专利名称：：一种苹果多酚抑菌临界浓度的简易测定方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种利用热活性检测仪测定苹果多酚抑菌浓度临界值的简易方法。
背景技术：
：苹果是我国四大水果之首，是人们食用多酚类物质的主要来源。"OneappleadaykeepsdQ.ctoraway"这句俗语充分说明了苹果的功效，而苹果多酚是苹果中的一大类具有强大生理功能的物质，苹果多酚是苹果中所含多元酚类物质的总称，在一些酿酒苹果品种中其含量高达7g/kgFW(鲜重计)，普通的鲜食品种中含量范围在0.52g/kgFW(鲜重计)。多酚包括原花青素类、黄酮醇类(槲皮苷配糖体)、羟基肉桂酸类、儿茶素类、花青素类和二氢查耳酮类(根皮苷配糖体)等，其主要多酚化合物结构式如图1(图1是苹果果实中主要多酚化合物分子结构式)所示。苹果中多酚的主要成分因品种、成熟度以及组织部位的不同而不同。成熟苹果的主要多酚类为儿茶素、原花青素及绿原酸类，而未成熟苹果中则含有较多的二氢查耳酮、黄酮醇类化合物。大量的研究表明苹果多酚具有多种药理功能如抗癌、抗氧化、抗动脉硬化、保护软骨与增强骨质、生发与乌发、保护视网膜、抗视力退化、抗菌、抗病毒、抗过敏、防龋齿、防辐射、防治冠心病与中风等心脑血管疾病。目前，国内外对苹果中多酚物质的研究主要集中在苹果汁加工过程中酚类物质的分析及其对果汁品质的影响，而对其抑菌作用的研究较少，目前主要采用牛津杯法、圆片滤纸法进行抑菌试验，确定抑菌最低浓度，但其稳定性差、灵敏度和准确度较低、不宜推广。为此必须寻找一种能快速、高效、灵敏的测定苹果多酚抑菌浓度临界值的简易方法。
发明内容本发明要解决的技术问题是苹果多酚临界抑菌浓度难以确定的难题，采用热活性检测仪提供了一种苹果多酚抑菌浓度临界值的简易测定方法。本方法适用于不同工艺条件制备的苹果多酚粗提物，与传统的抑菌实验方法如牛津杯法、圆片滤纸法相比具有直观、快速、量化、重现性好，自动化程度高等优点。其原理如下-细菌在生长代谢的指数生长期内，数量按指数规律增长，其数学表达式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(1)式中，t为指数生长期开始后的某一时间，t。为指数生长期开始的时间，nt和n。分别为t和t。时细菌的数目。假设每个细菌在代谢过程中的热输出功率(w)相同，则<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(3)式和(4)式中Pt为细菌生长热谱中指数生长期内t时刻的热功率，k就是细菌在指定条件下的生长速率常数，它的大小实际上就代表了细菌在指定条件下细菌生长代谢速率的快慢。如果从细菌生长热谱曲线中的指数生长期内取一系列InPtt数据，以InPt对t作图，由直线斜率可得生长速率常数k。本文计算出不同浓度C的药物作用下细菌的生长速率常数，用CurveExpert拟合出k-C关系曲线，从而求出细菌不生长k=0时的用药浓度C。，即临界生长用药浓度。本发明的技术方案包括如下步骤首先将苹果多酚采用10%甲醇配成浓度为10mg/mL的溶液。无菌操作下，用微量移液器取已灭菌的液体培养基lmL，放于无菌的安培瓶中，作为比较体系。取一只装有10mL液体培养基的试管，接入菌种，摇匀，然后取lmL此接种培养基，放入另一无菌的安培瓶中，作为研究体系。将2支安培瓶放入热活性检测仪中，预热30min，记录热谱图曲线，待曲线返回基线后，实验结束。保持其它条件不变，在lOmL培养基中分别加入不同体积的浓度为10mg/mL的多酚溶液，得到含不同浓度多酚溶液的培养基，然后接入菌种，摇匀，重复上述试验。最终由热活性检测仪给出一系列多酚作用下细菌的生长热谱图曲线，从生长热谱曲线中的指数生长期内取一系列lnPtt数据，以lnPt对t作图，由直线斜率可得生长速率常数k。不同浓度的多酚对应不同大肠杆菌的生长速率常数，用CurveExpert拟合出k-C关系曲线，令k=0，即可得到细菌不生长时的苹果多酚浓度C。，即苹果多酚抑菌浓度临界值。具体实施方案一苹果多酚抑制大肠杆菌临界浓度的测定1、苹果多酚浓縮液的制备将纯化后的苹果多酚提取物旋转蒸发、冷冻干燥后，定容为浓度10mg/mL的多酚浓縮液。2、空白对照的微生物热活性检测无菌操作下，用微量移液器取已灭菌的液体培养基lmL，放于无菌的安培瓶中，作为比较体系。取一只装有10mL液体培养基的试管，接入大肠杆菌菌种，摇匀，然后取lmL此接种培养基，放入另一无菌的安培瓶中，作为研究体系。将2支安培瓶放入热活性检测仪中，预热30min，记录热谱图曲线，待曲线返回基线后，实验结束。3、多酚作用下微生物的热活性检测保持其它条件不变，在lOmL培养基中分别加入不同体积的浓度为10mg/mL的多酚溶液，使培养中多酚溶液的最终浓度分别为Omg/mL、0.1057mg/mL、0.2114mg/mL、0.3171mg/mL、0.4228mg/mL，然后分别接入菌种，摇匀，重复上述试验。4、临界值的计算从生长热谱曲线中的指数生长期内(如图2所示图2是308K时大肠杆菌在不同多酚浓度抑制作用下指数生长期的热谱图)取一系列InPtt数据，以lnPt对t作图，由直线斜率可得生长速率常数k。不同浓度的多酚对应不同大肠杆菌的生长速率常数如表1所示，由表1中的数据，用CurveExpert拟合出k-C关系曲线，可以得到其生长速率常数与用药浓度的直线关系为k=0.01826_0.01172Cr=0.9976根据此关系式可推得苹果多酚抑制大肠杆菌生长的临界剂量C。，即k=0时，C。=1.5580mg/mL。表1大肠杆菌在不同多酚浓度作用下的生长速率常数<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求1、采用一种苹果多酚抑菌浓度临界值的简易测定方法，其特征在于，细菌在生长代谢的指数生长期内，数量按指数规律增长，假设每个细菌在代谢过程中的热输出功率相同，则细菌在指定条件下的生长速率常数实际上就代表了细菌在指定条件下细菌生长代谢速率的快慢。从细菌生长热谱曲线中的指数生长期内取一系列数据，以功率的对数对时间作图，由直线斜率可得生长速率常数。计算出不同浓度苹果多酚作用下细菌的生长速率常数，用CurveExpert拟合出生长速率常数和苹果多酚浓度关系曲线，从而求出细菌不生长，即生长速率常数为0时的苹果多酚浓度，即苹果多酚抑菌浓度临界值。2、根据权利要求1所述的采用一种苹果多酚抑菌浓度临界值的简易测定方法，其特征是，具体实现过程为将苹果多酚配制成一定浓度的浓缩液，进行空白对照和样品的微生物热活性检测，最后进行计算，确定苹果多酚抑菌浓度临界值。3、根据权利要求1或2所述的采用一种苹果多酚抑菌浓度临界值的简易测定方法，其特征是微生物热活性与浓度成正相关性。4、根据权利要求1或2所述的釆用一种苹果多酚抑菌浓度临界值的简易测定方法，其特征和方法为1)苹果多酚采用10%甲醇溶液，定容至10mg/mL的溶液。2)采用热活性测定仪测定空白对照的微生物热活性，记录热谱图曲线。3)采用热活性测定仪测定不同浓度苹果多酚作用下微生物的热活性，记录热谱图曲线。4)通过微生物的生长速率常数，确定苹果多酚抑菌浓度临界值。全文摘要本发明公开了一种苹果多酚抑菌临界浓度的简易测定方法。无菌操作下，取已灭菌的液体培养基1mL，放于无菌的安培瓶中，作为比较体系；取一只装有10mL液体培养基的试管，分别加入不同浓度的多酚溶液，接种，摇匀，然后取1mL此接种培养基，放入另一无菌的安培瓶中，作为研究体系。将2支安培瓶放入热活性检测仪中，预热30min，记录热谱图曲线。从生长热谱曲线中的指数生长期内取一系列lnP<sub>t</sub>～t数据作图，由直线斜率可得生长速率常数k。不同浓度的苹果多酚对应微生物不同的生长速率常数，拟合k-C关系曲线，令k＝0，即可得到微生物不生长时的临界浓度C<sub>0</sub>。本方法适用于大多数细菌，与传统的抑菌实验方法相比具有直观、快速、量化、重现性好、自动化程度高等优点。文档编号C12Q1/18GK101525652SQ20091000067公开日2009年9月9日申请日期2009年1月14日优先权日2009年1月14日发明者孙建霞,孙爱东,孙红男,白卫滨,胡晓丹申请人:孙爱东