专利名称：表达辅酶A转移酶及β-酮基硫解酶的工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程菌，具体地说是一种辅酶A转移酶及 P-酮基硫解酶的表达工程菌，本发明还涉及该工程菌的构建方法， 以及该菌在微生物生产乙酰乙酸盐中的应用。
背景技术：
酮体(ketone bodies)是脂肪酸在肝脏进行正常分解代谢所生成的 特殊中间产物，包括三种水溶性成分乙酰乙酸(acetoacetic acid约 占30%)，卩-羟丁酸(卩-hydroxybutyric acid约占70%)和极少量的丙酮 (acetone) (Laffel L， Ketone bodies: a review of physiology, pathophysiology and application of monitoring to diabetes. Diabetes/metabolism research and reviews, 1999， 15(6): 412-426)，结构 式及相互关系见图l。理论上讲，P-羟丁酸并不属于酮类，但它经常 与其它两种物质伴随出现，因而统称为酮体。
正常人血液中酮体含量极少，这是人体利用脂肪氧化供能的正 常现象。在某些生理情况(饥饿、禁食)或病理情况下(如糖尿病), 糖的来源或氧化供能障碍，脂动员增强，脂肪酸就成了人体的主要 供能物质，以酮体的形式作为机体能量来源有着特殊的意义。但是， 若肝中生成酮体的量超过肝外组织利用酮体的能力，二者之间失去 平衡，血中浓度就会过高，导致酮血症(acetonemia)和酮尿症 (acetonuria)。
乙酰乙酸(acetoacetic acid)是酮体的重要组成成分之一，是最 简单的J3-酮酸，为无色油状或浆状液体，或晶体，能与水、醇任意 混合，是一种有机弱酸，pKa为3.7。分子量102.09 g/mol,熔点36.5 °C。结构式如式(I)所示<formula>formula see original document page 4</formula>
研究表明，乙酰乙酸及其衍生物有着重要的医用前景。目前， 对乙酰乙酸及其衍生物的直接利用还很有限，但是，随着进一步研 究的进行，对于乙酰乙酸及其衍生物的医学应用将越来越广泛。
与其他(3-酮酸一样，乙酰乙酸很不稳定。它容易分解为丙酮和 二氧化碳，反应式见式II。当乙酰乙酸以酸的形式存在时，在37°C 水中它的半衰期为140min，而在碱性环境下(以阴离子形式存在)， 半衰期为130h，比它的酸式降解速度慢50倍以上(Hay R W, " Kinetics of decarboxilation of acetoacetic acid. Aust. J. Chem, 1967, 20 (9): 1823-1828)。
CH3COCH2COOH — CH3COCH3 + C02 + H20 ( n )
目前，主要通过乙酰乙酸乙酯在稀碱溶液中加热水解生成乙酰 乙酸盐，然后酸化来制备乙酰乙酸(Robert C, a/., Crystalline Acetoacetic Acid. Journal of the American Chemical Society, 1952, 74 (21): 5536-5536)。但是由于乙酰乙酸盐不稳定，生产条件严格，所以 工业上没有很好的生产方法。一般来说，乙酰乙酸的制备在'O'C进行， 牵'J备后立即使用(George A. a/., Methylglyoxal-co-Phenylhydrazone. Organic Syntheses, 1963, 4: 633)。
相对于纯化学途径合成有机物，用生物合成的方法具有一系列 的优点，包括经济消耗低，对环境的污染少，反应条件宽松(37'C 和标准大气压)等等。另外，化学方法生产乙酰乙酸需要强碱性环 境，合成的强碱性产品不适于医疗应用，微生物方法是在中性偏碱 的条件下合成乙酰乙酸，这显示出相对于化学合成巨大的优点。而 且随着人们生活水平的提高，生物合成安全、副作用小的优点越来 越受到重视。目前还没有利用微生物方法生产乙酰乙酸盐的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于表达P-酮基硫解酶和3-酮酸-辅酶 A转移酶的专用表达工程菌。
为实现上述目的，本发明首先提供一种表达载体，其含有P-酮 基硫解酶的基因(/ /2"J)及3-酮酸辅酶A转移酶(Mo"B)基因。 所述表达载体是将P-酮基硫解酶的基因(户/2")及3-酮酸辅酶A转 移酶基因(MO"S)克隆到表达载体中获得。
进一步将所述表达载体导入宿主菌，获得能够表达本发明所提 供的P-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶的专用表达工程菌。所述 宿主可以是大肠杆菌(&c/^Wc/2/a);所述P-酮基硫解酶基因及3-酮 酸辅酶A转移酶基因分别为NCBI GenBank号为NC—008313.所述的 / 編(REGION:1559207..1560388)、 W6—J"37 (腳亂REGION: 1445890..1446591 )基因。
所述用于构建含有P-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶基因的 表达载体的出发载体为任一可在大肠杆菌中表达外源基因的表达载 体，如pBBRlMCS-2 ( NCBI GenBank号为U23751 )， pBBRlMCS-5 (NCBIGenBank号为U25061; )， pBBRlMCS-3 ( NCBI GenBank号 为U25059 )。(文献来源Kovach，M.E., Phillips，R.W., Elzer，P.H., Roop，R.M. and Peterson,K.M. pBBRlMCS: a broad-host-range cloning vector, BioTechniques 16 (5), 800-802 (1994) ; Michael E. Kovach, Philip H. Elzer， *, D. Steven Hill, Gregory T, Robertson, Michael A. Farris, R. Martin Roop, II and Kenneth M. Peterson, Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes, Gene， Volume 166， Issue 1， 1， Pages 175-176可求得)
在本发明的一个实例中，以pBBRlMCS-2为出发载体，构建得 到含有P-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶基因的表达载体，其为pHD03。
上述含有P-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶基因的表达载体 可按照生物工程领域中的常规方法构建，如参照《分子克隆实验指 南》中的构建方法构建。
所述大肠杆菌宿主菌的选择是多种多样的，如^c/7"/c/2Z'fl CO//
ToplO、 Esc/zm'c/z/a co// S17-l ( Sambrook J， d "/,， Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 )。
可釆用生物工程领域中常用的方法将含有p-酮基硫解酶及3-酮 酸辅酶A转移酶基因的表达载体转化假单胞菌宿主菌，如接合转化 法、电击转化法、氯化锂转化法或原生质体转化法等，优选为接合 转化法。
本发明的另 一个目的是提供上述工程菌在制备乙酰乙酸盐 (ACAC)中的应用。
乙酰乙酸盐的制备是发酵上述(3-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转 移酶的专用表达工程菌，获得(3-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶， 底物为葡萄糖及琥珀酸盐的溶液，发酵得到乙酰乙酸盐。
可釆用大肠杆菌的常规培养条件对重组大肠杆菌进行培养。
在发酵罐发酵中，可釆用如下培养基进行发酵罐底成分10-15 g/L酵母浸出物，8-12g/L胰蛋白胨，8-12g/LNaCl， 28-32 g/L葡萄 糖，2-3g/L琥珀酸钠和8-12g/L磷酸氢二钾，其余为水；补料成分 600-800g/L葡萄糖和200-400g/L琥珀酸钠。
在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生 素以维持质粒的稳定性，如50)ig/mL硫酸卡那霉素。
发酵时，发酵温度为34-38, pH值为7.0-8.5。优选发酵温度为 37°C, pH值为8.0。
可釆用流加或分批补加的方式，将葡萄糖600g/L及琥珀酸盐
6100g/L溶液加入发酵液中。釆用流加方法时，流加速度按照每L培 养基10-15mL/h;釆用分批补加方式时，可在糖浓度低于10g/L时 加入底物葡萄糖及琥珀酸盐的溶液。
本发明提供了一种P-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶的专用 表达工程菌。该工程菌是利用基因工程技术构建出含有p/2"及
的质粒，然后将其导入大肠杆菌中，获得的重组大肠杆菌。 此外，摇瓶实验结果表明本发明的工程菌可高效表达3-酮酸辅酶A 转移酶，并可将底物葡萄糖及琥珀酸盐转化成ACAC，转化效率较 高。小型发酵罐实验表明将本发明的工程菌在6L发酵罐中发酵后， DHCD的产量最高可达2.2g/L以上，且生产工艺简单，成本低廉， 应用前景广阔。
图1显示的是三种酮体的结构式及转化关系； 图2为质粒pHD03的物理图谱。
图3显示的是菌落PCR筛选阳性克隆，其中M: 1 kb DNALadder; 1, 2， 3:连有oxcL4B及/7/za力基因的阳性克隆；4:阴性克隆。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段；所用酶试剂均购自MBIFermentas公司，提取质粒 所用的试剂盒购自北京新长江生物科技有限公司，回收DNA片断所 用的试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，相应的操作步骤按 照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
本发明中的溶氧是6升发酵罐(NBSBioflo 3000， New Brunswick Scientific, U.S.A.)探头获得的结果，即指在l大气压，25。C时，按照C*=0.2mmol/L (发酵液中)来计算溶氧率。 培养基配方
1) 摇瓶发酵培养基
葡萄糖琥珀酸钠培养基，命名为LBGS。含5g/L酵母浸出物， 10g/L胰蛋白胨，10g/LNaCl， 20 g/L葡萄糖和2 g/L琥珀酸钠，其 余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
2) 6升发酵罐(NBS Bioflo 3000， New Brunswick Scientific, U.S.A.)。初始培养基体积为3L。
罐底成分如下15g/L酵母浸出物，10g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl， 30g/L葡萄糖，2g/L琥珀酸钠和10g/L磷酸氢二钾，其余为 水。
补料成分如下800g/L葡萄糖和300g/L琥珀酸钠。 在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生 素以维持质粒的稳定性，如50pg/mL硫酸卡那霉素。
实施例1、 P-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶专用表达工程菌的 构建
一、含有p-酮基硫解酶基因(P/wJ)及3-酮酸辅酶A转移酶基 因"oc"B)的表达载体的构建
1 )提取罗氏真养菌(i^&to"/aeM加/ /^H16X ATCC编号17699, 可购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection))的基因 组(Pohlmann Anne， a/" Genome sequence of the bioplastic-producing "Knallgas" bacterium i a/Wom'a ew/ra—a HI6. Journal Nat Biotechnol. 2006， 24: 1257-1262),以兄e^rap/w H16基因组为模板，用p/w酶进 行PCR反应扩增目的基因并在片段前加入SD序列 (Shine-Dalgarno sequence )。 引物为
Sense: 5' AAGCTTy^04GCGAAGCATGAACAAGGTCTAC 3' 历"dIII SDAntise脆5' GGAGCTCAGCCCGCTTACAGCA 3
PCR反应条件
1. 94。C预变性8min;
2. 94。C变性30sec;
3. 68士2。C退火30sec;
4. 72。C延伸lmin24sec;
5. 重复步骤2-4， 29次循环；
6. 72。C后延伸10min。
PCR扩增目的片断(20pL体系)
模版DNA 0.4^L
引物l 0.5pL
引物2 0.5pL
p/w buffer 2.0^iL，酶 0早
dNTP 1.5fiL
d线O 14.9(iL
PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。 将回收后的^c"5片段连入平端克隆载体pEASY-Blunt,构建 的质粒记为pHDOl。把pHDOl转化入五.co/ZTop10中保存，并通过
细菌增殖进一步扩增。
2 )pBHR68 ( Spiekermann P, Rehm BHA, Kalscheuer R, Baumeister D,Steinbiichel A (1999) A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other storage corn-pounds. Arch Microbiol 171:73—80 )质粒中含有R. eutropha H16的phaA基因，以 pBHR68质粒为模板，用pfu酶进行PCR反应扩增。 引物为Sense: 5' GGTACCMGG^CTACACAATGACTGACGTTGTCATCG 3'
一I SD Antisense: 5' GGAGCTCAGCCCGCTTACAGCA 3' 历"dIII
反应程序94。C预变性8min; 94。C变性30sec， 70。C退火30sec, 72。C延伸lmin24sec， 29个循环;72。C后延伸10min。 PCR扩增目的片断(20jiL体系)
模版DNA 0.4pL
引物l 0.5nL
引物2 0早
buffer 2.0joL
; /m酶 0.2jiL
dNTP 1,5jiL
ddH20 14攀
PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
PCR产物回收后连入克隆载体pEASY-Blunt，构建的质粒记为 pHD02,把pHD02转化入￡. co//ToplO中保存，并通过细菌增殖进 一步扩增。
3) 提取pHD01、 pHD02、 pBBRlMCS2质粒；用限制性内切酶 历wdIII和五coRV酶切质粒pHDOl，回收so"^B基因酶切片断；用 限制性内切酶五coRV和BamHI酶切质粒pHD02,回收/ /z^4基因酶 切片断；用限制性内切酶历"dIII和石amHI酶切载体质粒 pBBRlMCS2，回收酶切片断；将回收的/ /w」和ko"5基因片断与 PBBR1MCS2载体片段用DNA连接酶进行连接，将连接产物用电转 化的方法导入到E co"TOP10 (北京全式金生物技术有限公司)中， 将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37。C、 200rpm下摇床 培养12h;
4) 挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到 LB-Km液体培养基中，在37。C、 200 rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶/7/mini、 B"mHI和五coRV对质粒进行酶切鉴 定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为1.4kb、 1.2kb及5.1kb的DNA 片断，将构建正确的含有/^"j和mo"5基因片段的大肠杆菌表达 载体命名为pHD03，其物理图谱见图2。
二、P-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶专用表达工程菌五.co// TOP10 ( pHD03 )及五.co// S17-l (pHD03 )的获得
将步骤一构建的含有和"o"5基因片段的表达载体 pHD03用化学转化法导入到co/ZTOP10,用电转化法导入到co// S17-l ( ATCC编号:47055,可购自美国菌种保藏中心(AmericanType Culture Collection))。
用化学转化法把质粒pHD03转化入￡. co"Top10中，菌落PCR 方法筛选阳性克隆，电泳结果如图3所示。
用五coRV、 5awHI及历mini酶切验证，片段大小也符合预期。 通过DNA测序结果比对，证明质粒pHD03构建成功。重组菌为￡. co/z' Top 10 (pHD03 )。
构建的质粒pHD03被用电转化的方法转入五.co/ZS17-l中。从 重组菌中提取质粒，用五coRV、万"附111及///"(1111酶切验证，酶切得 到大小符合预期的三段DNA片段，说明pHD03已经被成功转入上 述菌中。
实施例2、 P-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶专用表达工程菌表 达的3-酮酸辅酶A转移酶的酶活测定
用下述方法检测实施例1构建的3-酮酸辅酶A转移酶专用表达 工程菌及对对照菌株表达3-酮酸辅酶A转移酶的酶活，具体方法如 下
1)制备细菌总蛋白裂解液
a)将100mL所需菌液于4。C离心，收集细胞，弃上清。b) 将细胞用50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0 )洗涤2次， 离心收集细胞后，充分重悬于10mL的50 mM Tris-HCl 缓冲液(pH8.0)中。
c) 将悬液容器置于冰上，低温条件下进行超声破碎。
d) 4°C、 10000 rpm，离心10min。上清液即为细菌总蛋白 裂解液，将其移至新的离心管中低温保存备用。沉淀物为 细胞碎片，弃去。
2) 用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质浓度(Bradford M M， A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem， 1976， 72:248-254),测定总蛋白含量为0.817mg/ml。
3) 测定琥珀酸3-酮酸-辅酶A转移酶(OxctAB)酶活 OxctAB酶活单位的定义是在25。C下，每分钟生成0.0025 pmol
乙酰乙酰辅酶A为一个单位U。本例以菌体总蛋白裂解液为对象， 测定OxctAB的比活力(用OxctAB酶活除以测定溶液中总蛋白含量， 就得到OxctAB的比活力。严格的说应该测定OxctAB酶的量，但实 际操作中一般测定总蛋白来作为参照)。酶活测定需要的试剂是0.1 MTris-HCl ( pH 8.0 )缓冲液、0.25 M MgCl2溶液、670mM乙酰乙 酸锂溶液、6mM琥珀酰辅酶A溶液和去离子水(Corthesy-Theulaz IE, a/.， Cloning and characterization of //e//co6ac er "/o"' succinyl CoA: acetoacetate CoA-transferase, a novel prokaryotic member of the CoA-transferase family. The Journal of Biological Chemistry, 1997， 272(41): 25659-25667)。通过测定乙酰乙酰辅酶A在303nm的特定吸 收峰来测定OxctAB的酶活。
酶活测定结果如表1所示，表明3-酮酸辅酶A转移酶专用表达 工程菌可正确稳定表达3-酮酸辅酶A转移酶。
表1 co//Topl0重组菌及对照菌中OxctAB酶活测定
菌种(所含质粒；表达的外源基因)酶的比活力(U/mg)
对照菌(pBBRlMCS2;无)1.37
12重组菌(pHD01;oxrfAB&) 53.21 重组菌(pHD03;;^^4,o;cc"5fe) 47.77
实施例3、用五"脸WcA/tf ToplO (pHD03)生产ACAC的摇瓶实 验
为了确定重组菌中ACAC合成量，以及各种处理条件下的浓度 差异，运用HS-GC仪，PID检测方法对实验样品进行检测。
各菌种(co/z' Top10(无)、五.co// Top10 ( pBBRlMCS2 )、 co/z' Top10 (pHD03))分别用LB培养基，37°C, 200rpm过夜培养；然 后按5%接种量(v/v),分别接种至100mLLBGS培养基(即葡萄糖 琥珀酸钠培养基，含5g/L酵母浸出物，10g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl, 20g/L葡萄糖和2g/L琥珀酸钠，其佘为水，pH 7.0-7.2 )， 37 。C ， 200rpm,摇瓶培养36小时，接种8 h后力口 IPTG至终浓度lmmol/L 诱导，每个菌种设置三组平行。运用HS-GC仪，PID检测方法 (Lopez-Soriano F J， Argiles J M. Simultaneous determination of ketone bodies in biological samples by gas chromatographic headspace analysis[J]. Journal of Chromatographic Science, 1985, 23: 120-122.)对 实验样品进行检测。
表2摇瓶培养的HS-GC检测结果
样品ACAC定量结果( 上清mg/L ) 菌液细胞破碎
￡ co// ToplO (无)8.63±0.797.95±0.91
co" ToplO (pBBRlMCS2 )10.85±0.8111.28±0.76
co/z'ToplO a (pHD03)32L16±27.70326.53±30.12
co//ToplO b (pHD03)303.71±23.20310.28±28.77
由表2的测定结果可以看出，带有pHD03质粒的细菌ACAC产 量要显著高于带pBBRlMCS2质粒的同种细菌，说明ojcc"B及 基因的导入改变了 co//ToplO菌株合成ACAC的能力，同时也证 明了表达质粒pHD03构建成功。
此外，破碎处理的菌液与上清中ACAC浓度基本相同，说明产生的乙酰乙酸倾向于被细胞转运到胞外。
实施例4、重组菌五sc/^r/c似"ToplO (pHD03)生产ACAC的小 型发酵罐实验
菌种在20mL抗性LB培养基(含50)ig/mL硫酸卡那霉素)中 37°C， 200rpm培养12 h以上，获得一级种子；接种量为5 %(V/V) 将一级种子接种至lOOmL抗性LB培养基中37°C， 200rpm培养12 h，获得二级种子；再以接种量为10。/。(V/V)进行发酵罐培养。
发酵罐初始设定空气流速3L/min,即通气量为1;设定温度 为37°C,用5M氢氧化钠和硫酸调pH，设定发酵罐的p1^8.0，均采 用P-I-D监测；溶氧控制为30%，与搅拌速度耦联，搅拌速度控制范 围为200-800 rpm之间。值得注意的是，发酵时pH设定为8.0，是为 了利用偏碱性的发酵条件减弱ACAC的脱羧。
将葡萄糖及琥珀酸盐的溶液加入发酵液中的方式为分批补加； 培养过程中，用糖试纸测糖浓度低于10g/L时，补加葡萄糖一瓶 (600g/L， 100mL ),琥珀酸钠 一瓶(100g/L， 50mL )。
用酮体试纸大致监测乙酰乙酸盐浓度，当乙酰乙酸盐浓度变化 进入平台期，终止发酵。
发酵过程中，细菌生长正常。细菌在发酵17h时达到CDW(菌 体干重)最大值，接近llg/L。细菌对数生长期时，发酵液中迅速积 累ACAC，产物浓度峰值达到2.2g/L。发酵20h后，ACAC的积累 进入平台期。35h后，ACAC积累量减少。<formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 16</formula>
权利要求
1、一种表达载体，其含有β-酮基硫解酶基因和3-酮酸辅酶A转移酶基因。
2、 如权利要求l所述的表达载体，其特征在于，所述P-酮基硫解酶基因具有SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。
3、 如权利要求l所述的表达载体，其特征在于，所述3-酮酸辅酶A转移酶基因具有SEQIDNo,2所示的核苷酸序列。
4、 如权利要求1 3任一项所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为pBBRlMCS-2 、 pBBRlMCS-5或pBBRlMCS隱3。
5、 如权利要求4所述的表达载体，其为pHD03。
6、 含有权利要求1 5任一项表达载体的工程菌。
7、 如权利要求6所述的工程菌，其为大场杆菌。
8、 如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为^&c/zm'c/n'a co// Top 10或E^c/^z'c/n'a co// S17-1 。
9、 权利要求6 8任一项所述工程菌在制备乙酰乙酸盐中的应用。
10、 一种制备乙酰乙酸盐的方法，其是在含有底物葡萄糖及琥祐酸盐的发酵培养基中发酵权利要求6 8任一所述的工程菌，从所得培养物中分离获得乙酰乙酸盐。
全文摘要
本发明公开了表达β-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶的工程菌及其应用，特别是涉及一种β-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶的专用表达工程菌与该工程菌在生产乙酰乙酸盐的应用。该工程菌是将含有β-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶基因的表达载体导入大肠杆菌中得到的。本发明还提供一种乙酰乙酸盐的制备方法，其是发酵所述表达β-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶的工程菌，获得β-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶，再加入底物葡萄糖及琥珀酸盐的溶液，发酵得到乙酰乙酸盐。本发明β-酮基硫解酶及3-酮酸辅酶A转移酶的专用表达工程菌将在ACAC的工业化生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/63GK101475956SQ20091000159
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月15日 优先权日2008年10月30日
发明者琼 吴, 石振宇, 碟 胡, 陈国强, 陈金春 申请人:清华大学