编码木糖醇脱氢酶的dna的制作方法

专利名称：编码木糖醇脱氢酶的dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码具有木糖醇脱氢酶活性的多肽的DNA、核酸构建 体和包含所述DNA的载体、用该载体转化以表达所述DNA的微生物 和用于生产木糖醇脱氢酶的方法。本发明的微生物等可用于工业上有 用的步骤，例如乙醇生产步骤、生物质生产步骤和从NADPH再生 NADP+的步骤。
背景技术：
木糖是植物生物质和木材中存在的最丰富的碳水化合物，其构成 大约40%的木质纤维素物质。木糖在纤维素生产步骤中作为废品从木 聚糖水解产物形成，木聚糖是半纤维素的主要成分。渴望有效利用碳
源，应该通过发酵将木糖转化为乙醇或生物质。尤其是乙醇作为液体
燃料大量使用。
假丝酵母属(Owt//^) (Gong， C.S., Chen, L.F., Fickinger， M.C,和 Tsao, G.T., Conversion of hemicellulose carbohydrate (半纤维素碳水化 合物的转化).Adv. Biochem. Eng. 20: 93-118 (1981);和Jeffries, T.W., Utilization of xylose by bacteria, yeast and ftmgi (通过纟田菌、酵母菌和真 菌利用木糖).Adv. Biochem. Biotech. 27: 1-32 (1983》、德巴利氏酵母属 peZ^70A^ceW 、 汉逊酵母属(7fo似e"w/^ 、 克鲁维酵母属 (A7甲^函戸"、梅奇酵母属(Metec/m汰o德」、管嚢酵母属 (尸ac'/ 3Aso/ew」、4以青霉属(尸aecz7o附yces」(Wu,丄F., Lastick， S.M., Updegraff, D.M., Ethanol production from sugars derived from plantbiomass by a novel ftmgus (通过新的真菌从源自植物生物质的糖生产
乙醇).Nature 321: 887-888 (1986))、毕赤酵母属(尸/c/ /a」(Maleszka， R.
和Schneider, H.， Fermentation of D-xylose， xylitol and D-xylulose by
yeasts (由酵母菌发酵D-木糖、木糖醇和D-木酮糖).Can. J. Microbiol.
28: 360-363 (1982))等被认为是可利用戊糖(例如木糖或D-核糖)等的酵
母菌。
一般而言，在生物体中戊糖(例如木糖)向乙醇的转化由戊糖磷酸化 作用介导，所产生的磷酸化戊糖通过磷酸戊糖途径转化为乙醇。戊糖 磷酸化作用首先需要还原戊糖，同时伴随NADPH向NADP+的转化， 该反应由还原酶催化。通过戊糖还原而形成的戊糖醇随后被氧化，同 时伴随NAD+向NADH的转化。该反应由脱氬酶催化。D-戊酮糖通过 上述两步反应形成并被激酶磷酸化以形成磷酸戊糖(Bamett, J.A., The utilization of sugars by yeasts (通过酵母菌利用糖)。屋^载于Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry (碳水化合物化学和生物化学 进展)；由Tipson， R,S.和Horton, D.编辑；New York: Academic Press. 1976,第125-235页)。
酿酒酵母(S. ce"v^a—是主要用于生物乙醇生产的酵母菌，可利用 从木糖转化的木酮糖(戊酮糖)，但是该酵母菌不能发酵戊糖(Jeffries, T.W,, Emerging technology for fermenting D-xylose (用于发酵D-木糖的 新出现的技术).Trends in Biotechnology 3: 208-212 (1985))。重要的是 酿酒酵母含有编码发酵戊糖的蛋白质的基因，但不表达这些基因。
认为酿酒酵母可能通过由代谢木糖的微生物提供木糖利用途径来 实现通过酿酒酵母的戊糖发酵。对酿酒酵母进行过多次尝试以表达细 菌的木糖异构酶基因，然而，木糖发酵均以失败而告终，这大概是由 于外源基因的表达不充分(Sartny， A.V., McConaugh, B丄.,Lodo， Z., Sundstrom, J.A., Furlong, C,E.和 Hall, B.D., Expression of theEscherichia coli xylose isomerase gene in Saccharomyces cerevisiae (大 肠杆菌木糖异构酶基因在酿酒酵母中的表达).Appi. Eur. Microbiol. 53: 1996-2000 (1987); Amoer， R., Wilhelm， M.和Hollenberg, C.P.， The fermentation of xylose - an analysis of the expression of Bacillus and Actinoplanes xylose isomerase genes in yeast (木并唐发酵一芽月包才干菌属和 游动放线菌属的木糖异构酶基因在酵母菌中的表达分析).Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 351-357 (1989); Chan, E,C., Ueng, P.P.和 Chen, L.F., D-xylose fermentation to ethanol by Schizosaccharomyces pombe cloned with xylose isomerase gene (通过经木糖异构酶基因克隆 的粟酒裂殖酵母(5b/n'zc^acc/wraw;;cas pcw6e)将D-木糖发酵为乙醇). Biotech. Lett. 8: 231-234 (1986);和Chan， E.画C.， Ueng, P.P.和Chen, L.F., Environmental effects on D-xylose fermentation by Schizosaccharomyces cerevisiae (环境对酿酒酵母发酵D-木糖的影响).Appl. Biotechnol. 20: 221-232(1989))。
另一方面，尝试了使用另一酵母菌中的酵母菌基因的方法，以从 具有利用木糖能力的树干毕赤酵母(尸/c/n'a W/p/fo)分离编码木糖还原 酶和木糖醇脱氢酶的基因并在酿酒酵母中表达该基因(日本专利第 3122153号和第3193917号)。此外，尝试了对木糖还原酶基因进行分 离(Govinden, R.， Pillay, B.， van Zyl, W.H.和Pillay， D., Candida shehatae xylose reductase gene, complete cds. ("f木。合^荅WI丝酵母(Candida shehatae) 木糖还原酶基因编码序列)，基因库直接提交，登录为AF278715, (2000)) 和对来自休哈塔假丝酵母的木糖醇脱氢酶进行纯化(Yang， V.W.和 Jeffries, T.W., Purification and properties of xylitol dehydrogenase from the xylose-fermenting yeast Candida shehatae (来自发酵木糖的酵母菌休 哈塔假丝酵母的糖醇脱氬酶的純化和性质).Appl. Biochem. Biotechnol., 26: 197-206(1990))，休哈塔假丝酵母是另 一种具有利用木 糖能力的酵母菌。然而，没有一次从休哈塔假丝酵母成功分离木糖醇 脱氢酶基因。

发明内容
本发明目的是提供编码新的木糖醇脱氢酶的DNA和使用该DNA 的方法，所述DNA可用于有效将木糖转化为乙醇或生物质的技术。
发明简述
本发明具有以下特征。
(1) 编码选自以下多肽的DNA:
(a) 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列并具有木糖醇脱氢酶活性的 多肽；
(b) 包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的同一性为90%以上的氨 基酸序列并具有木糖醇脱氢酶活性的多肽；和
(c) 包含在SEQIDNO: l的氨基酸序列中置换、缺失、插入或增 加一个或多个氨基酸的氨基酸序列并具有木糖醇脱氢酶活性的多肽。
(2) (l)的DNA，其中，所述DNA包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
(3) (1)的DNA,其中所述DNA包含由于遗传密码的简并而不同于 SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的序列。
(4) (1)-(3)中任一项的DNA,其中所述DNA来自酵母菌。
(5) (4)的DNA，其中所述酵母菌为休哈塔假丝酵母。
(6) (5)的DNA,其中所述酵母菌为休哈塔假丝酵母CBS5813(NBRC1983)。
(7) 核酸构建体，其包含(l)-(6)中任一项的DNA和能够在宿主细 胞中调控所述DNA的表达的调控序列。
(8) (7)的核酸构建体，其中，所述DNA编码SEQIDNO: 1的氨基 酸序列。
(9) (8)的核酸构建体，其中，所述DNA包含SEQ ID NO: 2的核香 酸序列。
(10) (7)-(9)中任一项的核酸构建体，其中，所述调控序列来自宿主 细胞。
(11) (7)-(9)中任一项的核酸构建体，其中，所述调控序列为启动子。
(12) (11)的核酸构建体，其中，所述启动子为组成型启动子或诱导
型启动子。
(13) (11)或(12)的核酸构建体，其中所述启动子选自ADH1、ADH2、 PDC、 GAL1/10、 TDH3和PGK1启动子。
(14) 载体，其包含(l)-(6)中任一项的DNA或(7)-(13)中任一项的核
酸构建体。
(15) (14))的载体，其中，所述载体为质粒。
(16) 微生物，其包含(l)-(6)中任一项的DNA、 (7)-(13)中任一项的 核酸构建体或(14)或(15)的载体并因此而表达具有木糖醇脱氢酶活性的多肽。
(17) (16))的微生物，其中，所述微生物为酵母菌或细菌。
(18) (17))的微生物，其中所述酵母菌或细菌选自以下酵母菌属和细 菌属，所述酵母菌属包括酿酒酵母属GSaccAaraw;;ce力、裂殖酵母属 ('Sc/2/zo5acc/^簡少c^y)、许旺酵母属(/S^而""/画yce》、克鲁维酵母属、 毕赤酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、德巴利氏酵母属、梅奇酵母
属、管嚢酵母属或拟青霉属，所述细菌属包括发酵单胞菌属
(々附0歸""力。
(19) (18)的微生物，其中，所述微生物为酿酒酵母G^cc/ araw少c^
(20) (18)的微生物，其中，所述微生物为粟酒裂殖酵母
(21) (16)-(20)中任一项的微生物，其中，将所述DNA或所述核酸 构建体掺入到宿主微生物的基因组中。
(22) 用于生产木糖醇脱氢酶的方法，其包括以下步骤
(a) 在培养基中培养(16)-(21)中任一项的微生物；和
(b) 从所述微生物或所述培养基收集具有木糖醇脱氢酶活性的产物。
(23) (22)的方法，其进一步包括选择适用于木酮糖发酵的微生物的 步骤。
(24) 使用(16)-(21)中任一项的微生物生产乙醇的方法。
(25)载体，其包含含有(l)的DNA的木糖醇脱氩酶基因表达盒、 木糖还原酶基因表达盒和木酮糖激酶基因表达盒。
本发明提供编码木糖醇脱氢酶(涉及木酮糖发酵)的DNA、重组表 达所述DNA的微生物(例如酵母菌)等。所述DNA和所述微生物可用 于生物乙醇生产、生物质生产、食品工业等。
附图简述


图1显示用于构建包含来自休哈塔假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因 的表达载体的程序概要。
实施发明的最佳方式
本发明提供编码具有木糖醇脱氢酶活性的多肽的DNA。
木糖醇脱氢酶(EC1丄1.9)是催化以木糖作为原料的木酮糖发酵的 部分过程的酶。该过程的上半程是还原性地由木糖形成木糖醇的反 应。该还原性反应由木糖还原酶催化。该过程的后半程是氧化性地由 木糖醇形成木酮糖的反应。该氧化性反应由木糖醇脱氢酶催化。木糖 醇脱氢酶活性依赖于NAD(P)+。业已尝试过将木糖还原酶和木糖醇脱 氢酶二者的基因引入酵母菌(例如酿酒酵母)细胞，藉此改进生产乙醇
的能力(例如美国专利第6，582,944号)。
本发明DNA为编码选自以下的多肽的DNA:
(a) 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列并具有木糖醇脱氢酶活性的 多肽；
(b) 包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的同一性为90%以上的氨基酸序列并具有木糖醇脱氢酶活性的多肽；和
(c)包含在SEQIDNO: l的氨基酸序列中置换、缺失、插入或增 加一个或多个氨基酸的氨基酸序列并具有木糖醇脱氬酶活性的多肽。
编码SEQ ID NO: 1的多肽的DNA来自酵母菌，具体而言，来自 休哈塔假丝酵母，尤其是休哈塔假丝酵母CBS5813 (NBRC1983)。
在本发明中，多肽可仅由SEQIDNO: 1的氨基酸序列组成，或可 包含所述氨基酸序列以及例如在多肽的氨基末端或羧基末端的附加 序列。这样的附加氨基酸序列为例如提供成熟蛋白质的细胞外分泌的 信号肽序列。
或者，所述多肽还包含与SEQIDNO: 1的氨基酸序列的同一性为 90%以上的氨基酸序列的变体、同系物、类似物等。在本文中，术语"同 一性，，意指在引入或不引入缺口的氨基酸序列比对中，完全匹配的氨基 酸数量占氨基酸总数的比例(％)。这样的多肽通常包含在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中置换、缺失、插入或增加一个或多个氨基酸的氨基 酸序列，该序列具有与所述氨基酸序列优选92%以上或93%以上、更 优选95%以上或97%以上、甚至更优选98%以上或99%以上的序列同
一性。
具有同一性为90%以上的序列的蛋白质可例如通过访问本领域已 知的数据库(GenBank,EMBL等)来搜索。例如，本领域已知的运算法 则例如BLAST或FASTA可用作搜索系统。用于这样的搜索的具体操 4乍禾呈序阐述于例长口"Introduction to GenomeNet Databases(GenomeNet 数据库介绍"，第2版，由Toshihisa Takagi和Minoru Kanehisa编辑 (1998), KYORITSU SHUPPAN CO.， LTD (东京，日本)。
或者，多肽还包括变体，该变体包含在SEQIDNO: 1的氨基酸序列中置换、缺失、插入或增加一个或多个氨基酸的氨基酸序列。在本
文中，术语"多个"意指大约为IO或更小的整数,例如2-10、 2-9、 2-8、
2腸7、 2-6、 2-5、 2-4或2-3的整数。
只要是新的并具有木糖醇脱氢酶活性，置换、缺失、插入或增加 了氨基酸的变体就包括在本发明范围内。
由本发明DNA编码的多肽的氨基酸变异优选在不对如下位点产生 不良影响的位点处的突变，即在SEQIDNO: 1的氨基酸序列中与木糖 醇脱氢酶活性相关的催化结构域或者与辅酶起作用的辅酶结合域的 三维结构(或构象)。然而，除非显著降低酶活性，否则甚至可在催化 结构域或辅酶结合域引入突变。在SEQIDNO: 1的氨基酸序列中构成 辅酶结合域的氨基酸的实例包括Asp2Q7、 Ile208、 Phe，、 Asn211和Lys212。 在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中构成催化结构域的氨基酸的实例包 括Cys41、 His66、 Glu67、 Ser96、 Ser99、 Tyi^和Cysn°。引入突变提供 例如活性比野生型更高的变体，例如1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以 上、3倍以上、5倍以上、7倍以上、IO倍以上、15倍以上、20倍以 上、30倍以上、40倍以上或50倍以上。或者，引入突变还可改进酶 的热稳定性。变异的实例包括在Watanabe, S.等，J. Biol. Chem. 280 (11): 10340-10349 (2005)中阐述的变异。
特别地，氨基酸之间的置换可为在结构或化学性质相似的氨基酸 之间的保守置换，或可为在上述性质不同的氨基酸之间的非保守置 换。结构或化学性质相似的氨基酸可如下分类
疏水氨基酸基团，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、曱
辟u氨酸和脯氨酸。
极性氨基酸基团，包括丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。
芳香氨基酸基团，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
酸性氨基酸基团，包括谷氨酸和天冬氨酸。
碱性氨基酸基团，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
本发明DNA包含具有编码任何上述多肽的核苷酸序列的单链或双 链DNA。本发明DNA包括例如天然DNA、 cDNA、化学合成DNA、 通过聚合酶链反应(PCR)获得的DNA和包含两个或多个上述DNA的 组合的DNA。
具体而言，本发明DNA为包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的 DNA。此外，本发明另一DNA为包含如下序列的DNA:因遗传密码 简并而获得的SEQIDNO:2的核苷酸序列的变体序列。例如，与野生 型来源生物物种不同的生物物种的最适密码子可基于遗传密码简并 来选择并包括在DNA中。变体序列意指包含变异的序列，通过该变 异得到的核苦酸序列不同于原始核苷酸序列，尽管它们编码同样的氨 基酸序列。
可用本领域已知技术(例如DNA重组、PCR、杂交、克隆和定点突 变技术)来制备本发明DNA。这样的技术详述于以下文献中例如 Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆实验 手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989和A歸bel等，Current Protocols in Molecular Biology (现行分子生物学实验方案)，John Wiley & Sons, 1998,它们可用于制备本发明DNA。
首先，例如通过在含有蛋白胨、葡萄糖、酵母菌提取物等的培养基(例如YPD或YM培养基)中、于约25。C摇瓶培养来生长休哈塔假 丝酵母，接着进行基因组DNA抽提。基于例如SEQIDNO:2的核香 酸序列设计并合成19-25个碱基长的正向和反向引物。这些引物用于 在耐热聚合酶和Mg"的存在下，以目的基因组DNA作为模板进行 PCR扩增。PCR条件包括例如在94。C处理1分钟，随后进行大约35 个扩增循环，每一循环包括94°C30秒(变性)、55°C30秒(退火)和72 。C3分钟(延长反应)，接着在72。C最后处理7分钟。可通过琼脂糖凝 胶电泳来确证目的DNA片段的成功扩增。
将扩增的目的DNA片段在根据需要而引入合适的限制性位点后， 插入到载体(例如质粒)中，进而将该载体引入到合适的宿主细胞以克 隆所迷DNA片段。载体可适当地含有启动子、复制起始点、核糖体 结合位点或Shine-Dalgarno序列、终止子、多克隆位点、多聚腺苷酸 信号等。用于例如细菌的原核生物的载体或用于例如酵母菌或真菌的 真核生物的载体可用作所述载体。由于各种载体可市购得到，可选择 合适的载体来使用。此外，宿主细胞实例包括细菌(例如大肠杆菌(E co/仍和酵母菌。
定点突变技术包含合成含有变异位点的引物并使用该引物和作为 模板的含有目的DNA的载体来实施PCR。用该技术可制备包含SEQ ID NO: 2的核苦酸序列的DNA变体。
本发明进一步提供包含上述DNA和能够调控所述DNA的表达的 调控序列的核酸构建体。
在本发明中，调控序列为能够调控本发明DNA的表达的核苷酸序 列，包括例如启动子、增强子、多聚腺苷酸信号、复制起始点、核糖 体结合位点或Shine-Dalgarno序列和终止子。调控序列优选含有启动 子的序列或含有终止子的序列。
根据本发明实施方案，调控序列来自宿主细胞。尤其是当使如下 基因组序列位于与本发明异源DNA侧翼以制备载体时，可通过同源 重组将本发明DNA序列掺入到该酵母菌细胞基因组中，所述基因组 序列是原本由酵母菌作为宿主携带的编码木糖醇脱氢酶的基因的含 有5'_和3'-调控序列的基因组序列。
启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。启动子不受特别限制， 可选自例如ADH1、 ADH2、 PDC、 GAL1/10、 TDH3和PGK1。根据 所选择的启动子(例如所选择的强启动子)，本发明DNA可在超过其起 源宿主微生物中的天然表达水平的表达水平表达。
载体的实例包括质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒、BAC、 YAC和病 毒。在优选实施方案中，所述载体为质粒。所述载体适于在所期望的 宿主微生物中复制，因此可含有经适当选择的例如启动子、增强子、 多聚腺苷酸信号、复制起始点、核糖体结合位点或Shine-Dalgarno序 列和终止子。此外，可将选择性标记例如药物耐受基因(例如氨千青霉 素耐受基因)引入到所述载体中。
本发明还包括不仅包含木糖醇脱氢酶基因表达盒而且任选包含木 酮糖激酶基因表达盒和/或木糖还原酶基因表达盒的载体。木糖醇脱氢 酶基因可为例如编码SEQIDNO: 1的多肽的DNA序列或编码上述多 肽的变体、同系物或类似物的DNA序列。木酮糖激酶基因可为例如 编码SEQ ID NO: 26的多肽的DNA序列或编码上述多肽的变体、同 系物或类似物的DNA序列。木糖还原酶基因可为例如编码SEQ ID NO: 24的多肽的DNA序列或编码上述多肽的变体、同系物或类似物的DNA序列。
在本发明中，"表达盒"为通过将目的基因序列与启动子和终止子以 及用于在宿主中的基因表达所需要的其它调控序列可操作地连接而 制备的核酸构建体。将构建体引入宿主，藉此使宿主表达目的基因。 在本发明中，术语"可操作地连接"意指将调控序列与目的基因以使它 们能够按所期望的方式作用于目的基因表达的方式连接。各基因的表 达可为连续的或同时的。这样的本发明载体的构建实例示于图1中。 该载体可有效地用于利用木糖等作为原料的乙醇生产中。
本发明进一步提供包含任何上述DNA、任何上述核酸构建体或任 何上述载体的微生物，因此微生物表达具有木糖醇脱氢酶活性的多 肽。
将常规方法例如转化或转导用于将载体引入到微生物细胞中。这 样的方法包括例如磷酸钙法、电穿孔法、原生质体法和球形体法。
微生物的实例包括但不限于酵母菌、真菌和细菌。优选微生物 选自以下酵母菌属和细菌属，所述酵母菌属包括酿酒酵母属、裂殖酵 母属、许旺酵母属，克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、假丝 酵母属、德巴利氏酵母属、梅奇酵母属、管嚢酵母属或拟青霉属，所 述细菌属包括发酵单胞菌属。优选微生物为酿酒酵母或粟酒裂殖酵
母。
对于微生物，可将DNA或核酸构建体掺入到宿主微生物基因组中。 可通过将来自宿主微生物基因组的序列连接至所述DNA或所述核酸 构建体的上游或下游来达成基因组的掺入。适于将核苷酸序列引入宿 主细胞基因组的方法为本领域技术人员所熟知。载体也可在细胞中与 宿主细胞基因组分别存在。在这种情况下，所述载体应该能够自主复制。
本发明微生物可进一步含有编码介导由木糖向乙醇的转化过程的另一种酶的DNA。所述另一种酶为例如木糖还原酶或木酮糖激酶，优选木糖还原酶。这样的酶可来源于与本发明木糖醇脱氢酶的来源相同的微生物，或可来源于与其来源不同的微生物。此外，为了提高酶活性或热稳定可对微生物进行突变处理(例如用诸如UV射线、Y射线或电离子束的高能射线辐照微生物或用例如亚硝基胍、亚硝基脲或亚硝酸的化学诱变剂处理)。
本发明进一步提供用于生产木糖醇脱氢酶的方法。该方法包括如下步骤(a)在培养基中培养任何上述微生物；和(b)从微生物或培养基收集具有木糖醇脱氢酶活性的产物。例如，可通过超声破碎微生物细胞实施从微生物收集产物。从培养基中收集产物需要将多肽在微生物细胞中翻译，然后将该多肽分泌到细胞外。为此目的，例如，所述多肽可表达为在其上连接有氨基末端分泌信号。
可从适于微生物类型的条件中任意选择微生物培养条件。培养基通常含有碳源、氮源和无机盐。碳源的实例包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉和其它糖。氮源的实例包括含氮无机盐(例如硫酸铵和硝酸铵)、蛋白胨、麦芽提取物和酵母菌提取物。无机盐的实例包括碱金属盐、碱土金属盐和铁族金属盐。培养方式包括静态培养、摇瓶培养、通气培养、连续培养等。培养温度为约15-60°C，通常约25-40。C,但不限于该范围。
例如，可通过在340 nm处于35。C测量NAD(P)+还原来测量所形成的酶的活性(Rizzi, M.等，J. Ferment. Bioeng. 67: 20-24 (1989))。标准检测混合物为含有溶于50 mM Tris-HCl (pH 9.0)中的50 mM MgCl2和300 mM木糖醇的溶液。通过加入100 //1 20 mM NAD(P)+以1.0 ml的终体积开始反应。酶活性可例如用1个单位(即，每分钟产生1 //mol
NAD(P)H的酶活性)来表示。
可联合使用蛋白质化学的通用方法来纯化木糖醇脱氢酶。这样的方法的实例包括但不限于凝胶过滤、离子交换色语、亲合色谱、疏水作用色谱、HPLC、电泳、等电聚焦、盐析、硫酸铵分级分离、透析和超滤。
根据本发明实施方案，所述方法可进一步包括选择适于有效率的木酮糖发酵的微生物的步骤。结果，可获得更有效率地催化木酮糖发酵的多肽。可例如通过如下方法评估木酮糖发酵的效率将微生物在含木糖或木糖醇的培养基中培养一段时间，然后测量培养基中含有的木糖的浓度。
本发明进一 步提供用于利用任何上述微生物生产乙醇的方法。可将微生物固定在允许微生物生长的固相上。这样的固相的实例包括但不限于聚合物，例如聚氨基曱酸酯及其衍生物；和多糖，例如藻酸盐和角叉胶。
更优选的用于乙醇生产的碳水化合物为木糖。因此，能够发酵木糖的酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和/或发酵单胞菌属菌抹对于乙醇生产非常有优势。本发明酵母菌菌抹具有发酵浓缩碳水化合物溶液、的能力、高水平的乙醇耐受性和产生高浓度乙醇的能力。这些酵母菌菌林具有用于重复循环的高细胞存活力并表现出pH和温度耐受性。在木糖生产步骤中，木糖作为废品从木聚糖水解产物形成。木聚糖是半纤维素的主要成分。因此，将木糖用于生产乙醇和/或生物质非常有利。此外，在本发明微生物中引入NAD(P)H依赖性木糖还原酶基因促进木糖向木酮糖的转化。在这种情况下，对于还原性反应，该木糖还原酶尤其适于例如在用于氨基酸生产的生物反应器中携带或再循环(从NADPH到NADP+)相应的辅酶。实施例
本发明将参照以下实施例来进一步阐述。然而，本发明范围不限于这些实施例。
实施例l:来自休哈塔假丝酵母木糖醇脱氢酶基因的分离和测序
染色体DNA的分离
休哈塔假丝酵母NBRC1983 (CBS5813)购自日本产品评估技术基础机构生物技术部门。酿酒酵母ATCC60715购自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)。这些酵母菌通过在YPD培养基(2%蛋白胨、1%酵母菌提取物和2%葡萄糖)中、于25。C摇瓶培养来分别生长直到静止期。采用Dr. GenTLE (Takara Bio Inc., Otsu-shi,Shiga,日本)并按照其中随附的方案从所得培养物分离染色体DNA。
休哈塔假丝酵母木糖醇脱氢酶基因核苷酸序列的测定
从核酸序列数据库GenBank获得树干毕赤酵母和热带假丝酵母(0 "Ac/a /ra/ Zc"fc)木糖醇脱氢酶的DNA序列(登记号分别为DD278642和DQ201637)，用基因分析软件Genetyx (Genetyx Corp.,东京，日本)对其进行序列比较以获得来自高度相似域的SEQ ID NO: 3和4的序列。将这两个序列用作引物来实施PCR,其使用休哈塔假丝酵母NBRC983染色体DNA作为模板、使用TaKaRa Ex Taq (TakaraBio Inc.)并使用基因Amp PCR系统9700 (Applied Biosystems,日本)。反应程序如下94。Cl分钟、(94。C30秒、55°C30秒和72°C3分钟)x35个循环和72°C7分钟。在1%琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳。结果，观察到扩增的DNA片段为大约900 bp。
用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corp.,东京，日本)将由此获得的片段进行克隆。从所获得的转化抹收集质粒，用BigDye Terminatorv3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems Japan,东京，日本)对其进行测序反应。使用DNA遗传分析仪3100 (Applied Biosystems Japan,东京，日本)测定核苦酸序列。从所得到的核苷酸序列获得SEQ ID NO: 5和6的序列。
用各种限制酶切割休哈塔假丝酵母NBRC1983染色体DNA并自我连接，通过乙醇沉淀收集自我连接产物。实施使用该产物作为模板、使用SEQ ID NO: 5和6的序列作为引物并使用TaKaRa LA Taq(Takara Bio Inc.)的PCR。反应程序如下94。Cl分钟、(98°C20秒和68°C 10分钟)x30个循环和72°C7分钟。在1%琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳。结果，观察到扩增的DNA片段的大小为约2300 bp。
将由此获得的片段用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corp.,东京，日本)进行克隆。从所获得的转化抹收集质粒，用BigDye Terminatorv3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems Japan,东京，日本)进行测序反应。用DNA遗传分析仪3100 (Applied Biosystems Japan,东京，曰本)测定核苷酸序列。
将获得的核苷酸序列与先前获得的对应于木糖醇脱氢酶基因的部分序列的约900bp的核苷酸序列装配，以获得休哈塔假丝酵母木糖醇脱氢酶基因编码区的核苷酸序列。结果示于SEQ ID NO: 2中。
实施例2:构建木糖醇脱氢酶表达载体并将其引入酵母菌
按图1所示程序构建木糖醇脱氢酶表达载体。下文中将详述该构建。在该背景中，PCR条件如下所述94。Cl分钟、(94。C30秒、55°C30秒和72°C3分钟)x35个循环和72°C7分钟。
用Kpnl和Sacl消4匕pBluescript II KS+ (Stratagene)，用Chroma SpinTE100 (Invitrogen Corp.)除去较短的片段。另一方面，通过在95。C加热5分钟使SEQIDNO:7和8的寡聚DNA变性，然后室温中静置以自动退火。将该退火产物克隆到pBluescript II KS+的Kpnl-Sacl位点，以构建包含被插入到pBluescript II KS+的Kpnl和Sacl位点之间的Nhel和Spel位点的载体pBSNS。
基于SEQ ID NO: 2的序列制备用于扩增休哈塔假丝酵母木糖醇脱氢酶基因的引物(SEQ ID NO: 17和18)。基于树干毕赤酵母的基因组序列制备SEQ ID NO: 6-16， 19和20的寡聚DNA。
如下获得TDH3启动子片段(PsTDH3p):将SEQ ID NO: 9和IO的寡聚DNA组合和SEQ ID NO: 11和12的寡聚DNA组合分别用作引物，以实施使用树干毕赤酵母染色体DNA作为模板PCR。用凝胶过滤柱从分别获得的产物除去引物。将这两个产物混合并在使用SEQ IDNO: 9和12的寡聚DNA作为引物的PCR中用作模板，以获得TDH3启动子片^:。获得的启动子片段在5'端具有Nhel位点，在该序列的3'端按照BamHI和Apal的顺序具有所述位点，而且，在启动子序列内没有Nhel。
通过使用SEQ ID NO: 13和14的寡聚DNA的组合作为引物并使用树干毕赤酵母染色体DNA作为模板的PCR获得TDH3终止子片段(PsTDH3t)。所获得的终止子片段在该序列的5'端具有按照BamHI和Apal的顺序具有所述位点，并且在3'端具有Spel位点。
将这些片段设计为使TDH3启动子片段的3'端与TDH3终止子的5'端匹配。将这两个片段混合并在使用SEQ ID NO: 9和14的寡聚DNA作为引物的PCR中用作模板，以制备包含经由BamHI和Apal位点连接的TDH3启动子和TDH3终止子的片段。经由5'端的Nhel位点和3'端的SpeI位点将所获得的片段插入pBSNS的Nhel-Spel位点，以构建pPsExpBS。
如下获得不含原本存在于序列中的Xbal位点的树干毕赤酵母木酮糖激酶基因片段(PsXYL3; SEQ ID NO: 25):将SEQ ID NO: 19和20的寡聚DNA组合和SEQ ID NO: 21和22的寡聚DNA组合分别用作引物，以实施使用树干毕赤酵母染色体DNA作为模板的PCR。用凝胶过滤柱从分别获得的产物除去引物。将这两个产物混合并在使用SEQ ID NO: 19和22的寡聚DNA作为引物的PCR中用作模板，以获得树干毕赤酵母木酮糖激酶基因片段(PsXYL3; SEQ ID NO: 25)。从所获得的DNA片段的核苷酸序列翻译的木酮糖激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 26。
所获得的各基因片段CsXYL2、 PsXYLl和PsXYL3在5'端具有BamHI位点，而在3'端具有Apal位点。将各个基因片段经由这些限制性位点插入到载体pPsExpBS的BamHI-ApaI位点。将所获得的载体分别命名为CsXYL2ExpBS、 PsXYLlExpBS和PsXYL3ExpBS。
将CsXYL2ExpBS用Spel消化，并随后进行去磷酸化反应。将从PsXYL3ExpBS制备的Nhel-Spel片段(含有PsXYL3表达盒)连接至经消化的CsXYL2ExpBS的Spel位点，以获得包含以相同方向插入到CsXYL2表达盒3'端的PsXYL3表达盒的质粒CPxBS。然后，将CPxBS用SpeI消化，并随后进行去磷酸化反应。将从PsXYLlExpBS制备的 Nhel-Spel片段(含有PsXYLl表达盒)连接至经消化的CPxBS的Spel 位点，以获得包含按如下顺序以相同方向插入的CsXYL2表达盒、 PsXYL3表达盒和PsXYLl表达盒的质粒CPPxBS。
用Nhel和Spel消化CPPxBS，纯化含有CsXYL2表达盒、PsXYL3 表达盒和PsXYLl表达盒的Nhel-Spel片段，将其插入到pYES2的Spel 位点(Invitrogen Corp.)，以获得CPPxYES。
按标准方法用葡萄酒酵母Kyokai No, 3 (日本酿造协会)获得ura3 变体菌林KY1094。通过锂法将CPPxYES或pYES2引入KY1094。结 果，获得包含载体(CPPxYES)的酿酒酵母转化抹，以及包含载体pYES2 的酿酒酵母转化抹(对照)，所述载体(CPPxYES)包含按如下顺序以相 同方向插入的CsXYL2表达盒、PsXYL3表达盒和PsXYLl表达盒， 所述载体pYES2未插入上述表达盒。
实施例3:木糖醇脱氬酶活性的测量
如下所示对获得的酿酒酵母转化林进行木糖醇脱氢酶活性测量。
为了预培养，将菌林接种到含2 mL SD-ura (2%葡萄糖)的各测试管 中，并于25。C摇瓶培养24小时。将含菌抹的200 预培养液接种到 含5 mL SD-ura (2%葡萄糖)的各测试管中，并于25°C以120 rpm进行 主培养24小时。培养后，将酵母菌离心收集，用lOOmM磷酸钠緩冲 液(pH7.0)、1 mM EDTA和5mM巯基乙醇洗涤，然后重新悬浮于1 mL 同样的緩冲液中。向该酵母菌混悬液中加入1 g212-300微米的玻璃珠 (SIGMA)，并用MIX-TOWER A14 (TAIYO)于4。C破碎酵母菌15分钟。 在4。C以120 rpm离心5分钟后，收集上清液，用作粗酶溶液。通过 Bradford法测量该粗酶溶液的蛋白质浓度。用牛血清白蛋白作为标准 蛋白。
于30。C在含有100 mM Tris-HCl (pH 8.0)、 5 mM氯化镁、3 mM NAD+、 100 mM木糖醇和5Q/。 (v/v)粗酶溶液的反应系统中反应10分 钟。在340 nm波长处测量吸光率。用NADH制备校准曲线，1单位 酶活性计算为每mg蛋白1分钟产生1 //molNADH的酶水平(比活)。 结果如下所示。在本文中，数值以9份结果的平均数土标准偏差来表 示。 [表l〗
菌抹比活 (戶ol/min'mg蛋白质)
CPP x YES1.878 ±0.166
pYES0.000 ± 0扁
仅在如下菌抹中检测到酶活性，所述菌抹经携带包含休哈塔假丝 酵母木糖醇脱氬酶基因的表达盒的载体转化。这证明由休哈塔假丝酵 母木糖醇脱氬酶基因表达的蛋白质具有所期望的活性。
工业上的可应用性
本发明DNA和微生物可用于生物乙醇生产、生物质生产、食品工业等。
序列表的自由文本
SEQIDNO:3、 4和7-22:引物
权利要求
1.编码选自以下多肽的DNA(a)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列并具有木糖醇脱氢酶活性的多肽；(b)包含与SEQ ID NO1的氨基酸序列的同一性为90％以上的氨基酸序列并具有木糖醇脱氢酶活性的多肽；和(c)包含在SEQ ID NO1的氨基酸序列中置换、缺失、插入或增加一个或多个氨基酸的氨基酸序列并具有木糖醇脱氢酶活性的多肽。
2. 权利要求1的DNA,其中，所述DNA包含SEQ ID NO: 2的 核苦酸序列。
3. 权利要求1的DNA,其中，所述DNA包含由于遗传密码的 简并而不同于SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的序列。
4. 权利要求1-3中任一项的DNA，其中，所述DNA来自酵母菌。
5. 权利要求4的DNA,其中，所述酵母菌为休哈塔假丝酵母
6. 权利要求5的DNA，其中，所述酵母菌为休哈塔假丝酵母 CBS5813(NBRC1983)。
7. 核酸构建体，其包含权利要求l-6任一项的DNA和能够在宿 主细胞中调控所述DNA的表达的调控序列。
8. 权利要求7的核酸构建体，其中，所述DNA编码SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
9. 权利要求8的核酸构建体，其中，所述DNA包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
10. 权利要求7-9中任一项的核酸构建体，其中，所述调控序列 来自宿主细胞。
11. 权利要求7-9中任一项的核酸构建体，其中，所述调控序列 为启动子。
12. 权利要求11的核酸构建体，其中，所述启动子为组成型启 动子或诱导型启动子。
13. 权利要求11或12的核酸构建体，其中，所述启动子选自 ADH1、 ADH2、 PDC、 GAL1/10、 TDH3和PGK1启动子。
14. 载体，其包含权利要求1-6中任一项的DNA或权利要求7-13 中任一项的核酸构建体。
15. 权利要求14的载体，其中，所述载体为质粒。
16. 微生物，其包含权利要求1-6中任一项的DNA、权利要求 7-13中任一项的核酸构建体或权利要求14或15的载体，因此所述微 生物表达具有木糖醇脱氢酶活性的多肽。
17. 权利要求16的微生物，其中，所述微生物为酵母菌或细菌。
18. 权利要求17的微生物，其中，所述酵母菌或细菌选自以下 酵母菌属和细菌属，所述酵母菌属包括酿酒酵母属(SaccAaromFM)、 裂殖酵母属(Sc/n'zc^acc/wrawycas)、许旺酵母属OSc/zwa""z'o附少cas)、克 鲁维酵母属(幻w"eraw^yce力、毕赤酵母属(尸z'c/n'a)、汉逊酵母属 (//a/we"w/fl)、假丝酵母属(Caw/Wa)、德巴利氏酵母属(Z)eZ o^ow;/c")、 梅奇酵母属(Metec/z"汰ovWa)、管嚢酵母属(尸ac/^o/e")或拟青霉属 (尸ae"7omyce力，所述细菌属包括发酵单胞菌属(Z少momo"w)。
19. 权利要求18的微生物，其中，所述微生物为酿酒酵母
20.权利要求18的微生物，其中，所述微生物为粟酒裂殖酵母
21. 权利要求16-20中任一项的微生物，其中，将所述DNA或 所述核酸构建体掺入到所述宿主微生物的基因组中。
22. 用于生产木糖.醇脱氢酶的方法，其包括以下步骤(a) 在培养基中培养权利要求16-21中任一项的微生物；和(b) 从所述微生物或所述培养基收集具有木糖醇脱氢酶活性的产
23. 权利要求22的方法，其进一步包括选择适于木酮糖发酵的 微生物的步骤。
24. 使用权利要求16-21中任一项的微生物生产乙醇的方法。
25. 载体，其包含含有权利要求1的DNA的木糖醇脱氢酶基因 表达盒、木糖还原酶基因表达盒和木酮糖激酶基因表达盒。
全文摘要
本发明涉及编码新的木糖醇脱氢酶的DNA和该DNA的应用。具体而言，本发明获得了来自休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的木糖醇脱氢酶基因的核酸序列，并将该基因引入到宿主细胞，藉此生产能够利用木糖的微生物。
文档编号C12N15/09GK101652477SQ20088001130
公开日2010年2月17日 申请日期2008年2月1日 优先权日2007年2月2日
发明者小林统, 玉川英幸 申请人:麒麟控股株式会社