，口服转内皮抑素基因双歧杆菌制剂对肺癌的疗效，南 京军医大学学报，2001， 23 (2) : 77-79[10]任启伟，郭志英，王立赞，王乐军，王树人，携带重组胞嘧啶脱氨酶基因的婴 儿双歧杆菌对鼠黑色素瘤B16—F10细胞的杀伤效应研究，济宁医学院学报，2004， 27 (4) : 1-5SEQUENCE LISTING〈110>重庆医科大学〈120>双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途〈130> A080009K〈160> 15〈170> Patentln version 3. 4〈210> 1〈211> 3509〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial〈400> 1ccgcggtaaaacgacggccattcgcaatagtgcaaacgct60atgaacccccgtta肌gggaagccggatcc120ccgaattcccgggtcgactcgagcggccgcatcgtgactgactgacgatctgcctcgcgc180gtttcggtgatgacggtg肌aacctctgacacatgcagctcccgg卿cggtcacagctt240gtctgtaagcggatgccggg3gC3g3C肌gcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcg300ggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtat肌ttcttg肌360gacga肌gggcctcgtgatacgcctatttttgtcatgataataatggttt420cttagacgtcgtacttagtac肌肌ggggagcgaacttagtac肌肌ggggagcgaacttg卿gcg肌cagg卿gcga540ttgtactagtatggagtcatgtccaatgagatcgtgaagttcagc肌ccagttc肌c肌c600gtcgcgctgaagaagttcgacgccgtgcacctggacgtgctcatggcgatcgcttcaagg660gtgaggg卿agggcacggccacggtggagttctcgttcgaggagctgcgcggcctcatg720cgattgaggaag肌cctgacc肌c肌gcagctggccgacaagatcgtgcagacg肌cgcg780cgcctgctggcgctgaactacatgttcgaggattcgggcagttcgcgctg840ttcacgaagttcgtcaccgacccgcaggaggcgactctcgcggttggggtc肌cgaggagttcgcgttcctgctcaacgacctgaccagccagttcacgcgcttcgagctggccgagttc960gccgacctcacgcc肌ggagttctacaggcgcgccaagcagtaccgcagc1020tcgggaatctgga卿tcagccgcgatgagttctgccgactgcttggcgtatccgattcc1080CC3CCgCC肌cctgaacagggtcgtgctgaagacgatcgccga卿gtgt1140gggcctctccttggcctgaagatcgagcgccagtacgtgaaacgcaggctgtcgggcttc1200gtgttcacgttcgcccgcgagacccctccggtgatcgacgccaggcccgt卿ggcgagg1260a卿cggacggcgacggc肌gggccattggacgagcgtggcggggtacggcgaggtgttc1320acgaccacggagctgttcgacgtgacggccgcgcgtgaccacttcgacggc獄gtggag1380gccgggg肌tgccgtttcctgcgcgtttgacgcgcgcaaccgcgaacatcatgacgtcag1440gtggcacttttcgggga肌tgtgcgcgg肌cccctatttgtttatttttc1500tccgctcatggcttc肌t肌1560gga卿gtatgagtattc肌catttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcatttt1620gccttcctgtttttgctcacCC3g肌3CgCtggtga肌gtgaagatcagt1680tgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctc肌cagcggtaagatccttgagagtt1740ttcgccccgaagaacgttttgcacttttaaagttctgctatgtggcgcgg1800tattatcccgtgttgacgccgggca卿gcaactcggtcgccgcatacactattctcaga1860atgacttggttgagtactcaccagtcacagtacggatggc1920gagaattatgcagtgctgcctgcggccaacttacttctga1980caacgatcggagg獄,ggagctaaccgcttttttgcac肌catgggggatcatgt肌2040ctcgccttgatcgttggg肌ccggagctga3CC肌3Cg3Cgagcgtgaca2100ccacgatgcctgcagcaatggc肌c肌cgttgcgcaaactattaactggcg肌ctactta2160ctctagcttcccggc肌c肌ggatggaggcggataaagttgcaggaccac2220ttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgagccggtgagc2280gtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggcc卿tggtaagccctcccgtatcgtag2340ttatctacacgacggggagtcaggc肌ctatggatg肌cgatcgctgaga2400taggtgcctccattggtaactgtcagaccaagtttactca2460aaaactt 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〈223>第5 1018位碱基序列为载入本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的序列
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〈223> 第115 500位碱基序列为LTB基因序列<formula>formula see original document page 21</formula>gccga卿gtgtgggcctctccttggcctgaagatcgagcgccagtacgtga肌cgcagg1560
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1. 一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于以pGEX-5x-1质粒为骨架，含有双歧杆菌的α-淀粉酶基因的启动子AmyO，还含有长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B的序列。
1.根据权利要求9所述的含有双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体的宿 主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为双歧杆菌或大肠杆菌。
2.权利要求9或10所述的宿主细胞在制备口服疫苗或口服疫苗的粘 膜免疫佐剂中的用途。
3.一种口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐剂，其特征在于是由权 利要求9或10所述的宿主细胞添加药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的。
全文摘要
本发明涉及双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其制备方法和用途，属于基因工程领域。本发明所要解决的技术问题为提供新的高效，安全，能稳定表达的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，以pGEX-5x-1质粒为骨架，将pGEX-5x-1上的启动子Ptac替换为双歧杆菌的α-淀粉酶基因的启动子AmyO，还含有长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列。本发明双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体能广泛适用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基因的表达及其基因工程产品的生产，为本领域的相关应用提供了一种新的载体工具，具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/70GK101220370SQ200810300178
公开日2008年7月16日 申请日期2008年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者马永平 申请人:重庆医科大学