专利名称：：用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法
技术领域：
：本发明涉及一种制取菜籽肽的方法，具体地说涉及一种在Na2S03作用下，使用蛋白酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法。
背景技术：
：菜籽是重要油料作物，世界年产量已超过4000万吨，我国是世界上产量最大的菜籽生产国。菜籽提油后的粕中含有40—50%的蛋白，且菜籽蛋白氨基酸组成平衡，因此菜籽粕可能成为食用蛋白的合适来源。但菜籽粕中存在硫代葡萄糖甙，植酸和多酚类等抗营养因子，只有尽量降低或除去这些物质，才能使菜籽粕作为食用蛋白来源。近年来，植物蛋白水解物被认为是生物活性肽的来源，它们易于被大肠细胞吸收进入血液，产生有益的生理作用。已报道的生物活性肽具有免疫调节、抗菌、抗血栓形成和降血压等生理功能。制取多肽的传统方法是先通过碱提取酸沉淀法制取分离蛋白，再使用不同的蛋白酶将分离蛋白水解制取肽。由于菜籽蛋白成分复杂，难溶于水，通常需要使用pHll以上的强碱提取；加之菜籽蛋白等电点范围广，提取后加酸调节等电点析出的分离蛋白得率较低。CN1884572A号专利文献公开了"一种用菜籽粕直接酶水解制备菜籽肽的方法"，该方法使用酸性水对菜籽粕进行浸泡和洗涤以脱除植酸、硫甙等抗营养物质，并直接用酶水解菜籽粕制取菜籽肽。该方法与先制取菜籽蛋白，再用酶水解菜籽蛋白制取菜籽肽的传统方法相比，简化了工艺过程。但酸性水在脱除植酸、硫甙等抗营养物质的同时，也带走了部分可溶性蛋白，产生了较多的废水。
发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术存在不足，提供一种水解速度快、蛋白损失少、产品色泽好的酶水解菜籽粕制取菜籽肽的新方法。我们研究发现，在蛋白酶水解菜籽粕时加入低浓度的Na2S03水溶液可以显著加快水解速度，提高蛋白水解度。由于Na2S03作为一种还原剂能够断裂蛋白质分子间和分子内的二硫键，使得断裂后的菜籽蛋白分子更容易与蛋白酶接触而提高酶水解速率和水解度，同时Na2S03断裂二硫键的作用，也破坏了菜籽蛋白中存在的蛋白酶抑制剂分子，使之失去对于蛋白酶活性的抑制作用。Na2S03对蛋白酶水解菜籽粕的加速作用已经水解曲线和蛋白水解物的凝胶层析图证实。Na2S03作为还原剂还能防止菜籽粕中的多酚在水解过程中氧化，从而使得到的菜籽肽颜色较淡。此外，本发明在水解后采用膜分离技术可以同时去除硫甙、植酸等抗营养物质和无机盐，减少蛋白损失。本发明的目的是这样实现的一种用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，包括利用蛋白酶对菜籽粕进行水解、灭酶、离心除去不溶物、再经超滤和干燥获得菜籽肽，其特征在于:将菜籽粕粉碎后加入Na2S03水溶液，经酶水解得到菜籽肽。在本发明中具体制取菜籽肽的过程是a)将菜籽粕粉碎过60100目筛，将其与0.1%~0.6%的Na2S03水溶液一起加入到反应容器中，使基质浓度为5~10%w/v，混合后置于水浴加热至蛋白酶的反应温度，并根据蛋白酶的反应条件调节pH值；b)加入蛋白酶，使蛋白酶与基质比为1~6%,在搅拌下水解菜籽粕，得到菜籽蛋白水解物；c)调节水解物的pH至4.0~4.5并维持30min灭酶，或加热至80。C100。C并维持5~15min灭酶；d)将水解物离心除去不溶物得到上层清液；e)将上层清液超滤和透析过滤，滤去抗营养物质和无机盐；f)将未透过滤膜的溶液进行喷雾干燥得到菜籽肽。在本发明中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶，或中性蛋白酶，或木瓜蛋白酶，或风味蛋白酶。在本发明中超滤中使用滤膜的截留分子量^5000Da;所述抗营养物质为硫代葡萄糖甙、植酸和多酚类物质，所述无机盐为亚硫酸钠和氯化钠。在本发明中进行喷雾干燥时，热空气的进口温度为180°C，出口温度为85°C。本发明的优点在于由于Na2S03作为一种还原剂能够断裂蛋白质分子间和分子内的二硫键，使得断裂后的菜籽蛋白分子更容易与蛋白酶接触而提高酶水解速率和水解度，同时Na2S03断裂二硫键的作用，也破坏了菜籽蛋白中存在的蛋白酶抑制剂分子,使之失去对于蛋白酶活性的抑制作用，Na2S03作为还原剂还能防止菜籽粕中的多酚在水解过程中氧化，从而使制取的菜籽肽颜色较淡。图1是为本发明的工艺流程图2是Alcalase水解菜籽粕的水解曲线；图3是本发明制取的菜籽肽产物的凝胶层析图4是对照组制取的菜籽肽产物的凝胶层析图。具体实施例方式本发明用下列实施例进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。实施例1将菜籽粕粉碎过80目筛，再与0.25%的Na2S03水溶液一起加入到反应容器中，置于水浴加热至5(TC，用4NNaOH调节pH至8.0,再加入碱性蛋白酶Alcalase于搅拌下水解，酶水解参数为基质浓度5^w/v，酶与基质比3%，pH8.0，反应温度50。C。反应过程中加入4mol/L的NaOH维持pH值恒定，并用pH-stat法测定反应水解度(DH)。反应120min后用盐酸调节反应物pH至4.3，并于5(TC维持30min灭酶。将水解物以4000xg离心20min除去不溶物(粕渣)，得到上层清液。将上层清液用截留分子量为3000Da的膜进行超滤。膜面积为O.IM2，超滤液的温度为40QC，超滤后再进行透析过滤。最后将未透过滤膜的溶液进行喷雾干燥得到菜籽肽产物。喷雾干燥时热空气的进口温度为180QC,出口温度为85GC(本实施例的工艺流程如fe图lX按本实施例制取的菜籽肽产物的指标如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>实施例2用水代替实施例1中0.25。/。的Na2S03水溶液作为对照组，按上述相同的试验条件和步骤进行酶水解及水解后处理，得到的菜籽肽产物作为对照物。'水解时添加Na2S03(本发明，下同)以及不添加Na2S03(对照组，下同)的两组菜籽粕水解曲线一起记录在附图2中，从附图2显示的水解时间和水解度的相互关系可见，Na2S03对碱性蛋白酶Alcalase水解菜籽粕具有明显加速作用，在水解120min时，本发明与对照组的水解度分别为12.1%与7.7%，前者是后者的1.6倍。实施例3使用凝胶层析法测定实施例1制取的菜籽肽产物和实施例2中制取的对照物的分子量分布。在本实施例中，所用的凝胶柱为Superose1210/300GL(10x300mm,GEHealthcareBio-ScienceCo.，Piscataway,NJ，USA)，使用紫外检测器于215mn检测。洗脱液为pH等于7的0.15MNaCl的50mM磷酸盐缓冲液，样品液先经0.45pM膜过滤，进样量为50(^1，洗脱液流速为0.8ml/min。取牛血清蛋白(67000Da)、细胞色素(12700Da)、VB12(1355Da)和氧化型谷胱甘肽(612Da)为分子量标准。测试结果分别纪录在附图3和附图4中。附图3中10000Da以上的峰面积仅占7.8%，而附图4中10000Da以上的峰面积占了33.5%，说明本发明制取的菜籽肽产物中的蛋白质和大分子肽的数量小于对照组制取的菜籽肽。可见，用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽能够明显提高菜籽蛋白的水解度，使得水解物的分子量减小。具体实施时，所述的蛋白酶不仅可以采用碱性蛋白酶，还可以选择中性蛋白酶，或木瓜蛋白酶，或风味蛋白酶等蛋白酶，在选择不同的蛋白酶时，应该根据本领域熟知的基本常识，按照不同蛋白酶的使用条件，调节菜籽粕水解的温度和pH值，以满足蛋白酶对菜籽粕进行酶水解的条件，同时在权利要求的范围内选择适当的基质浓度和蛋白酶与基质比，充分发挥蛋白酶的作用，提高蛋白酶的利用率。灭酶时，可以通过调节水解物的pH至4.0-4.5并维持30min灭酶，或加热至80'C100"C并维持5-15min权利要求1、一种用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，包括利用蛋白酶对菜籽粕进行水解、灭酶、离心除去不溶物、再经超滤和干燥制取菜籽肽，其特征在于将菜籽粕粉碎后加入Na2SO3水溶液，经酶水解得到菜籽肽。2、根据权利要求1所述的用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，其特征在于制取菜籽肽的方法是a)将菜籽粕粉碎过60100目筛，将其与0.1%~0.6%的Na2S03水溶液一起加入到反应容器中，使基质浓度为5~10%w/v，混合后置于水浴加热至蛋白酶的反应温度，并根据蛋白酶的反应条件调节pH值；b)加入蛋白酶，使蛋白酶与基质比为1~6%，在搅拌下水解菜籽粕，得到菜籽蛋白水解物；c)调节水解物的pH至4.0-4.5并维持30min灭酶，或加热至80。C100。C并维持515min灭酶；d)将水解物离心除去不溶物得到上层清液；e)将上层清液超滤和透析过滤，滤去抗营养物质和无机盐；f)将未透过滤膜的溶液进行喷雾干燥得到菜籽肽。3、根据权利要求2所述的用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，其特征在于所述的蛋白酶为碱性蛋白酶，或中性蛋白酶，或木瓜蛋白酶，或风味蛋白酶。4、根据权利要求2所述的用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，其特征在于超滤中使用滤膜的截留分子量^5000Da;所述抗营养物质为硫代葡萄糖甙、植酸和多酚类物质，所述无机盐为亚硫酸钠和氯化钠。5、根据权利要求24之一所述的用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，其特征在于:进行喷雾干燥时，热空气的进口温度为180°C，出口温度为85°C。全文摘要本发明涉及一种用亚硫酸钠加速酶水解菜籽粕制取菜籽肽的方法，包括利用蛋白酶对菜籽粕进行水解、灭酶、离心除去不溶物、再经超滤和干燥得到菜籽肽，其特征在于，将菜籽粕粉碎后加入Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub>水溶液，经酶水解得到菜籽肽。其优点是Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub>作为一种还原剂能够断裂蛋白质分子间和分子内的二硫键，使得断裂后的菜籽蛋白分子更容易与蛋白酶接触，提高酶水解速率和水解度，同时也破坏了菜籽蛋白中存在的蛋白酶抑制剂分子，使之失去对于蛋白酶活性的抑制作用；Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub>作为还原剂还能防止菜籽粕中的多酚在水解过程中氧化，从而使得到的菜籽肽颜色较淡。文档编号C12P21/06GK101509029SQ20091002532公开日2009年8月19日申请日期2009年3月23日优先权日2009年3月23日发明者严梅荣,王丹丹,鞠兴荣申请人:南京财经大学