具有免疫刺激效果的食用产品的制作方法

专利名称：具有免疫刺激效果的食用产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及食用产品(edible product)。更具体地说，本发明涉及具有免 疫刺激效果(immimostimulating effect)的食用产品，尤其是包含可由萝蘑亚科 (Asclepiadoideae subfamily)植物获得的免疫刺激多糖的食用产品。
背景技术：
一些食用产品或食品已知具有免疫刺激性能。例如， W0-A-2007/054208 (Unilever)公开了用于恢复或保持免疫功能的食用产品，其包括数量为 至少IO3个细菌/克的益生菌和至少0. 5mg/g含有至少2个单糖单元的人参多糖。US-A-6432454(C. V. Technologies)公开 了一种由北美花旗参(NorthAmerican ginseng)(西洋参(Panax quinquefolium))制备级分的方法以及含有这些级分的组合物， 其可以用于刺激产生细胞因子和/或抗体，或者用作针对以低免疫力为特征的疾病如普通 感冒(common cold)、流感、慢性疲劳综合症、AIDS和癌症的治疗剂。然而，人参是一种昂贵 的成分。对于具有这种免疫刺激性能的新的或可替代的食品一直存在需求。因此，本发明 的一个目的是提供此类食用产品。本发明的又一个目的是提供制备此类具有这种免疫刺激 性能的食品的方法。出人意料地发现，该目的可以通过本发明的食用产品来实现，该食用产品包含可 由萝蘑亚科(Asckpiadoideae subfamily)植物获得的免疫刺激多糖。萝蘑科在过去是一个植物科，现在作为夹竹桃科(Apocynaceaefamily)中的一个 亚科(萝蘑亚科)。它们形成了一批多年生草本植物、缠绕灌木、藤本植物或极少的乔木，但 显著的是还含有大量无叶肉茎植物，全部属于龙胆目(Gentianales)。该亚科包括魔星花族(tribe Stapelieae)，蝴蝶亚属(genus Hoodia)就是属于魔 星花族，它是一种发现于南非的喀拉哈里(Kalahari)沙漠中的肉质植物。虽然该植物具有 类似于仙人掌的多刺外观，但它们与仙人掌科不相关。蝴蝶亚属于有花植物夹竹桃科、萝蘑 亚科下的有13个种的属。已经报导，源自蝴蝶亚的留族苷类是起食欲抑制剂作用的该植物 的活性成分。W0-A-98/46243公开了这些植物含有具有式1的留族苷类 其中R=烷基；R1 = H、烷基、甲基巴豆酰基(tiglyol)、苯甲酰基或任何其他有机酯基团；R2 = H或一个或多个6-脱氧碳水化合物(6-deoxy carbohydrates)，或者一个或 多个2，6- 二脱氧碳水化合物，或者葡萄糖分子，或者它们的组合；且其中虚线表示在碳原 子C4和C5之间或在碳原子C5和C6之间任选存在另外的键。W0-A-98/46243还公开了一种用于从萝蘑亚科植物中提取具有式1的留族苷的方 法，包括用溶剂处理植物材料以提取具有食欲抑制活性的级分，将提取溶液与剩余植物材 料分离，从提取溶液中除去溶剂以及回收提取物。具体提到用于进行提取的溶剂是亚甲基 氯化物(二氯甲烷)、水、甲醇、己烷、乙酸乙酯或它们的混合物中的一种或多种。功能食品成分领域中的最近的一个热点是使用免疫调节剂来增强宿主防御反应 (host defense response)。宿主防御反应的一个重要部分是固有免疫系统。免疫系统的固 有分支是快速激活的病原体第一防线。它尤其包括吞噬细胞和自然杀伤(NK)细胞。吞噬细 胞如中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞能够产生活性氧物种(reactive oxygen species, R0S)来杀死病原体如真菌、细菌和病毒感染的细胞。NK细胞能够杀死已经丧失或表达不足 够量的MHC class I的靶细胞，其是一种在肿瘤或病毒感染细胞中的频发事件。衍生自植物、藻类和蘑菇的多糖能够表现许多有益的治疗性能，包括免疫刺激。 例如源于紫维菊(Echinacea purpurea)、卵叶车前子(Plantago ovata)、人参(Panax ginseng)、西洋参(Panax quinquefolius)、^!古月(buplureum falcatum)禾口获* (Poria cocos)的多糖已经被描述成影响巨噬细胞功能例如吞噬活性的激活、ROS和一氧化氮产生 的增加以及增强的细胞因子和趋化因子分泌。然而，还从未公开源于萝蘑亚科或蝴蝶亚仙 人掌(Hoodia Gordonii)植物的多糖的免疫刺激效果。

发明内容
根据本发明的第一方面，提供了具有免疫刺激效果的食用产品，所述产品包括可 由萝蘑亚科植物获得的免疫刺激多糖。根据本发明的第二方面，提供了制备根据本发明的食用产品的方法。根据本发明的第三方面，提供了组合物，其包括0.0001_25wt%可由萝蘑亚科植物 获得的且具有免疫刺激效果和> 3的平均聚合度的多糖。
具体实施例方式根据第一方面，本发明涉及包括产生免疫刺激效果的多糖的食用产品。本发明产 品中所使用的免疫刺激多糖可以由属于萝蘑亚科的植物获得。优选地，所述免疫刺激多糖由魔星花族植物获得。更优选，它们由包括13个种的 蝴蝶亚属获得。特别优选的是，所述植物选自以下种摩耶夫人(Trichocaulonpiliferum)、 Trichocaulon officinale、Hoodia currorii、蝴蝶亚仙人掌(Hoodiagordonii)、Hoodia Iugardii和它们的混合物。蝴蝶亚仙人掌是特别优选的。所述免疫刺激多糖可以通过如下方式从萝蘑亚科成员的植物中分离切碎该植物，提取该切碎的材料(例如用MeOH 水(90 10% w/w))和由前面步骤的不溶性材料制 备热水提取物。采用例如使用乙醇的附加洗涤步骤可以制备富集多糖的提取物。优选地， 该提取物由蝴蝶亚属植物获得。尤其优选的是，由蝴蝶亚仙人掌种的植物获得所述免疫刺 激多糖。所述免疫刺激多糖能够通过它们的> 3、优选> 5、更优选> 7，最高到1，000的平
均聚合度来表征。根据本发明的食用产品可以采取任何物理形式。尤其，它可以是液体或可涂抹的、 可舀取的(spoonable)固体或食品增补剂(supplement)。优选地，该产品是液体产品。该食用产品可以适当地采取例如汤、饮料、涂抹物 (spread)、调料(dressing)、甜食(dessert)或蛋黄酱的形式。更优选地，该食用产品是 饮料、甜食或涂抹物。更优选地，该食用产品是饮料或涂抹物，尤其是水包油乳液形式的涂 抹物。这里所使用的术语“涂抹物”包括可涂抹的产品例如人造黄油(margarine)、可涂抹 的干酪基产品和经加工的干酪。最优选地，本发明的产品是饮料。这种饮料通常含有至少 60wt%水和0-20wt%分散的脂肪。优选地，这种饮料含有至少70wt%水和0-10wt%分散的 脂肪。根据本发明的食用产品优选包括一种或多种其他普通营养物、维生素和矿物质 以递送健康的营养，尽管不是免疫刺激。适合的维生素和矿物质包括但不限于维生素A、 维生素D、维生素E、维生素C、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素B6、叶酸盐/酯、维生素B12、 生物素、泛酸、钙、磷、钾、铁、锌、铜、碘、硒、钠、镁、锰、钼、维生素K、铬和它们的混合物。用 于递送维生素和矿物质的优选成分包括但不限于磷酸钾、磷酸钙、氧化镁、磷酸镁、抗坏血 酸、抗坏血酸钠、乙酸维生素E、烟酰胺、正磷酸铁、泛酸钙、氧化锌、葡萄糖酸锌、棕榈酸维生 素A、盐酸吡哆醇、核黄素、单硝酸硫胺素、生物素、叶酸、氯化铬、碘化钾、钼酸钠、锡酸钠、 phytonadone (维生素K)、胆钙化醇(维生素D3)、氰钴胺素(维生素bl2)、硫酸锰和它们的 混合物。优选地，本发明产品含有至少10%或更多的推荐每日量(“RDA”)的维生素和矿 物质。本发明产品可以进一步包括肉、鱼、肉和鱼提取物、水果、水果干、水果浓缩物、水 果提取物、水果汁、茶(例如绿茶)、蔬菜、蔬菜提取物和浓缩物、坚果、坚果提取物、巧克力、 面包、醋、盐、胡椒(P印per)、可可粉、药草(herbs)(例如欧芹)、药草提取物、调味料(例如 肉桂)、调味料提取物、乳化剂、酸度调节剂(例如磷酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸及其盐)、黄 酮类、防腐剂(例如乳酸、EDTA、生育酚类、苯甲酸钠)、色料(例如β-胡萝卜素、番茄红素、 焦糖、胭脂红(carmine red))、纤维(例如大豆)、膨松剂(例如碳酸氢钠)、果胶、柠檬酸、 酵母、盐、甘油和它们的混合物。任选地，该食用产品可以进一步包括一种或多种具有式1的食欲抑制留族苷 其中R=烷基；R1 = H、烷基、甲基巴豆酰基、苯甲酰基或任何其他有机酯基团；R2 = H或一个或多个6-脱氧碳水化合物，或者一个或多个2，6-二脱氧碳水化合 物，或者葡萄糖分子，或者它们的组合；且其中虚线表示在碳原子C4和C5之间或在碳原子 C5和C6之间任选存在另外的键。这里所使用的术语“免疫刺激”是指，免疫系统防护其自身抵御病原体如真菌、细 菌、病毒、原生动物、寄生虫或蛋白的活性或能力被提高。数种检测能够用于鉴定能够改变 免疫力的组分。本发明人选择使用吞噬细胞和自然杀伤(NK)细胞来帮助鉴定免疫刺激化 合物，因为这些细胞是固有免疫系统的一部分，固有免疫系统为快速激活的非特异性病原 体防御的第一线。吞噬细胞如中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞能够产生活性氧物种(ROS)来杀死 病原体如真菌和细菌。成分对吞噬活性的效果可以体外测定，利用在用FITC标记的大肠杆 菌(E.coli bacteria)培育之后的健康人志愿者的新鲜血液。吞噬细胞在粒细胞群中的百 分比可以通过流式细胞术来测定。结果通常被标准化为脂多糖(LPS)的效果，其为公知的 有效免疫刺激参照化合物。在本发明中，标准化的％吞噬粒细胞> 40%被认为是显著的免 疫刺激效果。NK细胞能够杀死已经失去或表达不足够量的MHC class I的靶细胞，其是一种在 肿瘤或病毒感染细胞中的频发事件。成分对NK细胞活性的效果能够用从健康人志愿者的 新鲜血液中分离的外周血单核细胞(PBMC)来体外测定。在用所述成分预先培育PBMC之 后，通常添加预先标记的K562靶细胞并且在随后培育之后，可以添加碘化丙啶用于检测死 亡细胞。死亡靶细胞的百分比可以用流式细胞术来测定。结果通常被标准化为白细胞介 素-2(IL-2)的效果，白细胞介素_2是公知的有效NK细胞刺激参照化合物。在本发明中， 标准化的％ NK细胞活性> 17%被认为是显著的免疫刺激效果。根据本发明的第二方面，根据本发明的食用产品通过将免疫刺激多糖添加到食品 中(例如在生产过程中)来制备。本发明的一个另外方面是获得具有免疫刺激效果的多糖的方法。植物基多糖由大 的不溶性聚合物如细胞壁组分、小的可溶性寡糖如单体(例如葡萄糖)和二聚体(例如纤 维二糖)和大的可溶性多糖组成。尤其，从后者可以预期免疫调节反应，因为它们大得足以 从免疫系统激起反应并且溶解性是相互作用的必要条件。含有多糖的提取物可以如上所 述制备。为了使植物基材料富集可溶性多糖，所述小的寡糖可能必需除去。这通常通过重复的温热醇(85% )洗涤步骤来进行(Shiomi, N.，1992. NewPhytologist 122，第 421-432 页)，因为小的寡糖在醇水溶液中具有一定溶解性，而聚合物是不溶的。随后，对残留物进 行热水提取，以分离水溶性聚合物，将它与不溶性多糖分离。在该步骤中，还除去了其他水 不溶性组分。为了检验碳水化合物分离的成功，使用Dubois方法测定碳水化合物的总含量 (Dubois M等人，(1956)用于测定碳水化合物和相关物质的比色法(Colorimetric method for determination of sugars and relatedsubstances),Analytical Chemistry,28(3), 350-356)。成功除去小的寡糖的首要大致识别通过平均聚合度来获得，其通过比较碳水化 合物还原端基的分析结果(DNSA方法)和由Dubois方法测定的总碳水化合物含量来确定。 成功除去小的寡糖(例如单糖和二糖)将获得高平均DP值(例如至少高于2)。一种更精 确的方式是通过尺寸排阻色谱法测定富集的提取物的分子量分布。本发明的一个另外的方面是组合物，其包括0.0001 25wt%的可由萝蘑亚科植 物获得且具有免疫刺激效果的多糖，所述多糖具有> 3，优选> 5，更优选> 7最高到1，000 的平均聚合度。现在将通过以下实施例来更详细地描述本发明。实施例1获得包括来自蝴蝶亚仙人掌的免疫刺激多糖的食用组合物(A)和蝴蝶亚仙人掌将蝴蝶亚仙人掌植物切碎，并且将切碎的材料用MeOH 水(90 提 取。将0. 2g的MeOH不溶性植物材料在IOml的沸腾鲎变形细胞溶解(limulus amebocyte lysate, LAL)水(Cambrex, US)中培育5分钟，随后在4°C在3，OOOg离心45分钟。含有来 自蝴蝶亚仙人掌的多糖㈧的上清液用0. 2μπι过滤器过滤，分成小份并在-20°C储存，直到 在免疫检测中使用。蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物⑶如下获得将25g的MeOH不溶性植物材料 用200ml的85%乙醇(VWR Prolabo)水溶液在80°C 2. 5小时洗涤两次，用200ml的85%乙 醇水溶液在80°C 1.5小时洗涤一次。在滗析掉乙醇之后，颗粒在烟橱(fuming carbinet) 中干燥过夜。多糖通过添加200ml的MilliQ水和沸腾3小时来提取。在2，OOOg在室温 (RT)离心20分钟之后，将颗粒再悬浮于200ml的MilliQ水中，再次沸腾3小时。收集第一 次和第二次提取的上清液，冻干，和在RT储存。由富集多糖的冻干蝴蝶亚仙人掌粉末制备 在LAL水中的2% (m/m)悬浮液，并且在121°C压热处理(autoclaved) 15分钟。将该悬浮 液在RT在2000g离心30分钟。上清液通过0. 2 μ m过滤器过滤，分成小份，在-20°C储存， 直到在免疫检测中使用。实施例2包括来自蝴蝶亚仙人掌的免疫刺激多糖的食用组合物(A)和蝴蝶亚仙人掌的富 m^mmmm (β)的分析表征碳水化合物的定量样品中的碳水化合物的总量根据Dubois的方法(参见上文)来测定。将50μ 1 的试样或标准曲线样品(0-0. 3g/l葡萄糖)与20 μ 1的6g/l间苯二酚(Aldrich)和90 μ 1 的纯H2SO4P. a. (Merck)混合。在80°C培育20分钟之后，在450nm测定消光。碳水化合物 的量经由葡萄糖的校正曲线的线性回归计算。
单糖组成的测定将包括来自蝴蝶亚仙人掌的多糖的食用组合物(a)和蝴蝶亚仙人掌的富集多糖 的提取物(b)的10g/l溶液在2M HCL中水解以获得单糖。该水解通过将0.2ml 37%盐酸添 加到Iml溶液中获得2M HCl的最终浓度，随后彻底混合并在预热水浴中在95°C培育6小时 来进行。在该培育之后，将该溶液冷却到RT，在15600Xg离心10分钟。用IOM NaOH将上 清液的PH调至3-7的pH，过滤器灭菌(0. 45 μ m),并将0. 5ml放入Iml HPLC管形瓶(vial) 内用于分析(LC-10AT，Shimadzu，日本)。注入两种单糖样品(10 μ 1)。为了校正，使用日 本Shimadzu自动注入器SIL-10AD注入单糖(lg/Ι浓度的10 μ 1溶液)(参见表2用于校 正的单糖名单，全部从Sigma-Aldrich购买)。使用硫酸(5mM，pH2.0)作为洗脱剂，在65°C 的温度和0. 6ml/min的流速使用Aminex HPX-87H(300X7. 8mm)柱。使用折射率(RID-10A， 日本Shimadzu)以及UV 220nm和280nm(SPD_10A，日本Shimadzu)的双测定。基于单糖校 正，测定存在于水解样品中的单糖组成。聚合度的测定f艮据 Bernfeld 的方^去(Bernfeld 等(1955)，Amylase alpha and beta. Methods in Enzymology, 1, 149-158)测定样品中的多糖的分子量。3，5_ 二硝基水杨酸(DNSA)试剂 通过在60°C将Ig DNSA溶于20ml 2M NaOH和50ml水中来制备。在获得透明溶液之后，添 加30g酒石酸钾钠，将体积调至100ml。将150 μ 1的试样或标准曲线样品(0-25mmol/l葡 萄糖)与150 μ 1 DNSA试剂混合。3次将50 μ 1的样品DNSA试剂混合物添加到96孔板。 在80°C加热30分钟并冷却到RT之后，添加100 μ 1的水，相对于空白测定在540nm的吸收。 多糖的分子量经由葡萄糖校正曲线的线性回归来计算。通过将碳水化合物的量(g/kg样品)除以分子量(mol/kg样品)，确定平均分子量 (g/mol)。分子量分布的测定分子量的分布通过用具有P900泵和UV900检测器的Acta explorer (瑞典， GE Healthcare)进行的制备尺寸排阻色谱法来测定。按照生产商说明(GE Healthcare 52-2086-00 注释)，将 S印hacryl S200HR±真装到 XK100/1. 6 柱中，使用不含 CaC12 和 MgC12 的D-PBS(GIBC0 BRL)作为缓冲液，pH = 7. 0。所述柱用lml/min流速的不含CaCl2和MgCl2 的D-PBS缓冲液平衡。以0. 5ml/min的流速加载2ml样品或标准物，以0. 5ml/min进行无 梯度洗脱。对于80kD、50kD、25kD、12. 5kD、5kD和IkD的葡聚糖标准物，使用lg/Ι的浓度。 对于蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物(B)，使用缓冲液中的5g/l浓度。在样品的洗脱过 程中，在65ml和180ml之间收集了 4. 8ml的级分。对于这些级分，根据Dubois方法(参见 上文)测定碳水化合物的量。^M^tm^iih^mm^mm^mm^ (A)Kmm-Mm^mm
提取物(B)的表征表1示出了包括蝴蝶亚仙人掌的多糖(PS)的食用组合物(A)和蝴蝶亚仙人掌的 富集多糖的提取物⑶的碳水化合物的总量、单糖组成、聚合度和蛋白含量。

图1示出了蝴 蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物(B)的分子量分布。提取物A的组成的特征在于8-10%的 碳水化合物、不同的单糖和7-8%的总蛋白。提取物B，蝴蝶亚仙人掌的富集PS的提取物的 组成特征在于37-42%的碳水化合物、与提取物A类似但量不同的单糖、19-21%的总蛋白和>6的平均聚合度。表 1包括来自蝴蝶亚仙人掌的免疫刺激多糖的食用组合物(A)和蝴蝶亚仙人掌的富 集多糖的提取物(B)的表征 实施例3包括蝴蝶亚仙人掌多糖的食用组合物的自然杀伤(NK)细胞刺激效果自然杀伤(NK)细胞活件的测定在肝素钠管中从健康志愿者获得新鲜血液，并且使用Ficoll-Paque通过密度梯 度离心从血液分离出外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC计数，以5X IO6细胞/ml的浓度重 新悬浮于组织培养基RPMI 1640Complete中，并在4°C储存，直到在流式细胞术细胞毒性检 测中作为效应细胞使用。使用红系髓细胞白血病细胞系(erythromyelocytic leukemia cellline)K562(—种NK敏感细胞系)作为靶细胞。K562细胞用PBS洗涤，计数，并且以 5 X IO6细胞/ml的浓度重新悬浮于PBS中，之后用1 μ g/ml染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰 亚胺基酯(CFDA-SE)在5% C02、37°C标记30分钟。在标记之后细胞用PBS洗涤，以IOX IO4 细胞/ml的浓度重新悬浮于RPMI Complete中，并在4°C避光储存，直到使用。PBMC用所述成分一式三份在37 °C (5% CO2)预培育30分钟。对照培育由PBS (= NK细胞活性的基础水平)或800IU/ml白细胞介素_2(IL_2)(=阳性对照样品)(一式三 份的平均值士sd)组成。在用所述成分预培育之后，添加靶细胞(效应物靶细胞比率= 25 1)，在37°C (5% CO2)培育120分钟。在培育之后，在添加碘化丙啶之后将细胞放置
9在冰上1-5分钟，用于检测死亡细胞。用Coulter FC500MPL流式细胞仪(BeckmanCoulter， Miami, Fl, USA)测定自然杀伤细胞活性。采集至少1000个靶细胞的数据，并使用EXPO 32 程序分析。测定死亡靶细胞的百分率。结果标准化到IL-2的效果。通过来自蝴蝶啊III人掌的多·周节NK细胞麻十牛在NK细胞活性试验中以三种不同浓度(1 = 0. 4yg/ml ；2 = 4μ g/ml ；3 = 40 μ g/ ml)测试包括来自蝴蝶亚仙人掌的多糖的食用组合物(A)和蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提 取物(B)。该实验的结果在图2中示出。其证实了包括蝴蝶亚仙人掌的多糖的食用组合物 (A)在0.4 (Al)-4 (A2)-40 (A3) μ g/ml的浓度和蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物(B)在 0. 4 (Bi) -4 (B2) -40 (B3) μ g/ml的浓度的NK细胞刺激活性。NK细胞活性作为白细胞介素_2 的最大刺激的百分率报告，其中> 17%的％标准化NK细胞活性可以被认为是免疫刺激效 果(=任意阈值)。结果提供了一式两份进行的每一种样品的一个实验的平均值和标准偏 差。结果显示，包括来自蝴蝶亚仙人掌的多糖的食用组合物㈧在4和40 μ g/ml的浓度刺 激从人血液样品中分离的PBMC的NK细胞活性。蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物(B)在 0. 4 μ g/ml的浓度已经是有效的。实施例4包括蝴蝶亚仙人掌的多糖的食用组合物的吞噬作用刺激效果吞噬作用活件的测定吞噬作用活性用Orpegen Pharma(德国，Heidelberg)的PhagOtest 试剂盒使用 调整的操作规程来测定。更详细描述如下在肝素钠采血管(BD biosciences)中从健康人志愿者获得新鲜血液。将30 μ 1的 全血和5μ 1的所述成分一式两份在聚丙烯96孔板中在37°C在水浴中预培育30分钟。对照 培育由PBS(=基础吞噬作用活性)或lOOng/mL大肠杆菌脂多糖(LPS)(=阳性对照样品) (一式三份的平均值士sd)组成。在预培育步骤之后，添加10μ 1的FITC标记的大肠杆菌 (白细胞与大肠杆菌的比率为25 1)。通过添加50 μ 1的冰冷猝灭剂溶液在6. 5分钟之后 停止在37°C的该培育。通过添加230μ 1的冰冷洗涤缓冲液并在300g(4°C )离心3分钟将 细胞洗涤三次。通过添加290 μ 1的溶解缓冲液将红细胞溶解。在室温避光培育20分钟之 后，将细胞在300g(4°C )离心5分钟。将细胞重新悬浮于150μ 1的洗涤缓冲液中，用碘化 丙啶染色。通过流式细胞术(Coulter FC500MPL流式细胞仪，Beckman CoulterNederland BV,Mijdrecht)进行分析。根据FSC/SSC图将白细胞设门到单核细胞和粒细胞群中。确定 粒细胞群中吞噬细胞的百分比。将结果标准化到脂多糖(LPS)的效果。通过来自蝴蝶亚仙人掌的多糖调节吞噬作用活性在吞噬作用活性试验中以两种不同浓度(1 = 29 μ g/ml ；2 = 290 μ g/ml)测试包 括来自蝴蝶亚仙人掌的多糖的食用组合物(A)和蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物(B)。 该实验的结果在图3中示出。其证实了包括蝴蝶亚仙人掌的多糖的食用组合物(A)在浓度 29 (Al)-290 (A2) μ g/ml和蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物⑶在浓度29 (Bi)-290 (B2) μ g/ml的吞噬作用刺激活性。吞噬粒细胞的百分率作为LPS的最大刺激的百分率报告，其 中>40%的％标准化吞噬粒细胞可以被认为是免疫刺激效果(=任意阈值)。结果提供了 一式两份进行的每一种样品的一个实验的平均值和标准偏差。结果显示，包括来自蝴蝶亚 仙人掌的多糖的食用组合物(A)和蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物(B)在29和290 μ g/ml的浓度均刺激从新鲜人血液样品中分离的粒细胞的吞噬作用活性。实施例5吞噬作用刺激效果由蝴蝶亚仙人掌的多糖引起而非由LPS污染引起的验证多糖的酶促水解在醋酸盐缓冲液(用HCl调至pH5的水中的IOmM NaAc+140mMNaCl)中制备20g/ L的包括蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物(B)的食用组合物的贮备溶液。制备13.3g/l 的脂多糖E-coli L4130 (LPS)溶液。将两种溶液在40°C加热10分钟，以改善溶解。然后， 将100 μ 1的在醋酸盐缓冲液中IOX稀释的果胶酶-混合物Macer8TM(Bi0CatalyStS，UK) 或100 μ 1醋酸盐缓冲液(空白)添加到500 μ 1的加热的样品和400 μ 1的醋酸盐缓冲液 中。将所有混合物在25°C处理过夜(缓慢振荡)，以便将复合多糖降解。通过将250 μ 1 4Ν HCl添加到500 μ 1样品中、在99°C加热2小时和经一整夜缓慢冷却至RT来将阳性对照样 品化学水解。化学水解的样品用250μ 14M NaOH中和。在15. 800Xg离心5分钟之后，根 据如上所述的Bernfeld方法测定样品中留下的糖的量。表2通过化学水解和MacerS 水解降解多糖，用小的糖的形成来表示(Eq.葡萄糖mg/ g) 与化学水解(设定为100% )相比，蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物⑶用 MacerS 的酶促水解获得了 90. 4%的糖水解。醋酸盐空白缓冲液处理的LPS和MacerS 处 理的LPS样品都没有产生糖的水解(参见表2)。有禾π、没有促7k解的LPs m&mmm^mm为了验证采用MacerS 的LPS的酶促水解不影响LPS的吞噬作用刺激活性，将醋 酸盐缓冲液和Macer8TM处理的LPS 二者在两种不同浓度(290ng/ml和29 μ g/ml)在吞噬试 验中进行测试。结果(参见图4)提供了一式两份进行的每一种样品的一个实验的平均值 和标准偏差。图4证明了在0.29-2. 9-29 μ g/ml的浓度的蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取 物(B)的吞噬作用刺激活性以及用果胶酶混合物MacerS 或醋酸盐空白缓冲液处理的LPS 在290ng/ml和29 μ g/ml的浓度的吞噬作用刺激活性。吞噬粒细胞的百分率作为LPS的最 大刺激的百分率报告，其中>40%的％标准化吞噬粒细胞可以被认为是免疫刺激效果。结果证明，LPS的酶促水解，其不导致多糖降解，也不影响LPS的吞噬作用刺激能 力。^mn^^mmmmmmmmmihKmm^m^mmmmmnmmmm效果 为了验证蝴蝶亚仙人掌中的多糖是否引起所述免疫刺激效果，在吞噬作用试验中 测试醋酸盐空白缓冲液和MacerS 处理的蝴蝶亚仙人掌的富集多糖的提取物(B)。图4示 出了多糖水解对用富集多糖的蝴蝶亚仙人掌样品处理的血液粒细胞的吞噬作用活性的影 响。醋酸盐缓冲液处理的样品和MacerS 处理的蝴蝶亚样品二者在三种不同浓度(290ng/ ml-2. 9 μ g/ml-29 μ g/ml)在吞噬作用试验中测试。结果提供了一式两份进行的每一种样品 的一个实验的平均值和标准偏差。结果证实，多糖的酶促水解导致了蝴蝶亚仙人掌的富集 多糖的提取物的吞噬作用刺激效果的降低，证明蝴蝶亚仙人掌中的多糖是产生免疫刺激效 果的原因。
权利要求
具有免疫刺激效果的食用产品，所述产品包含可由萝藦亚科植物获得的免疫刺激多糖。
2.根据权利要求1所述的食用产品，其中所述多糖可由魔星花族植物获得。
3.根据前述权利要求任一项所述的食用产品，其中所述多糖可由蝴蝶亚属植物获得。
4.根据前述权利要求任一项所述的食用产品，其中所述多糖可由蝴蝶亚仙人掌种的植 物获得。
5.根据前述权利要求任一项所述的食用产品，其中所述多糖具有>3、优选> 5、更优 选>7到10的平均聚合度。
6.根据前述权利要求任一项所述的食用产品，其中所述免疫刺激多糖可通过包括下列 步骤的方法来获得将所述植物切碎，用MeOH 水(90 10% w/w)提取切碎的材料，以及 制备不溶性材料的热水提取物。
7.根据权利要求6所述的食用产品，其中通过所述不溶性材料的附加洗涤步骤来富集 所述热水提取物。
8.根据前述权利要求任一项所述的食用产品，其中所述食用产品为液体如汤、饮料、涂 抹物、调料、甜食或蛋黄酱的形式。
9.根据前述权利要求任一项所述的食用产品，进一步包括一种或多种具有式1的甾族苷 其中 R=烷基；R1 = H、烷基、甲基巴豆酰基、苯甲酰基或任何其他有机酯基团； R2 = H或一个或多个6-脱氧碳水化合物，或者一个或多个2，6- 二脱氧碳水化合物，或 者葡萄糖分子，或者它们的组合；并且其中虚线表示在碳原子C4和C5之间或在碳原子C5 和C6之间任选存在另外的键。
10.制备根据前述权利要求任一项所述的食用产品的方法，包括下列步骤(a)将所述植物切碎；(b)用MeOH水(90 10% w/w)提取切碎的材料，(c)制备不溶性材料的热水提取物，以及(d)将所述提取物添加到食用产品中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过所述不溶性材料的附加洗涤步骤来富集所 述热水提取物。
12.组合物，其包括0.0001-25wt%的可由萝蘑亚科植物获得且具有免疫刺激效果的 免疫刺激多糖，所述多糖具有> 3、优选> 5、更优选> 7最高至1000的平均聚合度。
全文摘要
本发明提供了具有免疫刺激效果的食用产品，所述产品包括可由萝藦亚科植物获得的免疫刺激多糖。本发明还提供了制备这种食用产品的方法和包含0.0001-25wt％的具有免疫刺激效果的多糖的组合物。
文档编号A23L1/00GK101888785SQ200880119557
公开日2010年11月17日 申请日期2008年11月13日 优先权日2007年12月7日
发明者J·A·范阿德里彻姆, J·H·科克, M·C·D·范德伯格库雷瓦尔, S·L·阿布拉哈姆斯, W·M·布洛姆 申请人:荷兰联合利华有限公司