用于产生1,2-丙二醇的代谢工程改造的微生物的制作方法

专利名称：：用于产生1,2-丙二醇的代谢工程改造的微生物的制作方法用于产生1，2-丙二醇的代谢工程改造的微生物本发明涉及经代谢工程改造的微生物及其用于制备1,2-丙二醇的用途。1,2-丙二醇或丙二醇，一种C3二醇，是广泛使用的化学品。它是用于航空器的不饱和聚酯树脂、液体洗涤剂、冷却剂、抗冻和除冰流体的组分。自从1993-1994年以来，丙二醇作为乙烯衍生物的替代物已经越来越多地被使用，所述乙烯衍生物被认为比丙烯衍生物毒性更强。目前使用消耗大量水的环氧丙烷水合工艺通过化学手段产生1,2-丙二醇。环氧丙烷可以由两种方法中的任一种产生，一种使用表氯醇(epichlorhydrin),另一种使用氢过氧化物。两条途径都使用高毒性物质。此外，氢过氧化物途径产生副产物如叔丁醇和1-苯基乙醇。为使丙烯生产成为有利可图的，必须使用这些副产物。化学途径通常产生消旋的1，2-丙二醇，而两种立体异构体(W)l，2-丙二醇和(5)l,2-丙二醇中每种对于某些应用是感兴趣的。用于产生1,2-丙二醇的化学方法的缺点使生物合成成为具有吸引力的替代方法。已表征了两种途径用于通过微生物由糖天然产生1，2-丙二醇。在第一个途径中，将6-脱氧糖(例如L-鼠李糖或L-岩藻糖)裂解成磷酸二羟基丙酮和(5)-乳醛，其能进一步还原至(。-l，2-丙二醇(Badia等，1985)。此途径在大肠杆菌中有功能，但是因为脱氧己糖的高成本，不能得到经济上可行的工艺。第二个途径是通过糖酵解途径，然后是丙酮醛途径来代谢普通糖(例如葡萄糖或木糖)。将磷酸二羟基丙酮转化成丙酮醛，后者可以还原成乳醛或丙酮醇。然后这两个化合物可以进行第二次还原反应，得到1，2-丙二醇。此途径由(R)-1,2-丙二醇的天然生产菌使用，如楔形梭菌(C7oWnWwws//ze"o^e力和热/解4唐热厌氧库干菌(77zermo"w"era6"cfer^ze/7wos"cc/"ra/yWcMW)。已经7吏用楔形梭菌产生1，2-丙二醇，在磷酸盐受限条件下效价(titer)为1.58g/1(TmnDin和Gottschalk，1985)。也已经研究热解糖热厌氧杆菌用于产生1,2-丙二醇(Cameron和Cooney，1986，Sanchez-Rivera等，1987)。获得的最佳性能是9g/1的效价和0.2g/g由葡萄糖的得率。然而，用这些生物获得的性能的改进可能由于缺少可用的遗传工具而受到限制。现有技术Cameron等(1998)研究了大肠杆菌作为平台用于将糖转化为1，2-丙二醇的代谢工程的用途。他们的理论分析显示实际产物得率的上限(考虑质量平衡和生长所需能量的产生)取决于培养条件而显著不同。在厌氧条件下，将产生乙酸(acetate)作为副产物，以循环还原辅因子，而最佳得率限制在1摩尔1，2-丙二醇每摩尔葡萄糖(0.42g/g)。在需氧条件下，使用氧作为终端电子受体通过呼吸链确保辅因子的循环，并且可能在没有副产物产生的情况下产生1，2-丙二醇。在这些条件下，得率能到达最高1.42mol/mo1(0.6g/g)。考虑1,2-丙二醇的最大效价量，Cameron等讨论了其对于产物和副产物毒性的依赖性。1,2-丙二醇的毒性显著低于1,3-丙二醇，而且大肠杆菌在100g/11,2-丙二醇时表现出0.5h-'的残余生长速率。对生长的抑制更可能是由于副产物乙酸，已知其高度抑制生长。开发以高效价和得率产生1,2-丙二醇的厌氧工艺将解决乙酸问题。已经提出了将乙酸转化成抑制性较低而且容易原位去除的丙酮(WO2005/073364)。已纟至由Cameron小纟且(Cameron等，1998，Altaras牙口Cameron,1999,Altaras和Cameron,2000)和Bennett小组(Huang等，1999,Berrios-Rivera等，2003)进行了几项大肠杆菌遗传修饰的研究，以获得使用简单碳源的1,2-丙二醇产生菌。这些研究一方面依赖于从磷酸二羟基丙酮到1,2-丙二醇的途径中一种或几种酶活性的表达，另一方面依赖于去除宿主菌林中的NADH和碳的消耗途径。由Cameron小组获得的最佳结果是在厌氧摇瓶培养中产生1.4g/11,2-丙二醇，得率为0.2g/g消耗的葡萄糖。当外推至厌氧补料批式发酵罐时，产生4.5g/11，2-丙二醇，由葡萄糖的得率为0.19g/g，与Cameron等的理论估计相差较大。已经通过在缺乏编码乳酸脱氬酶的基因(MzA)的菌林中过表达大肠杆菌的丙酮醛合酶基因(附g》、大肠杆菌的甘油脱氢酶基因(gWA)和大肠杆菌的1，2-丙二醇氧化还原酶基因(/k^O)而获得了这些性能。在专利US6,087,140,US6，303，352和WO98/37204中还描述了用同样的方法获得但效价和得率更低的结果。Bennett小组还使用缺乏W/zA的大肠杆菌宿主菌林过表达来自丙酮丁醇梭菌的柳^基因和来自大肠杆菌的gWA基因。在厌氧条件下的摇瓶培养得到1.3g/1的效价和0.12g/g的得率，而微需氧培养得到1.4g/1的效价和0.13g/g的得率。在这个阶段，所有这些结果都未能优于用菌种热解糖热厌氧杆菌(7:Z/7em7aacc/2ara/j^CMW)获4寻的结果。葡萄糖在大肠杆菌中通过糖酵解途径分解代谢，在裂解1,6二磷酸果糖后，生成两个磷酸丙糖分子，磷酸二羟基丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛。这两个磷酸丙糖分子可以通过磷酸丙糖异构酶活性而互相转化。通常认为DHAP转化成GA3P，并且来自葡萄糖的两个GA3P进一步分解代谢。3—磷酸甘油醛脱氢酶，也称作GAPDH，是葡萄糖变为丙酮酸的糖酵解转化中涉及的关键酶之一。GAPDH催化下述反应3-磷酸甘油醛+磷酸+NAD+—1,3-二磷酸甘油酸+NADH+H-编码这个酶的基因于1983年在大肠杆菌中克隆(Branlant等，Gene，1983)并命名为"g，"。后来鉴定了编码具有相同酶活性的产物的另一个基因并命名为g，5(Alefounder等，Microbiol.，1987)。缺失和gapi5基因的大肠杆菌菌抹的表征表明，虽然gap6不是必要的，但是ga/」是糖酵解必需的(Seta等，丄Bacter.,1997)。具有下调的gapJ基因的微生物在专利申请WO2004/033646中报道用于通过发酵由葡萄糖产生1，3-丙二醇。本申请的发明人显示，需要2个因素的组合以获得1,2-丙二醇产率的增加-1,2-丙二醇的生物合成途径的活性提高(improved),和-GAPDH活性的削弱。本发明人还证明，增加胞内磷酸烯醇丙酮酸浓度或者使用可替换的糖运输系统能进一步促进由微生物发酵进行的1,2-丙二醇生产。发明描述本发明涉及用于从碳源产生1,2-丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征为a)从磷酸二羟基丙酮到1,2-丙二醇的生物合成途径的活性提高，和b)3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性削弱。通过增加所述生物合成途径中涉及的至少一个酶的活性而获得由DHAP到1，2-丙二醇的生物合成途径的活性的提高。这可以通过增加编码所述酶的基因的表达，特别是增加选自如下的至少一个基因的表达来获得m^A、>^/zD、_yayB、_yc^iW、_y《/zE、_yeaE、j^/Z、yq;'O、fos、JK^.G、yofeC、g7<iA和/肌'()。优选地，增加mgsA、j^/D和gWA三个基因的表达。在本发明的另一个方面，通过缺失e^或Wa基因或两者都缺失来消除L':ntner-Doudoroff途径。此外，通过缺失编码由丙酮醛合成乳酸中涉及的酶的基因(比如g/oA、fl/dA、"/JB)，由丙酮酸(/WA)、曱酸fe/7A，p/7B)、乙醇("WE)和乙酸0cAA、pto、poxB)合成乳酸中涉及的酶的基因，来削弱不期望的副产物的合成。削弱3-磷酸甘油醛(脱氢酶)的活性，从而通过丙糖磷酸异构酶的作用将可用的3-磷酸甘油醛的一部分重定向至1,2-丙二醇的合成。然后1，2-丙二醇对葡萄糖的得率能够大于1摩尔/摩尔。然而，由于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生产减少，PEP-依赖的糖输入系统将受到负面影响。因此，在本发明的一个方面，通过使用与PEP无关的糖输入如由ga/P编码的，或者通过向糖磷酸转移酶系统提供更多的PEP，来增加糖输入的效率。这可以通过消除消耗PEP的途径像丙酮酸激酶(由/j汝A和/，F基因编码)，和/或通过促进PEP的合成，例如通过过表达编码PEP合酶的p戸A基因而获得。此外，这对于可将丙酮酸转化成乙酰-CoA的酶抵抗厌氧条件下存在的高浓度NADH是有价值的。这可以通过在//^基因中的特异性突变而获得。最后，为了节省(spare)NADH用于丙酮醇还原成为1,2-丙二醇，可以缺失和w/Zz基因。用于制备1，2-丙二醇的微生物选自细菌、酵母和真菌，但是优选来自大肠杆菌或丙酮丁醇梭菌菌种。本发明的另一个目的是提供通过将修饰的微生物在合适的生长培养基中培养并通过回收和纯化产生的1,2-丙二醇来产生1,2-丙二醇的方法。附图简述并入并构成本说明的一部分的附图例示了本发明，并与说明书一起，用于解释本发明的原理。图l描绘了由糖产生1，2-丙二醇的系统的开发中中央代谢的遗传工程。发明详述如本文所使用的，下述术语可以用于解释权利要求和说明书。根据本发明，术语"培养"、"生长，，和"发酵，，可互换使用，以表示细菌在包含简单碳源的适当生长培养基中的生长。根据本发明，术语"碳源，，表示碳的任何来源，其可以由本领域技术人员使用以支持微生物的正常生长，并且其可以是己糖、戊糖、单糖、二糖、寡糖、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油，和它们的组合。术语"用于产生1,2-丙二醇"表示微生物产生所述目标产物，优选通过发酵产生。发酵是能在需氧、微需氧或厌氧条件下进行的经典工艺。短语"酶活性的削弱"指与进行任何修饰之前的初始菌抹中的活性相比，修饰菌抹中目的酶的活性降低。本领域的技术人员了解多种方法以获得此结果，可能的实例包括-向基因中导入突变，降低该基因的表达水平，或者降低编码蛋白质的活性水平。-由低强度的启动子取代基因的天然启动子，得到更低的表达。-使用使相应信使RNA或蛋白质不稳定的元件。-如果期望完全不表达则缺失基因。术语"表达"指基因序列的转录和翻译，其可以产生基因相应的蛋白质产物。有利地，3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性比在相同条件下在未修饰菌株中观察到的活性低30%,更优选低10%。术语"由磷酸二羟基丙酮到1,2-丙二醇的生物合成途径的活性提高"指该途径涉及的至少一种酶活性提高(见下文)。有利地，本发明的微生物经过遗传修饰以增加从磷酸二羟基丙酮到1,2-丙二醇的生物合成途径中涉及的至少一个酶的活性。优选地，通过增加编码所述酶的基因的表达而获得酶活性的增加。为了获得目标基因的过表达，本领域中的技术人员了解不同的方法，如-用更强的启动子替换内源启动子。-向微生物导入携带所述目标基因的表达载体。-向染色体中导入目标基因的额外拷贝。本领域的技术人员了解几种目前用于将DNA导入细菌菌林的技术。优选的技术是电穿孔，其为本领域的技术人员所熟知。有利地，将选自下组的至少一个目标基因过表达wgx4、j^/B、，oE、少g/zZ、_y《/i￡\;;《/zZ)、j^i/z/7、少cd『、_yq/(9、_y<^'G、_yt/6C、fos、g/rfL4矛口>c(9。基因编码丙酮醛合酶，其催化DHAP转化成丙酮酪。基因yq/B、yeai、yg/Z、j《/z五、_y《/z￡)、yd/2i7、_ycd『、；^/0、y《G、_yc^C、tos编石马能将丙酮醛转化成丙酮醇的酶活性。gAi4基因编码甘油脱氢酶，其催化丙酮醇转化成1,2-丙二醇。/wcO基因编码1，2-丙二醇氧化还原酶，其催化乳醛转化成1，2-丙二醇。优选的微生物携带可导致特别感兴趣的三个基因wg^、j^/zD和g/c^的过表达的修饰。优选地，在根据本发明的微生物中，Entner-Doudoroff途径中涉及的至少一个基因被削弱。Entner-Doudoroff途径提供糖酵解之外将葡萄糖降解成为3-磷酸甘油醛和丙酮酸的另一种途径。Entner-Doudoroff途径的削弱确保大多数或最好是全部葡萄糖通过糖酵解而降解，并用于产生1,2-丙二醇。具体地，这个途径的两个基因e^/或eda中至少一个被削弱。根据本发明，术语"基因表达的削弱"表示基因表达的部分或全部抑制，即所述的"削弱"。这种表达的抑制可以是抑制基因的表达，抑制基因的激活机制，缺失基因表达所需的全部或部分启动子区，或者缺失基因的编码区。优选地，基因的削弱基本上是基因的完全缺失，所述基因可以用促进本发明菌抹的鉴定、分离和纯化的选4奪标记基因取代。优选通过Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.(2000)"One-stepinactivationofchromosomalgenesin^&c/zm.c/z/aco//K-12usingPCRproducts".Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645所述的同源重组技术使基因失活。优选地，在根据本发明的微生物中，丙酮醛变成乳酸的转化中涉及的至少一个基因被削弱。此削弱的目的在于可用的丙酮醛被细胞机构(cellmachinery)使用，基本上用于合成1，2-丙二醇(参见图1)丙酮醛变成乳酸的转化中涉及的基因具体为-编码乙二醛酶的基因，如编码乙二醛酶I的g/oA基因，其催化从丙酮醛合成乳酰谷胱甘肽；-编码乳醛脱氬酶的aWA和a^B基因(其催化从(。乳醛合成(5)乳酸)。在初始菌抹中，有利地削弱了这些基因中一个或多个的表达。优选完全缺失g/oA基因。在本发明的微生物中，优选的是副产物(如乳酸、乙醇和曱酸)的合成中涉及的至少一个酶被削弱。具体地，有利的是削弱编码乳酸脱氢酶的基因W/zA的表达，其催化由丙酮酸合成乳酸，并且削弱编码醇-醛脱氢酶的基因aWE的表达，其催化由乙酰-CoA合成乙醇。相似地，可能迫使微生物使用丙酮酸脱氢酶复合物以从丙酮酸产生乙酰-CoA、C02和NADH而不是乙酰-CoA和曱酸。这可以通过削弱编码丙酮酸甲酸裂合酶的基因/7//A和/^B而实现。在本发明的另一个特定的实施方案中，通过削弱乙S吏合成中涉及的至少一个酶来防止副产物乙酸的合成。优选的是避免这样的乙酸合成，以优化1，2-丙二醇的产生。为了防止产生乙酸，有利地削弱了选自ad:A、pto和poxB中的至少一个基因的表达，所有这些基因都编码涉及不同的乙酸生物合成途径的酶(参见图1)。优选地，在根据本发明的微生物中，增加糖输入的效率。ga」M基因表达强力削弱使GAPDH反应中碳流量降低超过50%，这将导致每摩尔输入的葡萄糖合成小于1摩尔的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP是通常用于向细胞中输入简单糖的糖-磷酸转移酶系统(PTS)所需要的，因为输入与从PEP转移磷酸到葡萄糖得到6-磷酸葡萄糖的磷酸转移偶联。因此降低PEP的量将对糖输入产生负面影响。在本发明的一个特定实施方案中，可以通过不依赖于磷酸烯醇丙酮酸的糖输入系统将糖输入微生物。可以利用由ga/P基因编码的半乳糖-质子共运输体(symporter),其不涉及磷酸化。在这种情况下，输入的葡萄糖必须由g仪基因编码的葡萄糖激酶磷酸化。为了促进此途径，增加选自ga/尸和g仪中的至少一个基因的表达。结果，PTS变得不必要(dispensable)，而且可以通过削弱选自p&H、或crr中的至少一个基因的表达而消除。在本发明的另一个特定的实施方案中，通过增加代谢物磷酸烯醇丙酮酸的利用率而增加糖-磷酸转移酶系统(PTS)的效率。由于削弱了ga/W活性和朝向丙酮酸的碳流量较低，所以本发明的修饰菌抹中PEP的量受到限制，导致转运至细胞中的葡萄糖量较低。存在多种可以用于增加微生物菌株中PEP利用率的方法。具体地，一种ii手段是削弱反应PEP—丙酮酸。优选地，在所述菌抹中削弱选自编码丙酮酸激酶的pj汝A和py砂中的至少一个基因以获得这一结果。另一种增加PEP的利用率的方法是，通过增加磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性来促成(favour)由所述酶催化的反应丙酮酸外々—PEP。这个酶由/7戸A基因编码。因此，优选在微生物中，优选增加p/wA基因的表达。两种修饰可以同时存在于微生物中。特别是在厌氧或微需氧条件下，有利的是，将丙酮酸转化成乙酰-CoA的丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)对于NADH的抑制具有低的敏感度。参照未修饰酶的敏感度确定更低的敏感度。这些特性可以通过如下方式获得向/p"基因(编码PDC的硫辛酰胺脱氢酶亚基)中导入特定突变，使酶的蛋白质序列中的丙氨酸55替换为缬氨酸残基。在厌氧或微需氧条件下，用于将前体还原成1,2-丙二醇的NADH的利用率得到有利地增加。这可以通过减轻由全局调控子ArcA(由wcA基因编码)介导的对三羧酸循环的抑制而获得。细胞中NADH的浓度也可以通过失活由基因w/Zz编码的NADH脱氩酶II而增加。因此，优选地，选自arcA和w函的至少一个基因被削弱。优选地，根据本发明的微生物选自细菌、酵母和真菌。更优选地，微生物选自下组肠细菌科、芽孢杆菌科、梭菌科、链霉菌科和棒杆菌科。甚至更优选地，微生物是大肠杆菌或丙酮丁醇梭菌。本发明的另一个目的是用于制备1，2-丙二醇的方法，其中微生物如先前丙二醇。在需氧、微需氧或厌氧条件下进行l，2-丙二醇的生产。发酵过程的培养条件可以由本领域的技术人员容易地确定。具体地，细菌在20。C-55。C,优选在25。C-40。C，并且对于丙酮丁醇梭菌优选在约35°C，对于大肠杆菌在约37。C的温度发酵。这个方法可以以分糸b方法，#卜一+-分糸1:方法或连续方法进4亍。"在需氧条件下，，表示通过将气体溶于液相而向培养物供氧。这可以通过下述方式获得(l)将含氧气体(例如空气)鼓泡入液相，或(2)震荡包含培养基的容器，以将液上空间包含的氧传递入液相。在需氧条件而不是厌氧条件下发酵的优势在于氧作为电子受体的存在改进了菌抹以ATP形式为细胞过程产生更多能量的能力。因此菌株的普通代谢得到了改进。微需氧条件定义为这样的培养条件其中低百分比的氧(例如使用包含0.1-10%氧的气体混合物，用氮补至100%)溶于液相中。厌氧条件定义为不向培养基供氧的培养条件。可以通过向培养基中鼓泡惰性气体如氮气，去除痕量的其他气体而获得严格厌氧条件。可以使用氮气作为电子受体以改进菌抹的ATP生产，并改进其代谢。根据本发明，术语"适当的生长培养基"表示适合微生物生长的分子组成已知的培养基。例如适合所用细菌的已知设定组成的无机培养基，其包含至少一种碳源。具体地，因此用于大肠杆菌的无机生长培养基可以与M9培养基(Ande腿，1946,編.Jed5W.园32:120-128)、M63培养基(Miller,1992;AShortCourseinBacterialGenetics:ALaboratoryManualandHandbookfori^c/zen'c/^aco//andRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)或^口Schaefer等(1999，J"a/.肌oc/zem.270:88-96)所定义的培养基有相同或相似的组成，并且具体地，命名为MPG的基本培养基如下所述K2HP041.4g/1氮川三乙酸0.2g/1痕量元素溶液*10ml/1(NH4)2S04lg/1NaCl0.2g/1NaHC030.2g/1MgS040.2g/1葡萄糖20至100g/1NaN030.424g/1硫胺素10mg/lFeS04，7H2050mg/1酵母提取物4g/1用氢氧化钠将培养基的pH调至7.4。*痕量元素溶液:柠檬酸4.37g/L,MnS043g/L，CaCl21g/L,CoCl2，2H200.1g/L,ZnS04,7H200.10g/L，CuS04,5H2010mg/L，H3B0310mg/L，Na2Mo048.31mg/L。在本发明的一个特定实施方案中，用在包含简单碳源的培养基中生长的大肠杆菌菌抹进行所述方法，其中简单碳源可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或木糖。特别优选的简单碳源是葡萄糖。13在本发明的另一个特定的实施方案中，用在包含简单碳源或复杂碳源的培养基中生长的丙酮丁醇梭菌菌林进行所述方法。因此生长培养基可以与梭菌生长培养基(CGM,Wiesenbom等，Appl.Environm.Microbiol"54:2717-2722)或由Monot等(Appl.Environm.Microbiol.44:1318-1324)或Vasconcelos等(J.Bacteriol.,176:1443-1450)提出的基本生长培养基具有相同或相似的组成。用于丙酮丁醇梭菌培养的碳源是简单或复杂碳。简单碳源可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或木糖。特别优选的简单碳源是葡萄糖。复杂碳源可以是淀粉或半纤维素。特别优选的复杂碳源是淀粉。有利地，进一步纯化回收的1，2-丙二醇。本领域的技术人员了解用于回收和纯化1,2-丙二醇的多种方法。本发明在上文、下文和实施例中针对大肠杆菌描述。因此对于本发明的初始和进化菌株的可以削弱、缺失或过表达的基因主要使用来自大肠杆菌的基因的名称(denomination)来定义。然而，这种指定根据本发明具有更一般的意义，并覆盖了其他微生物中相应的基因。使用来自大肠杆菌的基因的GcnBank参考符号(reference),本领域的那些技术人员能确定大肠杆菌之外的其他生物体中的等同基因。鉴定同源序列和它们的百分比同源性的方法是本领域的技术人员公知的，并且具体包括可以在网站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上以网站上指示的默认参数使用的BLAST程序。获得的序列可以使用例如程序CLUSTALW(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/)以这些网站上指示的默认参数进行研究(比对)。PFAM数据库(比对和隐藏的Markov才莫型的蛋白质家族数据库，http:〃www.san2er.ac.uk/S0ftware/Pfam/)是蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM能够显示多重比对，查看蛋白质域，评价生物体之间的分布，访问其他数据库并显示已知的蛋白质结构。通过比较源自代表了44个主要的系统发生系的66个完全测序基因组的蛋白质序列而获得COG(蛋白质:fc向同源纟且的l奚，http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)。每个COG由至少三个系定义，从而能够鉴定古老的保守的域。参考文献(按在本文中引用的顺序)1.BadiaJ,RosJ，AguilarJ(1985)，《/Bacte"W.161:435-437.2.TranDinK和GottschalkG(1985),Jrc/z.A^cro^o/.142:87-923.CameronDC和CooneyCL(1986),5/o/Tec/wo/ogy，4:651-6544.Sanchez-RiveraF,CameronDC，CooneyCL(1987)，9:449-4545.AltarasNE和CameronDC(1999),五謂'r亂M'craZ^o/.65:1180-11856.CameronDC,AltarasNE,HoffmanML,ShawAJ(1998)，祝o/ec/mo/.尸rag.14:116-1257.AltarasNE和CameronDC(2000)，历ofec/7"0/.户rag.16:940-9468.HuangK,RudolphFB,BennettGN(1999),如/.五謂'簡.緣油.。/.65:3244-32479.Berrios-RiveraSJ,SanKY,BennettGN(2003)，//w/.Tl^cro^'o/.脸血'/z，/.30:34-4010.BranlantG,FleschG,BranlantC(1983),25:1-711.AlefounderPR和PerhamRN(1989)，Mo/.M/cra6/o/.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动子由质粒pJB137表达基因p，丄为了构建质粒pJB137-P^p4-;^M，使用下述寡核苷酸从大肠杆菌MG1655的基因组DNAPCR扩增基因p戸A1.gapA-ppsAF，由65个碱基组成(SEQIDNO64)ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC具有(大写字母)，网站http:〃genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列，和-与ga/A启动子(1860794-1860761)同源的区域(小写字母)。2.ppsAR,由43个碱基组成(SEQIDNO65)aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC具有-与基因p/W(1785136至1782758)的序列(1782758-1782780)同源的区域(大写字母)-限制性位点历mffll(带下划线的字母)。同时使用下述寡核苷酸扩增大肠杆菌基因gopA的gapA启动子区域1.gapA-ppsAR，由65个石咸基组成(SEQIDNO66)GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtg具有(大写字母)，和-与《"/八启动子(1860794-1860761)同源的区域(小写字母)。2.ppsAF,由33个碱基组成(SEQIDNO67)ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc具有.--与基因ga/x4启动子(1860639-1860661)同源的区域(小写字母)。-限制性位点SWGI(带下划线的字母)。随后使用寡核苦酸ppsAR和gapAF将两个片段融合(Horton等，1989Gene77:61-68)。用限制性酶///wffll和Smal剪切PCR扩增的片段，并克隆入载体/x/B"7(EMBL登录号U75326)的历m/inASmal位点中，产生载体将不同的pME101VB01质粒和pJB137-Pgo^4-^W导入菌抹大肠杆菌MG1655Ptrcl6-go/x4，Aet^-e内，Ag/d,Apj^iAp，尺将获得的菌抹分别命名为大肠杆菌MG1655Ptrcl6-g"/v4，AedJ-e(^，Ag/a4，Ap_y￡4，Ap;^F，pME101VB01画j^/2D-mgW-g/(^，pJB137-Pga/^-p/^4(菌抹1),大肠杆菌MG1655尸加/6-g—,Ae必-喊'Ag/a4,Ap;MApj^pME101VB01，/B-附g^-gW/tpJB137-Pg"/^-/^W(菌抹2)和大肠杆菌MG1655Ptrcl6-ga/W,Ae必-喊，Ag/W，Ap卢，Apy^;pME101VB01-—g風pJB137-(菌抹3)。实施例3:能以高于1摩尔/摩尔葡萄糖的得率产生1，2-丙二醇的大肠杆菌MG1655Ptrcl6陽ga;x4,Ae必e叔Ag7o力，Aa/W,Aa雄，A緣AA/^/7錢A(3(i/^,Aac^4-;to,A/oxB,A/_yL4，A/>^F(pME101VB01-j^/zD-mgs爿-g/(i^」，(pJB137-PgopJ-p/w^)、大肠杆菌MG1655Ptrcl6-gapj,Ae^/画eda，Ag/a4，Aa/cL4'Aa/戲AW/l4,A/y/戲zW/iE，AacL4-/to,Apox6，Ap_y"Ap_yA:F(pME101VB01-_yq/S-wg^-g/^4人(pJB137-尸ga;^-p戸々和大肠杆菌MG1655Ptrcl6-ga/j，AefiW-e(ia，Ag7a4，Aa/ci4，Aa/讽A雄AAp^L46，A<a^￡,Aac/^-pto,Apox双Apy/biA;;^F(pME101VB01-gW力，(pJB137腿户ga/^-p戸J)修饰菌抹的构建根据操作规程1，用表2中给出的寡核苷酸构建菌抹MG1655A"/^4::km、MG1655Aa/必::cm、MG1655Ap/L4B::km、MG1655zW級:cm、MG1655AacW-pto::cm,并根据操作规程2将这些缺失转移至先前构建的菌抹中。必要时，根据操作规程3消除抗生素抗性盒。根据操作规程1，用表2中给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素抗性盒而使先前构建的菌抹中的基因W/7v4和；o;c5失活。必要时，根据操作规程3消除抗生素抗性盒。在每个步骤，使用表3中给出的寡核苷酸检查先前建立的所有缺失是否存在。将得到的菌抹命名为大肠杆菌MG1655Ptrcl6-gapj,Ae^/-e*，Ag/oJ,Aa/W，A"緣'AM^,A/^/7哉Afl^/z五，△acW-pto,ApoxS,Apy风Ap^尺将不同的pME101VB01质粒和pJB137-Pga/^-p;^导入菌株大肠杆菌MG1655Ptrcl6-ga卢，Ae必-喊，Ag/a4,Aa/刮，Aa/戲AAi/^4,ApyL4S'Aac/認,AacL4-pto,A/ox双A;少A^，Ap;^尺将获得的菌林分别命名为大肠杆菌MG1655Ptrcl6-g(apj，zWd-e*'A_g/o4，AaW4,A"/趙A/(i/2爿，A/yL4B,AW/iE'Aac^4-/to，A/xx/,A/少yb4，Apy^;pME101VB01-;^/zD-wg^4-g/a^,pJB137-Pga/^-;/w爿，大肠杆菌MG1655Ptrcl6陽gfl/^4,Ae^/-efl^,Ag/a4，Aa/(i4,A"^^，AW/^,A//^B'Aa<i/z￡'Aac^4-pto,A/oxB,4P_yL4,A/;^fpME101VB01-;^/B-wg5爿-g/(iApJB137-Pga/^-p/wJ和大肠才干菌MG1655Ptrcl6-go^4,Ae^Z-o^,Ag/oiA<a/(i4，Aa/讽A綠J，A/yL4S,Aad/7五，AacL4-/to，A/oxS，ApyL4，Apy化pME101VB01-j^/z￡-mgs」-g/ci4，pJB137-Pga;^-p戸v4。实施例4:在需氧条件下不同菌抹的1，2-丙二醇生产的比较在需氧条件下，在锥形瓶实验中，在以葡萄糖作为碳源的基本培养基中培养如实施例2中所述获得的菌林(菌抹1、2和3)和对照菌抹(对照1:MG1655pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，对照2:MG1655pMElOlVBOl-yaffl-mgsA-gldA，对照3:MG1655pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA和对照4:MG1655Ptrcl6-gapA，Aedd-ed马，AgloA,ApykA,ApykF)。在34。C或37。C进行培养，并通过用MOPS緩沖培养基来保持pH。在培养结束时，通过HPLC分析发酵液中的1，2-丙二醇、丙酮醇和残余的葡萄糖，并计算1,2-丙二醇对葡萄糖的得率和l,2-丙二醇+丙酮醇对葡萄糖的得率。然后选择最佳菌林用于发酵罐补料分批培养。菌抹1,2-丙二醇效价(g/1)丙酮醇效^介(g/1)1，2-丙二醇得率(g/g葡萄糖)1，2-丙二醇+丙酮醇得率(g/g葡萄糖)对照l0.0200.0040細对照20000对照30.0100.0020.002对照40.050.3400.04菌林l2.251.400.140.23菌林21.641.310.100.18菌抹30.770.470.060.10实施例5:用最佳菌抹在补料分批培养中产生1，2-丙二醇使用补料分批操作规程在21发酵罐中培养前面实验中选择的最佳菌抹。将培养的温度在37。C保持恒定，并使用NH4OH溶液将pH永久地调至6.5-8的值。在分批阶段中，搅拌速率保持在200-300rpm，并在补料分批阶段结束时，增加多至1000rpm。通过使用气体控制器，将溶氧的浓度保持在30-40%饱和度的值。当光密度达到三-五的值时，以0.3-0.5ml/h的初始流速开始补料分批培养，并逐渐增加至2.5-3.5ml/h的流速值。在此时使流速保持恒定24至48小时。分批培养的培养基基于包含浓度为300-500g/1的葡萄糖的基本培养基。权利要求1.用于从碳源产生1，2-丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征为-从磷酸二羟丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途径的活性提高，和-3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性削弱。2.根据权利要求l的微生物，其中所述微生物经过遗传修饰而增加从磷酸二羟丙酮到1,2-丙二醇的生物合成途径中涉及的至少一种酶的活性。3.根据权利要求2的微生物，其中通过增加编码所述酶的基因的表达而获得至少一种酶的活性的增加。4.根据权利要求3的微生物，其中选自下组的至少一个基因的表达增力口mgsA、_yq/B、少eaE、_yg^Z、_y《/2E、_y《/zD、_y6//F、_ycJW、_yayO、_y^/G、_y<iZC、Za"g/WA和/"cO。5.根据权利要求4的微生物，其中三个基因m^A、；;一D、和gWA的表达增力口。6.根据权利要求1至5中任一项的微生物，其中Entner-Doudoroff途径中涉及的至少一个酶的活性削弱。7.根据权利要求6的微生物，其中下述基因中至少一个的表达削弱e必、8.根据权利要求1至7中任一项的微生物，其中丙酮醛到乳酸的转化中涉及的至少一个酶的活性削弱。9.根据权利要求8的微生物，其中下述基因中至少一个的表达削弱g/oA、a/c/A、a/t/B。10.根据权利要求1至9的微生物，其中乳酸、曱酸或乙醇的合成中涉及的至少一个酶的活性削弱。11.根据权利要求IO的微生物，其中下述基因中至少一个的表达削弱雄A、p^7A、；y7B、a舰。12.根据权利要求1至11中任一项的微生物，其中乙酸合成中涉及的至少一个酶的活性削弱。13.根据权利要求12的微生物，其中下迷基因中至少一个的表达削弱14.根据权利要求1至13的微生物，其中糖输入的效率增加。15.根据权利要求14的微生物，其中使用不依赖磷酸烯醇丙酮酸的糖输入系统。16.根据权利要求15的微生物，其中选自ga/P和g汰的至少一种基因的表达增力口。17.根据权利要求14的微生物，其中通过增加代谢物'磷酸烯醇丙酮酸'的利用率而改进糖-磷酸转移酶系统的效率。18.权利要求17的微生物，其中至少一种丙酮酸激酶的活性削弱。19.根据权利要求18的微生物，其中选自pj^A和py好的至少一种基因的表达削弱。20.根据权利要求17-19中任一项的微生物，其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性增加。21.根据权利要求20的微生物，其中/戸A基因的表达增加。22.根据权利要求1-21中任一项的微生物，其中利于丙酮酸代谢成为乙酰-CoA的酶对于NADH的抑制的敏感度低于未修饰的酶。23.根据权利要求22的微生物，其中/;%/基因具有引起丙氨酸55被绳氨酸取代的点突变。24.根据权利要求1至23中任一项的微生物，其中选自wrA和w//z的至少一种基因的表达削弱。25.根据权利要求1至24中任一项的微生物，其中微生物选自下组细菌、酵母和真菌。26.根据权利要求25的微生物，其中微生物选自下组肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孑包一干菌牙牛(Bacillaceae)、才复菌牙牛(Clostridiaceae)、4连霉菌牙牛(Streptomycetaceae)禾口一奉^]犬4干菌牙牛(Corynebacteriaceae)。27.根据权利要求26的微生物，其中微生物是大肠杆菌(Eyc/^r/c//"co//)或丙酉同丁醇才炎菌(C7o^nWwmacetoZw/^//cwm)。28.用于制备1，2-丙二醇的方法，其中根据权利要求1至27中任一项的微生物在包含碳源的合适的生长培养基中生长，并且回收产生的1，2-丙二醇。29.根据权利要求28的方法，其中微生物是大肠杆菌，并且碳源是简单碳源。30.根据权利要求28的方法，其中微生物是丙酮丁醇梭菌，并且碳源是31.根据权利要求28至30中任一项的方法，其中将回收的1,2-丙二醇进一步纯化。全文摘要用于从碳源产生1，2-丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征为从磷酸二羟丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途径的活性提高，和3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性削弱，本发明还涉及用根据本发明的微生物通过发酵产生1，2-丙二醇的方法。文档编号C12N1/21GK101679940SQ200880017107公开日2010年3月24日申请日期2008年3月21日优先权日2007年3月23日发明者弗朗索瓦·沃尔克,菲利普·索凯勒,雷纳·菲格申请人:代谢探索者公司