专利名称：：用于检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫及羊梨形虫检测膜的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物疾病检测用试纸，确切讲是一种用于检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫和羊梨形虫检测膜及其制备和使用方法。
背景技术：
：羊泰勒虫病是由羊泰勒虫(J7^7eha/^d)引起绵羊和山羊的-种蜱传性血液原虫病，寄生于牛、羊和其它动物上皮细胞、淋巴细胞和红细胞内。1914年最先发现于埃及，随后在非洲、欧洲、亚洲的许多国家都发现该病原。我国羊泰勒虫病f、杨辅国等在1957年首先发现于四川省甘孜藏族自治州乾宁县。在我国，经研^证实羊的泰勒虫病病原并不是以上任何一种，而是新种，初步定名为吕氏泰勒虫(r/mvem/mw')和尤氏泰勒虫(rw7e"6ergz')，这两种虫体的传播媒介均为青海血蜱。为我国的特有病原。一般而言，泰勒虫的诊断主要包括三种方法(l)通过血涂片的方法和临床症状，例如AkinboadeOA,Dipeolu00.ComparisonofbloodsmearandindirectfluorescentantibodytechniquesindetectionofhaemoparasiteinfectionsintradecattleinNigeria[J].VetParasitol.1984,14(2):95-104;DarghouthME,BouattourA,BenMiledL,SassiL.DiagnosisofTheileriaannulatainfectionofcattleinTunisia:comparisonofserologyandbloodsmears[J].VetRes.1996;27(6):613-21.(2)应用一些血清学方法，这种方法是补体结合试验(CFT)和间接荧光抗体试验(IFAT)检测，但这些方法很难排除不同种之间的交叉反应，而且常会出现假阳性和漏f金参见BruningA.Equinepiroplasmosisanupdateondiagnosis[J].BrVetJ,1996，152:139151，或者PapadopoulosB,BrossardM,PerieNM(1996)PiroplasmsofdomesticanimalsintheMacedoniaregionofGreece.3.Piroplasmsofsmallruminants.VetParasitol63:67-74。(3)PCR技术，是目前检测泰勒虫最常用的分子诊断方法，与常规的方法相比具有敏感性高、特异性强、检出率高等优点，参见AlhassanA，P画idonmkigW,OkamuraM,HiritaH,BattsetsegB,FujisaldF,YokoyamaN,IgarashiI(2005)Developmentofasingle-roundandmultiplexPCRmethodforthesimultaneousdetectionofBabesiacaballiandBabesiaequiinhorseblood.VetParasitol129:43—49;AltayK,DumanliN,HolmanPJ,AktasM(2005)Detectionof7%e//en'aovisinfectedsheepbynestedPCR.VetParasitol127:99—104。但PCR方法通常不能同时检测出混合感染的发生。我国的病原吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫，具有极强的致病性和致死性。而且，调查发现该病原分布广泛，直接威胁着我国养羊业的发展。所以，制定有效的检测预报系统对该病的防治十分迫切和必要。中国发明专利申请200810018313.4公开了一种检测羊泰勒虫病的ELISA诊断试剂盒及其制备方法，该方法，包括可与待测样品结合的固体支持物；包被于可与待测样品结合的固体支持物上的羊泰勒虫裂殖子抗原，每孔0.1ug;作为二抗的用酶标记的兔抗羊IgG;标准羊泰勒虫阳性血清；标准羊泰勒虫阴性血清；明胶；底物稀释液；30%H2O2;无色底物；终止液；磷酸盐缓冲液。经包被抗原、洗涤、封闭、洗涤、风千后密封4'C保存等工艺制备而成。本发明具有虫体抗原特有的高特异性；该ELISA诊断试剂盒实现了本病检测的标准化、自动化、且适合羊泰勒虫病的早期诊断和大规模的野外血清流行病学调査。能早期诊断本病，一般在感染后5天就能检出特异性抗体，检测出血清抗体的最早时间比比传统显微镜检测出的时间提前5-10天。但该专利申请的方法却无法区分患病羊感染的究竟是何种泰勒虫，这会影响患病羊只的治疗及预防工作。另一方面该专利的检测方法用时较长，影响到这一方法的推广应用。
发明内容本发明提供一种用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜及这种检测膜的制备方法和使用方法。本发明用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜是在BiodyneC薄膜上固定有吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸。本发明的用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜，在BiodyneC薄膜上还固定有巴贝斯虫特异性寡核苷酸和泰勒虫通用特异性寡核苷酸。本发明用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜，在BiodyneC薄膜上固定的吕氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为atottctttttgatgagttg，固定的尤氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为tgcattttccgagtgttact，固定的羊梨形虫特异性寡核苷酸序列为ctgtcagaggtgaaattct,固定的巴贝斯虫特异性寡核苷酸序列为ccttggtaatggttaataggaa，固定的羊巴贝斯虫未定种特异性寡核苷酸序列为cgggtttcgtctacttcgc，固定的莫氏巴贝斯虫特异性寡核苷酸序列为gaatgatgccgacttaaaccct。本发明用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜的制备方法是分别人工合成出吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，将所得到的各寡核苷酸5'端用氨基团修饰，再将其分别共价结合到带有负电荷的BiodyneC薄膜上；或者是分别人工合成出巴贝斯虫特异性寡核苷酸、泰勒虫通用特异性寡核苷酸吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，将所得到的各寡核苷酸5'端用氨基团修饰，再将其分别共价结合到带有负电荷的BiodyneC薄膜上。本发明的检测膜检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫及羊梨形虫的方法是以待检测羊血提取的DNA模板，在泰勒虫和巴贝斯虫18SrRNA基因序列V4高变区两端的保守区域设计一对扩增出的片段大小为480bp-491bp的引物，其中一条引物用生物素标记，再进行PCR扩增，获得生物素标记的PCR产物，生物素标记的PCR产物和固定在BiodyneC膜上的泰勒虫和巴贝斯虫的寡核苷酸进行杂交，再经增强化学发光孵育后将杂交后的膜放置曝光储片夹内，在薄膜上放X光胶片进行曝光，再对胶片进行显影和定影处理，根据胶片上产生的强度信号确定被检羊是否有患有相应的疾病。本发明有如下优点采用本发明的检测膜可以很方便地检测并区分出吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫，同时由于本发明的检测膜上还固定有羊梨形虫的特异性寡核苷酸，因此本发明可以同时检测多个虫种的存在，同时可以检测被检动物感染有一种还是多种梨形虫，这对于羊群疾病的控制及预防治疗有积极的意义。本发明的方法最大优点是可以同时检测出泰勒虫和巴贝斯虫时，而且只需要作一次PCR，如果有扩增产物，说明动物肯定是感染了巴贝斯虫或泰勒虫的某一种或几个种。另外，PCR产物与探针杂交后，还能说明被检动物所感染的虫体的种类，这对于疾病的控制及预防有更为积极的意义。第三，本发明的敏感性要高于PCR，且能同时区分病原的属和种，这一特性在流行病学调査上具有重要意义。由于与探针杂交的PCR产物可以除去，因此杂交膜可以反复使用，据报道这种膜至少可以使用20次以上，另外，在一张膜上，可以固化45个探针，同时检测45个PCR产物，其成本相对低廉。采用本发明的检测膜进行检测的方法非常的简单，而且检测用时较少，其检测成本相对也比较低，而且漏检率要远远小于现有技术。图l为部分患病羊的标准阳性样品检测结果图。具体实施例方式一.含有泰勒虫和巴贝斯虫特异寡核苷酸的检测膜制备根据已确定的18SrRNA基因序列的V4高变区域设计针对莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫喀什株未定种、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫不同虫种的四个特异性寡核苷酸探针的基因序列设计，并命名为B.m，B.spXJ，T.l和T.u，另外，针对所有梨形虫的通用探针catch-all和泰勒虫通用探针，巴贝斯虫通用探针Tall,Ball也分别被设计合成。所有的寡核苷酸探针N-(trifluoroacetamidohexyl-cyanoethyl,N,N-diisopropylphosphoramidite[TFA])-C6氨基团连接修饰，将合成的探针0-800pmol/150ul500mMNaHCO3(pH8.4)，寻找最佳浓度用于杂交。有的寡核苷酸5'端被氨基团修饰后合成。它们能够共价结合到带有负电荷的BiodyneC薄膜上。具体的做法如下(1)特异性寡核苷酸的制备寡核苷酸探针由专业公司按我们的设计要求合成，我们在可变区设计好后，将探针的序列发给专业公司，由他们合成的，本发明是由兰州宝生物公司合成寡核苷酸探针。其中采用的泰勒虫和巴贝斯虫寡核苷酸探针序列和最佳浓度范围见表l。表l泰勒虫和巴贝斯虫寡核苷酸探针序列和最佳浓度寡核苷酸序列J3佳浓度(Oligonucleotides)(Sequence5，-3》(Optimisedconcentrations)梨形虫通用探针ctgtcagaggtgaaattct(Cat-all)(ca841-859)100200pmol巴贝斯虫通用探针ccttggtaatggttaataggaa100200pmol("11)(B-all745-766)泰勒虫通用探针taccaaagtaatggttaatagg1050pmol(r醫all)(T陽all811-832)莫氏巴贝斯虫探针gaatgatgccgactt犯accct100200p陽l("oto/)(B.m466~487)羊巴贝斯虫未定种探针cgggtttcgtctacttcgc600800pmolspXJ)(B.spKashi637-655)吕氏泰勒虫探针atcttctttttgatgagttg300400pmol(7:/諸冊/7,-)(T-l628-647)尤氏尜勒虫探针tgcattttccgagtgttact600800pmol(r.w//e"6，.)(T-u678-697)用500mM，pH为8,4的NaHC03149ul稀释泰勒虫和巴贝斯虫的特异性寡核苷酸待用。(2)膜的制备将BiodyneC膜剪成14.5cmX14.5cm大小，用记号笔标记薄膜以便能在以后的操作中辨别方向。用去离子水配制新鲜的16%(w/v)l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(简称为EDAC)，力口10mlEDAC，孵育10分钟活化BiodyneC膜，室温下旋转培养瓶。将薄膜放在塑料容器中用去离子水摇洗两分钟，然后放入洁净的印迹仪中。旋紧手柄。通过抽吸除去孔里残留的液体。将150ul稀释的寡核苷酸溶液加入印迹仪的孔槽，其中第一个和最后一个孔不加寡核苷酸。将墨水用2xSSPE缓冲液按适合的比例(本发明中采用1:100的比例)稀释，加入第一个孔和最后一个孔。所有的样品都加入以后，室温下孵育2分钟。通过抽吸除去每个孔槽内的寡核苷酸溶液及第-一和最后-个孔槽的墨水稀释液。用镊子从印迹仪中除去膜，然后用新鲜配制的100mMNaOH250ml在塑料容器中孵育10分钟，不断摇动容器使膜钝化。用去离子水漂洗薄膜。在塑料容器中用250ml2xSSPE/质量比0.1%的SDS60°C漂洗5分钟，漂洗期间轻微摇动溶液瓶。用20mM，pH为8.0的EDTA100ml在塑料容器中漂洗薄膜，室温下轻轻摇动15分钟，即得到本发明的检测膜。将其在4。C保存薄膜直到使用(用塑料制品密封或者用包装膜包装避免薄膜脱水)。二、检测膜的检测对比实验1、羊梨形虫裂殖子的制备选试验除脾羊4只，用液氮保存的含有吕氏泰勒虫，尤氏泰勒虫，莫氏巴贝斯虫和喀什株巴贝斯虫未定种的血液红细胞颈静脉接种，感染除脾羊。在感染羊后，每天肌肉注射地塞米松，首次4支/羊，以后2支/羊，每天注射一次，直至染虫率升高为止。从感染之日起，每天早晨测量羊的体温，从体温开始上升之日起，每天从耳缘静脉涂制血片，甲醇固定两次，姬母萨染色后，用显微镜检査红细胞染虫率。当红细胞染虫率达到10.0%以上时，颈动脉放血，20.0%枸橼酸钠抗凝，得到待检测的血样。虫体的分离与提纯(1)力卩300ul血液于盛有900ulBRCCellLysisSolution的1.5ml的离心管中，室温孵育10分钟，孵育过程中颠倒离心管数次，直到液体澄清透明。(2)13000rpm离心1分钟，弃上清，保留下面的可见的沉淀和大约1020^1液体，用涡旋仪涡旋20秒，使沉淀物悬浮。(3)每管中加入300ulCellLysisSolution,吹打混匀使所有细胞裂解。(4)加入lOOulProteinPreciptationSolution到细胞裂解液中。(5)涡旋20秒，至出现棕褐色沉淀颗粒。(6)13000rpm离心5分钟。(7)将上清液移至新标记的离心管中，加入300jil异丙醇，颠倒50次。(8)13000rpm离心5分钟。(9)弃上清，在干净的纸巾上倒置，将剩余的液体吸干。(10)加入300(il70。/。乙醇，颠倒离心管数次以洗脱DNA小团块。(11)13000rpm离心3分钟，小心除去乙醇，在吸水纸上吸干剩余液体。(12)用真空干燥仪进行真空干燥。(13)加入100(^1DNAHydrationSolution。(14)4。C过夜或60。C温育1小时，得到待测的DNA。(15)—2(TC保存备用。2、引物的设计在泰勒虫和巴贝斯虫18SrRNA基因序列V4高变区两端的保守区域设计一对扩增出的片段大小为480bp-491bp的引物，如下上游引物RLB-F(5-gaggtagtgacaagaaataacaate-3)下游引物RLB-R(biotin-5-tcttcgatcccctaactttc-3)。3、PCR扩增基因片段PCR扩增的反应体系及程序H2056単>40个循环1Oxbuffer*7.2(il注本发明所用的缓冲液为200mM的Tris-HCl(pH8.55),160mM(NH4)2S04禾B20mMMgCl210mMdNTPl牟lOOuM上游引物(RLBF)3.6^1lOOuM下游引物(RLBR)3.6^1由步骤1所得DNAlulTaq酶0.36|xl所有的样品混合后12000rpm离心10秒，置于PCR扩增仪中按照如下循环进行扩增94°C3min94°Clmin30sec55。Clmin30sec72°Clmin30sec72。C3min4°C保存取PCR产物1.5ul在1.0。/。的琼脂糖凝胶(含0.5。/。ug/ml溴化乙锭)，在75伏的电压下进行电泳分析，观察扩增结果。4、检测生物素标记的PCR产物和固定在BiodyneC膜上的泰勒虫和巴贝斯虫的寡核苷酸进行杂交。如果存在泰勒虫或巴贝斯虫，则和寡核苷酸特异性作用后用streptavidin-peroxidase和ECL-detection(增强化学发光)孵育后在黑色的方格里面的胶片上可以看到显影，操作步骤如下(1)准备下面的缓冲液，用无离子水稀释，所有的缓冲液使用前要预热。(按一张膜的量)250ml2xSSPE/0.1%SDS,60。C，500ml2xSSPE/0.5%SDS,60°C，500ml2xSSPE/0.5%SDS,42。C.500ml2xSSPE,室温.(2)力Q20^的PCR产物到130^2xSSPE/0.1%SDS中。(3)稀释后的PCR产物99°C热激10分钟然后立即在冰中冷却。(4)用250ml2xSSPE/0.1%SDS60。C漂洗膜5分钟。(5)在印迹仪中按照与寡核苷酸成垂直的方向放入薄膜和支持气垫。(6)通过抽吸的方法除去印迹仪中残留的液体。(7)用稀释后的PCR产物填充孔槽，在水平面上60°C杂交10分钟。(8)通过抽吸除掉印迹仪中的样品，然后用镊子将膜取出。(9)用250ml2xSSPE/0.5。/oSDS60。C,10分钟，漂洗膜两次。(10)放置膜在旋转瓶中使其冷却，以免下一步因过氧化物酶作用而失活。(11)加入2.5ul链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(500U/ml)结合到10ml2xSSPE/0.5%SDS中，将此溶液加入旋转瓶中42°C孵化薄膜45-60分钟。(12)用250ml的2xSSPE/0.5%SDS溶液42。C10分钟漂洗两次。(13)用250ml的2xSSPE在室温下5分钟漂洗膜两次。(14)加lml免疫印迹发光氨试剂A于一个5ml试管中，随后加入lml的试剂B，混合均匀。(15)将薄膜放置在塑料布或者包装膜内，滴加A、B混合液在膜上含有寡核苷酸和PCR产物杂交的区域，用塑料层覆盖膜，塑料薄膜封闭器封闭薄膜。(16)放置封闭好的薄膜于曝光储片夹内，放一张X光胶片在薄膜上(在胶片的左侧角打折为了以后辨认方向)，曝光30分钟。(17)取出X光胶片放入显影液中显影5分钟，然后用无离子水漂洗2分钟，随后转入定影液中定影5分钟，再用无离子水漂洗，充分洗去定影液后观察结果。(18)如果胶片上的信号太弱或太强，可延长或縮短曝光时间将薄膜直接曝光于另一张胶片。杂交过的PCR产物可以从膜上除去。一张膜可以重复利用大约15次。结果判定通过PCR扩增表1中列出的所有虫株的18SrRNA基因V4高变区域，产生的DNA片段和固定在薄膜上的寡核苷酸探针进行核酸杂交，寡核苷酸探针经光学发光作用，在胶片上产生一定强度的信号，所有的探针仅与它们各自的靶序列进行结合，不同的种、属和株之间没有交叉反应，很清楚的与相应的虫种或者株产生杂交信号。同时，为了检测设探针的特异性，选用了牛的东方泰勒虫和羊的基因组以及水分别做阴性和空白对照，结果显示，东方泰勒虫仅与梨形虫通用探针和泰勒虫通用探针进行了杂交，和其他的探针没有交叉反应的产生。每个泰勒虫种可以被三个核苷酸探针识别梨形虫通用探针(ca841-859)，泰勒虫通用探针(T-all811-832),和吕氏泰勒虫探针(T-1628-647)或尤氏泰勒虫探针(T-u678-697)。每个巴贝斯虫也可被三个探针识别梨形虫通用探针(ca841-859)、巴贝斯通用探针(B-all745-766)，和莫氏巴贝斯虫探针(B.m466一87)或巴贝斯虫未定种探针(及sp.Kashi637-655)。具体的检测结果参见图l，图中Ca为梨形虫通用探针(catchall);1_6道分别为泰勒虫通用探针，巴贝斯虫通用探针，莫氏巴贝斯虫探针，巴贝斯虫未定种探针，吕氏泰勒虫探针，尤氏泰勒虫探针；其中1-13排分别是莫氏巴贝斯(承德株)、莫氏巴贝斯虫(临潭株)、莫氏巴贝斯虫(宁县株)、莫氏巴贝斯虫(天祝株)、巴贝斯虫未定种(喀什株)、吕氏泰勒虫(渭源株)、吕氏泰勒虫(麻当株)、吕氏泰勒虫(宁县株)、尤氏泰勒虫(张家川株)、尤氏泰勒虫(隆德株)、东方泰勒虫(卢氏株)、羊基因组对照、水对照。根据建立的标准阳性试验，经过对部分患病羊的检测结果显示杂交反应后发现，所有感染有泰勒虫或者巴贝斯虫的样品均可看到一个或者多个种的杂交信号产生。同时，梨形虫通用的寡核苷酸探针(catch-all)可以表明，如果PCR产物与通用的探针发生杂交信号，而没有种特异性的探针产生杂交信号，则可以判断为一个新种或新的基因型的发现，同样，设计的泰勒虫属特异性探针(T-all)可以检测出样品所感染的所有的泰勒虫的存在，包括羊泰勒虫及不同的种，设计的巴贝斯虫属特异性探针(B-all)可检测出样品所感染的所有羊巴贝斯虫种的存在。同时，设计的四个种特异性探针(S.moto化5.spKashi;7:/wwera/z丽/;rw7e"^w/:)更加详尽的诊断动物所感染的虫种类别或者虫株，研究表明，本发明能够检测出目前已存在的所有羊梨形虫虫种。本发明表明，根据已报道的梨形虫18SrRNA基因序列设计梨形虫的通用性引物对和羊梨形虫种特异性寡核苷酸探针固定于BiodyneC薄膜上，将PCR方法和RLB方法相结合建立了一种特异，敏感的诊断方法，可以识别相应的梨形虫株，种或则属；其敏感性明显高于PCR方法和ELISA方法。通过对117份采集的六个不同地区的野外样品进行检测，并特异性引物扩增的PCR方法和ELISA方法进行比较，RLB的检出率明显高于其他两种方法，该方法可以检测出梨形虫的种类和混合感染的情况，为梨形虫病的检测、虫种鉴定和流行病学调查提供了工具。采用本发明对部分野外放养羊采集的血样检测，其结果见表2经对采用本发明方法检测为阳性的样品进行DNA序列测定，证明了其结果的正确性。从表2可见本发明的检出率明显高于现有的两种技术。另外，取样地区的疫情与检测结果是相关，这进一步证明了本发明可靠性。_阳性样品数_阳性率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2.部分野外样品检测结果权利要求1、一种用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜，其特征是在BiodyneC薄膜上固定有吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸。2、根据权利要求l所述的用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜，其特征是在BiodyneC薄膜上还固定有巴贝斯虫特异性寡核苷酸和泰勒虫通用特异性寡核苷酸。3、根据权利要求2所述的用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜，其特征在于在BiodyneC薄膜上固定的吕氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为atcttctttttgatgagttg，固定的尤氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为tgcattttccgagtgttact，固定的羊梨形虫特异性寡核苷酸序列为ctgtcagaggtgaaattct，固定的巴贝斯虫特异性寡核苷酸序列为ccttggtaatggttaataggaa，固定的羊巴贝斯虫未定种特异性寡核苷酸序列为cgggtttcgtctacttcgc，固定的莫氏巴贝斯虫特异性寡核苷酸序歹U为gaatgatgccgacttaaaccct。4、权利要求1所述的用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜的制备方法，其特征是分别人工合成出吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，将所得到的各寡核苷酸5'端用氨基团修饰，再将其分别共价结合到带有负电荷的BiodyneC薄膜上。5、权利要求2或3所述的用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜的制备方法，其特征是分别人工合成出巴贝斯虫特异性寡核苷酸、泰勒虫通用特异性寡核苷酸及吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，将所得到的各寡核苷酸5'端用氨基团修饰，再将其分别共价结合到带有负电荷的BiodyneC薄膜上。6、采用权利要求1至3所述的任一检测膜检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的方法，其特征是以待检测羊血提取的DNA模板，在泰勒虫和巴贝斯虫18SrRNA基因序列V4高变区两端的保守区域设计一对扩增出的片段大小为480bp-491bp的引物，其中一条引物用生物素标记，然后进行PCR扩增，获得生物素标记的PCR产物，生物素标记的PCR产物和固定在BiodyneC膜上的泰勒虫和巴贝斯虫的寡核苷酸进行杂交，再经增强化学发光孵育后将杂交后的膜放置曝光储片夹内，在薄膜上放X光胶片进行曝光，再对胶片进行显影和定影处理，根据胶片上产生的强度信号确定被检羊是否有患有相应的疾病。全文摘要本发明公开一种动物疾病检测用试纸，确切讲是一种用于检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫和羊梨形虫检测膜及其制备与使用方法。本发明用于检测吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和羊梨形虫的DNA检测膜是在BiodyneC薄膜上固定有吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸。文档编号C12Q1/68GK101550446SQ20091000148公开日2009年10月7日申请日期2009年1月7日优先权日2009年1月7日发明者任巧云,党志胜,关贵全,刘军龙,刘志杰,刘爱红,李有全,宏殷,牛庆丽,罗建勋,马米玲,高金亮申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所