专利名称：一种纯化细菌磁小体的系统的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种纯化细菌磁小体的系统，属于生物技术领域。 技术背景
磁小体主要由微生物合成的Fe304晶体，质膜和蛋白质构成，颗粒大小在 40-50rnn之间，分散性好，磁性强，生物相容性好，所以它是一种很理想的 生物纳米材料。目前纳米磁性颗粒在生物医学诊断和纳米科学方面的应用引 起了极大的关注。例如，纳米磁性颗粒被用于体外蛋白和核酸的检测，体内 细胞表面和细胞质蛋白的检测，分子检测信号的加强，核磁共振成像，高灵 敏度的磁性检测试剂，制备磁性细胞并分离纯化目的细胞，用于金属处理和 污水回收。到目前为止，人工合成的纳米磁颗粒被广泛地应用于上述领域， 然而其分散性，颗粒的均一度，磁性，生物相容性并不能完全符合上述领域 严格要求。磁小体与人工纳米磁性颗粒相比，颗粒均匀，磁性强，分散性和 生物相容性好，使得磁小体在生物及医学领域的应用前景更为广阔。由于磁 小体的脂膜中还含有大量的蛋白，这些蛋白可以为抗体的连接提供了很好的 位点。磁小体在免疫检测方面的应用与传统方法相比有着很高的灵敏度。但 是，磁小体的膜蛋白有可能在体内引起非正常的免疫反应，这使得磁小体作 为抗癌药物载体和基因治疗载体受到了限制。目前大部分研究者所使用的纯 化磁小体的方法只适用于少量磁小体的提取。
综上所述，细菌磁小体的应用前景广泛，成本低廉。但是，它的应用还 受到一些条件的限制，其一是磁细菌培养困难，无法获得大量的材料(本试 验室的前期工作已将此问题解决)，其二是磁小体的大量快速纯化。目前磁小体纯化提取存在的问题是，1)离心收集菌体，不适用于工业化生
产。2)使用高压均质机或细胞超声破碎仪破碎细胞，细胞超声破碎仪的功率 太高可能会使磁小体质膜受到损伤。3)将破碎好的细胞放置在容器内，容器 外底部放置磁铁，利用磁铁的磁性将磁小体和细胞碎片分离开，此过程所用 时间的可能会相当长并且效率低。4)当磁小体被分离后，弃去上清，将磁小 体重悬于缓冲溶液中，使用低功率的超声波轻击打，再用磁铁吸附，弃上清。 此步骤重复20次以上。此过程完全人工处理，费时费力。5)此方法只适用于 实验室小规模提取纯化磁小体，几乎不能实现磁小体的商业化应用。
发明内容
本实用新型针对上述问题，采用磁性层析装置分离纯化磁小体，提供了 一种全新的纯化细菌磁小体的系统。避免了传统纯化方法的各种缺点，破碎 细胞和磁小体的分离同时进行，即破碎好的细胞直接流入磁性层析装置。当 细胞破碎完，磁小体的分离也基本完成，这一步所用的时间只用了相当于传 统方法破碎细胞的时间，节省了离心和菌液重悬时间。在整个纯化过程中只 有在磁小体需要过磁性层析装置时才需要使用细胞超声破碎仪打散分散。而 磁小体达到纯化要求，最多需要过5次磁性层析装置。与传统方法相比，减 少细胞超声破碎仪的作用时间和次数，使磁小体的质膜受到损伤的可能性降 到了最低。而且磁小体纯化效率高，能够实现磁小体纯化的半自动化，操作
安全方便，性能稳定可靠。本发明是通过以下技术方案实现的
一种纯化细菌磁小体的系统，主要包括发酵罐l，高压均质机3、细胞超 声破碎仪16,其特征在于，高压均质机3通过管道连接一个三相通路接头的 一端，此通路接头的其余两端分别通过管道与蠕动泵6和储液槽4相连接， 其中与储液槽4相连接的管道上装有可开关阀门5，蠕动泵6的另一端与磁 性层析装置18的下端接口 24相通，磁性层析装置18的下端还有一个接口25与蠕动泵7连接，蠕动泵7通过装有可开关阀门8的管道与储液槽4连接， 并且通过一个三相通路接头与阀门9连接，阀门9的另一端与细胞超声破碎 仪16相连，细胞超声破碎仪16另一端与蠕动泵15连接，蠕动泵15的另一 端与电洗脱仪11连接，电洗脱仪11的另一端与蠕动泵14连接，蠕动泵14 的另一端通往磁力搅拌器12的底部，磁性层析装置18的上端有两个端口分 别与两个阀门17和19连接。
上述的纯化细菌磁小体的系统中，所述的分离纯化磁小体的磁性层析装 置18包括，用于洗脱吸附层析柱上磁小体的超声水槽26，使层析系统带有 磁性的永磁铁22和可吸附磁小体的层析柱20;该永磁铁22设置在超声水槽 26的一侧槽壁上，层析柱20竖直固定于永磁铁22上，永磁铁22在层析柱 20和超声水槽26之间，形成夹心结构。
上述的纯化细菌磁小体的系统中，所述的层析柱20是由一个内置铁珠 21的塑料圆柱体，该圆柱体一端有两个接口 24和25并且内部装置一个塑料 网23，另一端有一个接口 27。塑料网23可防止铁珠堵塞接口 24和25。
上述的纯化细菌磁小体的系统中，所述的电洗脱仪11包括电洗脱槽31， 其两端有接口 30用于连接降低槽内温度的水循环系统28，其中电洗脱槽31 的底部中间部位有可装卸永磁铁32的插槽33。
上述的纯化细菌磁小体的系统中，所述的磁力搅拌器12带有可控速旋钮 和开关，其上置容器的底端与蠕动泵14连接，容器的口部分别由管道与蠕动 泵10和13连接。
上述的纯化细菌磁小体的系统中，所述的发酵罐1通过阀门2连接高压 均质机3。
上述的纯化细菌磁小体的系统中，所述的储液槽4由塑料或有机玻璃材 料制成，其内部被分成几个可储存不同液体的单元格，用于储存各种缓冲溶 液和磁小体悬液；储液槽4带有控温仪。储液槽4不应使用钢铁等易锈蚀具有磁性的金属材料，以防止金属磁性材料剥落影响磁小体的纯化质量和磁性 层析装置的吸附效率。
上述的纯化细菌磁小体的系统中，所述的管道为硅胶管。
上述的纯化细菌磁小体的系统中，所述的铁珠21的直径为4mm-6mm 。 本实用新型与经典的磁小体纯化提取方法(Li xiang， Jiang Wei， Sun
Jianbo et al， 2007, Lett, in Appl. Micro. 45 (1): 75-81)相比具有如
下优点
1. 本系统中磁性层析装置的设置，可快速、高效地纯化磁小体，使磁小体与 细菌细胞的其它物质成分快速分离。带有铁珠的层析柱在磁小体纯化过程 中起到重要的作用，使得快速纯化磁小体成为可能，减少了细胞超声破碎 仪的作用时间和次数，使磁小体的质膜受到损伤的可能性降到了最低。
2. 电洗脱仪可以快速洗脱磁小体膜上所吸附的和膜结合不紧密的蛋白，电洗 脱仪使用简单的电泳仪即可，洗脱方式简单，每次洗脱只需使用15-30分 钟。在经过电洗脱后磁小体的膜还保持完整。
3. 本系统操作安全方便、性能稳定可靠，能够实现磁小体纯化的半自动化， 目前在国内外还没有此类设备，造价低廉。
图1为本实用新型一种纯化细菌磁小体的系统的结构示意图； 图2为本实用新型的磁性层析装置18的结构示意图； 图3为本实用新型的电洗脱仪11的结构示意图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本实用新型做进一步的说明
图中1为发酵罐，3为均质机，4为储液槽，18为磁性层析装置，16为细胞超声破碎仪，ll为电洗脱仪，12为磁性搅拌装置，6、 7、 10、 13、 14、 15为蠕动泵，2、 5、 8、 9、 17、 19为阀门，20为层析柱，21为铁珠，22为 永磁铁，23为塑料网，24、 25、 27为接口， 26为超声水槽，28为水循环系 统，29为电极接口， 30为接口， 31为电洗脱槽，33为插槽，32为可装卸永 磁铁。
如图l、 2和图3所示，本连续、规模化纯化细菌磁小体的系统主要包括 发酵罐1，高压均质机3、细胞超声破碎仪16，发酵罐1通过阀门2连接高 压均质机3，高压均质机3通过管道连接一个三相通路接头的一端，此通路 接头的其余两端分别通过管道与蠕动泵6和储液槽4相连接，其中与储液槽 4相连接的管道上装有可开关阀门5，蠕动泵6的另一端与磁性层析装置18 的下端接口 24相通，磁性层析装置18的下端还有一个接口 25与蠕动泵7连 接，蠕动泵7通过装有可开关阀门8的管道与储液槽4连接，并且通过一个 三相通路接头与阀门9连接，阀门9的另一端与细胞超声破碎仪16相连，细 胞超声破碎仪16另一端与蠕动泵15连接，蠕动泵15的另一端与电洗脱仪 11连接，电洗脱仪11的另一端与蠕动泵14连接，蠕动泵14的另一端通往 磁力搅拌器12的底部，磁性层析装置18的上端有两个端口分别与两个阀门 17和19连接。
本系统的核心部分是分离纯化磁小体的磁性层析装置18，它包括，用于 洗脱吸附层析柱上磁小体的超声水槽26，使层析系统带有磁性的永磁铁22 和可吸附磁小体的层析柱20;该永磁铁22设置在超声水槽26的一侧槽壁上， 层析柱20竖直固定于永磁铁22上，永磁铁22在层析柱20和超声水槽26之 间，形成夹心结构。
层析柱20为磁性层析装置18的关键部分，它是一个内置铁珠21的塑料 圆柱体，该圆柱体一端有两个接口24和25并且内部装置一个塑料网23，另 一端有一个接口 27。塑料网23可防止铁珠堵塞接口 24和25。本系统的电洗脱仪11包括电洗脱槽31，其两端有接口 30用于连接降低 槽内温度的水循环系统28，其中电洗脱槽31的底部中间部位有可装卸永磁 铁32的插槽33。
本系统的磁力搅拌器12带有可控速旋钮和开关，其上置容器的底端与蠕 动泵14连接，容器的口部分别由管道与蠕动泵10和13连接。
本系统的储液槽4由塑料或有机玻璃材料制成，其内部被分成几个可储 存不同液体的单元格，用于储存各种缓冲溶液和磁小体悬液；储液槽4带有 控温仪。储液槽4不应使用钢铁等易锈蚀具有磁性的金属材料，以防止金属 磁性材料剥落影响磁小体的纯化质量和磁性层析装置的吸附效率。
本系统中的管道都为硅胶管。
本系统中铁珠21的直径为4mm-6mm。
本实用新型的工作程序是(1)当趋磁细菌发酵结束时，往发酵罐l加入 PBS缓冲溶液(O.IM， pH6.54)。然后将混合溶液输入高压均质机3，破碎细胞。
(2)启动蠕动泵6，打开阔门17用于排出废液，破碎好的细胞悬液进入 磁性层析装置18，以分离清洗磁小体。当所有的菌体破碎悬液都进入到磁性 层析分离系统18并且磁小体被吸附到层析柱上后，废弃的悬液经阀门17被 排出系统。打开阀门5向磁性层析装置18中泵入6倍体积(这里指柱体积的 6倍，下同)的磷酸盐缓冲溶液(lOniM， pH 7.2-7.4)，接着泵入6倍体积的 含2M尿素的磷酸盐溶液，关闭蠕动泵6，阀门5和阀门17。在本实施例中， 储液槽4被分隔成四个槽可用于盛储不同的溶液。
接通超声水槽26电源，打开蠕动泵7和阀门19使磁小体被泵7泵出的缓 冲溶液带动流出磁性层析系统18，只有在超声水槽通电工作的时候，磁小体 与磁性层析系统结合不紧密，磁小体才能被缓冲溶液从磁性层析系统18冲洗 出来。打开阀门9，磁小体被蠕动泵7泵到超声细胞破碎仪16中，超声分散的参数设置为超声50次，功率20-200W，每次超声4秒，每两次超声之间 间歇6秒；在磁小体被超声分散之后，启动蠕动泵7将磁小体悬液泵入磁性 层析装置18中，并打开阀门5和17，关闭阀门19，启动蠕动泵6，用磷酸 盐缓冲溶液洗脱；接着再将磁小体洗脱至超声细胞破碎仪16中进行超声分 散。重复上述操作4一5次。
(3) 最后打开阀门8和19关闭阀门17， 9和5，把蛋白酶K加入到储 液槽4中，用蛋白酶k消化磁小体膜上的蛋白，消化温度5(TC，保温卜3小 时；打开蠕动泵15，打开阀门9，关闭阀门5， 17， 19。将磁小体泵入电洗 脱仪ll进行电洗脱，并打开水循环系统28，洗脱电压控制在100-400mA之 间。
(4) 打开蠕动泵14将磁小体泵入磁性搅拌装置12，关闭蠕动泵14。打开 蠕动泵10将纯水泵入磁性搅拌系统12中，静置20分钟使磁小体吸附在磁性层 析系统底部，打开泵13将上层的溶液泵出。重复本步骤3次。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明技术方案而非限制， 尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技 术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求1. 一种纯化细菌磁小体的系统，主要包括发酵罐(1)，高压均质机(3)、细胞超声破碎仪(16)，其特征在于，高压均质机(3)通过管道连接一个三相通路接头的一端，此通路接头的其余两端分别通过管道与蠕动泵(6)和储液槽(4)相连接，其中与储液槽(4)相连接的管道上装有可开关阀门(5)，蠕动泵(6)的另一端与磁性层析装置(18)的下端接口相通，磁性层析装置(18)的下端还有一个接口与蠕动泵(7)连接，蠕动泵(7)通过装有可开关阀门(8)的管道与储液槽(4)连接，并且通过一个三相通路接头与阀门(9)连接，阀门(9)的另一端与细胞超声破碎仪(16)相连。
2. 根据权利要求1所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，细胞超声破 碎仪(16)另一端与蠕动泵(15)连接，蠕动泵(15)的另一端与一电洗 脱仪(11)连接，该电洗脱仪(11)的另一端与蠕动泵(14)连接，蠕动 泵(14)的另一端通往磁力搅拌器(12)的底部，磁性层析装置(18)的 上端有两个端口分别与两个阔门(17， 19)连接。
3. 根据权利要求1或2所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，所述的 磁性层析装置(18)包括，用于洗脱吸附层析柱上磁小体的超声水槽(26)， 使层析系统带有磁性的永磁铁(22)和可吸附磁小体的层析柱(20);该 永磁铁(22)设置在超声水槽(26)的一侧槽壁上，层析柱(20)竖直固 定于永磁铁(22)上，永磁铁(22)在层析柱(20)和超声水槽(26)之 间，形成夹心结构。
4. 根据权利要求3所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，所述的层析 柱(20)是一个内置铁珠(21)的塑料圆柱体，该圆柱体一端有两个接口(24， 25)并且内部装置一个塑料网(23)，该圆柱体的另一端有一个接 口 (27)。
5. 根据权利要求2所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，所述的电洗 脱仪(11)包括电洗脱槽(31)，其两端有接口 (30)用于连接降低槽内 温度的水循环系统(28)，其中电洗脱槽(31)的底部中间部位有可装卸 永磁铁(32)的插槽(33)。
6. 根据权利要求2或5所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，所述的 磁力搅拌器(12)带有可控速旋钮和开关，其上置容器的底端与蠕动泵(14) 连接，容器的口部分别由管道与蠕动泵(10， 13)连接。
7. 根据权利要求1所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，所述的发酵 罐(1)通过阀门(2)连接高压均质机(3)。
8. 根据权利要求1或2所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，所述的 储液槽(4)由塑料或有机玻璃材料制成，其内部被分成几个可储存不同 液体的单元格，储液槽(4)带有控温仪。
9. 根据权利要求1或2所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，所述的 管道为硅胶管。
10. 根据权利要求4所述的纯化细菌磁小体的系统，其特征在于，所述的铁珠(21)的直径为4mm-6mm 。
专利摘要本实用新型公开了一种连续、规模化纯化细菌磁小体的系统，属于生物技术领域。技术方案包括发酵罐(1)，高压均质机(3)、细胞超声破碎仪(16)，高压均质机(3)与蠕动泵(6)和储液槽(4)相连接，其中与储液槽(4)相连接的管道上装有阀门(5)，蠕动泵(6)的另一端与磁性层析装置(18)的下端接口相通，磁性层析装置(18)的下端还有一个接口与蠕动泵(7)连接，蠕动泵(7)通过装有阀门(8)的管道与储液槽(4)连接，并且通过三通接头与阀门(9)连接，阀门(9)接细胞超声破碎仪(16)。本实用新型采用磁性层析装置，纯化磁小体用时短，效率高，能够实现磁小体纯化的半自动化，操作安全方便，性能稳定可靠。
文档编号C12M1/00GK201280551SQ200820123160
公开日2009年7月29日 申请日期2008年10月20日 优先权日2008年10月20日
发明者关国华, 阳 刘, 伟 姜, 颖 李, 李季伦, 田杰生, 郭芳芳 申请人:中国农业大学