专利名称：模拟ibdv多表位基因的分子设计及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及模拟传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位基因epis的分子设计、 序列(包括epis部分以及n次重复序列)、表达质粒构建以及疫苗制备方法，属于生 物制药领域。
二背景技术：
传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵害幼鸡 淋巴组织，特别是中枢免疫器官一法氏囊为主要特征的传染病。该病在国内外广泛流 行，其危害主要包括两个方面 一是引起3 8周龄的鸡发病和死亡，尤其是近年来超 强毒株(vvIBDV)的出现使雏鸡死亡率大大增加；二是雏鸡早期感染本病，则引起 免疫抑制，导致鸡群对其它疫病的易感性增高和对疫苗的免疫应答能力降低或失败， 造成巨大的间接经济损失。
IBDV属双RNA病毒科，基因组包括大(A)小(B)两个片段，已确认有五种 病毒蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4禾BVP5。 VP1为病毒自身编码的依赖RNA的RNA 聚合酶，由B片段编码。其它四种病毒蛋白由A片段编码，VP2和VP3是病毒的主 要结构蛋白，构成病毒衣壳，VP2相对含量较多，中和抗原表位主要存在于VP2上， 且多为构象依赖性，用构象依赖性中和抗原表位诱导的中和抗体能被动地保护宿主不 受IBDV感染，VP4为病毒自身蛋白酶，VP5的功能尚不明确。大肠杆菌表达的VP2 免疫原性较差，表明VP2的后加工过程对VP2的结构形成至关重要。
目前，IBD仍然是危害养鸡业的主要传染病之一，虽然研制了多种商品化的弱毒 疫苗和灭活疫苗，但其安全性和制造工艺尚有不尽人意之处，如为抵抗超强毒的攻击， 使用中强毒力的毒株研制活疫苗，给IBD的防制带来极大的隐患，灭活疫苗存在着抗 原制备的困难。因此，国内外学者一直在探索免疫原性好且安全性高的新型疫苗，先 后运用大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒以及核酸疫苗载体单独或者共同表 达了A片段cDNA、 VP2、 VP3和VP4基因。分析这些研究成果，从重组亚单位疫苗 到病毒载体疫苗以及核酸疫苗，有的不能产生中和抗体，有的则不能兼顾高保护力和 囊损伤问题，有的还存在着表达量低、保护率低、免疫程序复杂以及难以工业化标准 生产等缺点。
蛋白质分子上的抗原表位(亦称抗原决定簇)是蛋白质抗原性的物质基础。近年 来研究发现的模拟抗原表位，本质上是构象依赖性表位，虽然模拟表位的氨基酸顺序 与蛋白质分子一级结构的氨基酸顺序截然不同，却可以引起特异性的免疫反应，因此， 在免疫应答中的地位极为重要。用常规基因克隆表达方法研制的重组亚单位疫苗，尽 管人们采用多种方法进行复性，仍然难以完全恢复到天然的构象，导致部分构象依赖
3性抗原表位丢失，其中可能是中和抗原表位，从而影响到机体产生完全有效的保护性 免疫应答。IBDV的中和抗原表位主要存在于结构蛋白VP2上，均为构象依赖性，因 此，采用克隆表达IBDV病毒结构蛋白基因研制IBD基因工程疫苗的常规思路和方法， 使重组蛋白难以完成天然的蛋白质构象，导致部分构象依赖性抗原表位缺失或改变， 其中很多是重要的具有保护作用的中和抗原表位，从而影响到机体产生完全有效的保 护性免疫应答。对此，人们采用了不同的研究策略，例如，改变表达方法和表达系统、 对重组蛋白结构进行充分地复性等，这些措施采取后，蛋白质结构问题可能部分解决， 但又会出现表达量低、制备工艺复杂或生产成本高等新的问题。这表明，采用新的研 究思路和技术路线制备新型IBD基因工程疫苗的必要性与紧迫性。
发明内容
技术问题本发明针对IBD基因工程疫苗研究难点，将抗原表位免疫应答的分 子免疫学理论应用于基因工程疫苗研究，突破了以往采用克隆表达病毒结构蛋白基因 方法进行基因工程疫苗研究的传统思路和方法。制备IBDV中和表位与优势抗原表位 单克隆抗体，综合运用单克隆抗体与噬菌体展示随机肽库技术，分析IBDV保护性免 疫应答相关的中和抗原表位和优势抗原表位，设计合成具有免疫保护功能的模拟 IBDV多表位基因epis，制备IBDV表位基因工程疫苗。在进行epis分子设计时，由 于采用线性化序列模拟了 IBDV空间构象依赖性表位基序，因此大肠杆菌表达的重 组IBDV多表位蛋白rEPIS制备工艺简单、成本低、生物安全性高。
技术方案
模拟IBDV多表位基因epis，其特征在于，该基因的长度为471bp，编码155aa， 命名为epis，其序列为SEQIDNO.l。其所编码的多表位蛋白rEPIS，其氨基酸序列为 SEQIDN0.2。模拟IBDV多表位基因epis的重组表达质粒pET-epis，其构建方法为
化学合成上述IBDV多表位基因epis，用pMD18-T载体克隆，获得epis重组克 隆质粒pMD-epis，根据pET28b(+)启动子下游阅读框，将epis基因的克隆质粒 pMD-epis和pET28b(+)质粒用限制性内切酶Sacl和HindIII酶切，经琼脂糖凝胶电泳 后，回收pMD-epis的epis基因片段和pET28b的载体片段，用T4 DNA连接酶连接 两片段，转化大肠杆菌JM109，涂布于含终浓度为30pg/mL卡那霉素的LB琼脂平板 上，37。C培养14h，挑取单菌落，接种在3mL含kan的LB培养基中，振荡培养14h， 抽提质粒，酶切鉴定，获取阳性重组表达质粒pET-epis。
模拟IBDV多表位基因epis的重组表达质粒pET-epis转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得重组菌pET-epis/BL21 。培养诱导重组菌pET-epis/BL21 ， 10000 r/min高速离心20 min沉淀菌体，弃上清液，用pH7.2的PBS缓冲液悬浮菌体，置于0X:冰水浴，超声 波破碎菌体(超声功率500~600W、每次超声时间10min、重复2~4次)直至浑浊菌 液变为透明菌液，即为抗原重组模拟IBDV多表位蛋白rEPIS，用PBS调整抗原浓度 至1000pg/mL，抗原与白油佐剂按1:1配比，乳化，制备IBDV表位基因工程疫苗。 IBDV表位基因工程疫苗可在制备传染性法氏囊病诊断抗原方面的应用。
4有益效果本发明的特点和优点如下
IBDV基因组包括大(A)小(B)两个片段，编码5种病毒蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4和VP5。 VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白，也是病毒主要保护性抗原， 目前已知的IBDV中和表位主要存在于VP2上，为构象依赖性。用常规的分子克隆技 术直接克隆病毒结构蛋白，在原核或真核系统中表达，难以兼顾表达量、制备工艺和 生产成本等方面的问题。因此，如何使重组蛋白保持IBDV保护性免疫所必须的构像， 以形成有效的中和表位，成为IBD基因工程疫苗亟待解决的问题。
本发明针对IBD基因工程疫苗研究难点，将抗原表位免疫应答的分子免疫学理论 应用于基因工程疫苗研究，突破了以往采用克隆表达病毒结构蛋白基因方法进行基因 工程疫苗研究的传统思路和方法。运用IBDV单克隆抗体和噬菌体随机肽库获取IBDV 抗原表位基序，设计合成具有免疫保护功能的模拟IBDV多表位基因，利用线性序列 来模拟替代构象依赖性的中和表位序列，使基因工程方法表达的重组蛋白一级结构具 有所需的中和表位序列，把中和表位的构象依赖性转变成线性而使问题得到解决。此 外，由于单个抗原表位分子量小、结构简单，免疫原性弱，在体内易被降解，以往通 常采用表位肽与载体蛋白进行偶联的方法来提高免疫原性，用这种偶联蛋白免疫动物 产生的抗体绝大部分是针对载体蛋白的，本发明采用多个抗原表位模拟肽串联并重复 两次，构建模拟IBDV多表位基因epis，提高了重组蛋白的分子量、免疫原性和稳定 性。将设计的epis利用表达量高且生产工艺简便的大肠杆菌表达系统制备IBDV表位 基因工程疫苗。用SPF鸡进行免疫攻毒试验证明，重组多表位蛋白rEPIS可诱导机体 产生抗IBDV感染的保护性免疫应答，可用于制备IBDV表位基因工程疫苗，同时具 备良好的生物安全性。
在进行epis分子设计时，由于采用线性化序列模拟了 IBDV空间构象依赖性表位 基序，因此大肠杆菌表达的重组IBDV多表位蛋白rEPIS制备工艺简单、成本低、
生物安全性高。
本发明拓宽了IBDV基因工程疫苗的研究思路，不仅巨大的生产应用前景，而且 具有重要的理论意义。
四
图1模拟IBDV多表位基因epis序列
图2模拟IBDV多表位基因印is重组克隆质粒pMD-epis图谱 图3模拟IBDV多表位基因epis重组表达质粒pET-epis图谱
五具体实施例方式
本发明是制备IBDV中和表位与优势抗原表位单克隆抗体，综合运用单克隆抗 体和噬菌体随机肽库技术，获取IBDV抗原表位基序，根据表位基序进行分子设计、 化学合成模拟IBDV多表位基因epis，运用基因工程技术构建重组表达质粒pET-epis， 使epis基因在大肠杆菌中获得高效表达，然后以大肠杆菌表达的重组IBDV多表位蛋 白rEPIS作为抗原，加上相应的佐剂制成IBDV表位基因工程疫苗。本发明采用的具体技术路线包括以下三个方面
1.模拟IBDV多表位基因epis的分子设计、表达质粒构建以及在大肠杆菌 中的表达
1) 抗IBDV单克隆抗体免疫活性分析
通过单克隆抗体对应抗原表位分析与单克隆抗体病毒中和能力的测定两个试验 鉴定抗IBDV单克隆抗体的免疫活性，筛选IBDV中和表位单抗与优势抗原表位单抗。
(1) 单克隆抗体对应抗原表位分析
采用间接ELISA相加实验。将腹水单克隆抗体分别稀释至达饱和时的工作浓度， 在此浓度下各取50%两两混匀。分别测定混合的单克隆抗体及饱和浓度下单一腹水单 克隆抗体的爿45o值。计算加成指数AM2Ah2/(A!+A2)—1]x100X (Ai、八2分别为两
株不同单克隆抗体所测的J45G值，Ai+2为两两混合抗体所测的山5()值)，每组重复试
验3次，计算其平均值。Al值^50。/a寸，认为两种单克隆抗体识别不同的抗原表位。 相加间接ELISA结果表明，单克隆抗体HNF1、 HNF7、 B34、 2B1和2G8与不同的 IBDV抗原表位反应(单克隆抗体HNF1、 HNF7、 B34、 2B1和2G8均为公知公用见 参考文献l王军，李银，范红结，周宗安，施正良，王永山(通讯作者).传染性法氏 囊病病毒抗原表位分析——单克隆抗体的制备与鉴定.中国预防兽医学报， 2005,27(3):171-174; 2陈光华，蒋桃珍，董琳琳，龚人雄.鸡传染性法氏囊病病毒单 克隆抗体的研究.中国兽药杂志，2000,34(3):9-13)。
(2) 单克隆抗体病毒中和能力的测定
采用固定病毒-稀释抗体的中和试验法分析单克隆抗体对IBDV的中和能力。用 MEM营养液(GIBCO公司产品)将IBDV病毒培养物(购自中国兽医药品监察所兽 医微生物菌种保藏管理中心，毒种编号cvccAV8)稀释成200 TCIDWO.lml，将无菌 采取的各单克隆抗体腹水分别用MEM营养液从1:100起10倍比连续稀释，取每个稀 释度的单克隆抗体溶液0.1 ml加入0.1 ml病毒液(200 TCID5o)， 37 'C感作1 h，然后 加入到预先做好的鸡胚成纤维细胞(CEF)(用中牧集团乾元浩生物股份有限公司南京 生物药厂SPF鸡胚制备，制备方法文献殷震，刘景华主编.动物病毒学(第二版). 北京科学出版社，1997， 223.)单层培养孔中，于37'C、 5% (302和饱和湿度条件 下继续培养接种后的CEF，观察CEF生长情况。试验同时设立IBDV病毒、IBDV阳 性血清(购自中国兽医药品监察所)、SPF鸡血清(购自中牧集团乾元浩生物股份有限 公司南京生物药厂SPF鸡)、腹水和MEM营养液空白对照。在病毒中和试验中，单 克隆抗体B34和2G8对病毒有较强的中和能力，腹水单抗的中和效价为105，而单克 隆抗体HNF1、 HNF7和2B1则没有明显的中和能力，是IBDV优势抗原表位，腹水 单抗的病毒中和效价小于102。
2) 传染性法氏囊病病毒抗原表位基序的获取
用纯化的抗IBDV中和表位与优势抗原表位单克隆抗体HNF1、 HNF7、 B34、 2B1和2G8分别包被ELISA微孔板，浓度100|iig/ml， 15(HiL/ L， 4。C过液，用1%牛血清 白蛋白(BSA)封闭，PBST (含0.1% Tween-20 )洗涤6遍，加入含2xl010 pfii噬 菌体展示随机12肽库原液(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit试剂盒的组 成部分，该试剂盒购自NEW ENGLAND 8101^^@公司)，室温置lh; PBST洗涤10 遍；用100i!L0,2mol/LGly-HCl(pH2.2)洗脱8min;加入15pL lmol/L Tris-HCl (pH9.1 ) 中和洗脱液。用常规方法滴定洗脱液中的噬菌体，计算噬菌体的产出率产出率(％) =洗脱噬菌体数(Output) /淘洗用噬菌体数(Input) xl00%。将洗脱液接种到20mL 新鲜培养的大肠杆菌ER2738 (该菌株是Ph.D,12TM Phage Display Peptide Library Kit 试剂盒的组成部分)培养液中，37。C振荡培养4.5h， 4°C、 10000r/min离心lOmin， 收集上清液，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液(含20% PEG,o和2.5mol/LNaCl)， 4°C 过液，4°C、 10000 r/min离心15 min,用lmL TBS重悬沉淀，按照上述方法用 PEG/NaCl再次沉淀，最终用200pL TBS重悬沉淀，滴定后置4'C保存。将单克隆抗 体的包被浓度降低至50pg/mL，洗涤用的PBST中Tween-20的浓度提高到0.5%，按 上述步骤再淘洗2次。经过3次淘洗后，从每株单克隆抗体筛出的噬菌斑中随机挑取 单克隆蓝色噬菌斑12个，扩增。用夹心ELISA、单克隆抗体竞争抑制ELISA和IBDV 竞争抑制ELISA等免疫学方法分析筛选肽与IBDV抗原表位的相关性。根据ELISA 和竞争抑制试验分析结果，从每株单克隆抗体挑出的12个单克隆蓝色噬菌斑中选定 10个，制备单链DNA模板，测序，分析单克隆抗体对应的抗原表位12肽优势序列。 5株IBDV单克隆抗体对应的抗原表位12肽优势序列为
HNF1 CCT AAG ACT CAT AAT TCT GGT CGT TCT AAT GTG GAT
PKTHNSGRSNVD HNF7 ACG CTT CAT CTG CCG CAT TTG TGG CGG CCT CTT TCT
TLHLPHLWRPLS B34 CAT AAT GCG AAG TAT GTG TCG GCT GAG TCT TGG GGG
HNAKYVSAESWG 2B1 CAT CCG GAT AGT ATT CAT CCG TTT CTG GCG TCT CCT
HPDSIHP.FLASP 2G8 GAT ACT CTT CAT GGG CAT GGT TTT ACT AAT TGG TTT
DTLHGHGFTNWF
(1) 噬菌体短肽的ELISA检测方法的操作步骤分别以5株单克隆抗体HNF1、 HNF7、 B34、 2B1和2G8包被ELISA板，包被浓度5ng/mL， 1。/。BSA封闭，加入对 应单克隆抗体筛出的单克隆噬菌体扩增培养物，室温放置60min，洗涤，加入HRP-羊抗M13单克隆抗体(Amersham Pharmacia Biotech公司产品)，进行间接ELISA。 检测在筛选12肽内是否存在IBDV单克隆抗体结合位点。以J值均大于1.00为阳性 判定标准。
(2) 单克隆抗体竞争抑制ELISA方法的操作步骤为验证筛选肽的特异性， 分别以5株单克隆抗体包被ELISA板，以对应游离的单克隆抗体作为竞争抑制物， 分别与对应单克隆抗体筛出的噬菌体培养物共同反应60min，洗涤，加入HRP-羊抗 M13单克隆抗体，进行竞争抑制ELISA。计算抑制率，分析筛选12肽与单克隆抗体 结合的特异性。以抑制率大于40%为阳性判定标准。(3) IBDV竞争抑制ELISA方法的操作步骤与上述单克隆抗体竞争抑制ELISA
相似，只是以游离的IBDV作为竞争抑制物，分别与对应单克隆抗体筛出的噬菌体培
养物共同反应。计算抑制率，进一步验证筛选12肽内的IBDV抗原表位。以抑制率
大于40%为阳性判定标准。
TOM^ O —未掺入竞争抑制物的^值一掺入竞争抑制物的^值扁0/
未掺入竞争抑制物的^值 ° 将上述5个12肽的氨基酸序列分别与GenBank中IBDV基因组A片段(GenBank
登录AF443294, AF362776, AF454945)和B片段(GenBank登录AF362774，
AF455136)编码蛋白的氨基酸序列进行比较，发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残
基L-A-S-P与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致，推测
2B1为线性表位；而HNF1、 HNF7、 B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨
基酸残基与IBDV基因组编码蛋白氨基酸残基相同之处，是构象依赖性表位。
3 )模拟IBDV多表位基因epis的分子设计
参照5株单克隆抗体对应的抗原表位优势序列设计模拟IBDV多表位基因epis， 方法是将5个抗原表位用GGGS四肽串联(HNF1-HNF7-B34-2B1-2G8)并重复一 次(HNF1-HNF7-B34-2B1-2G8-HNF1-HNF7-B34-2B1-2G8)，该模拟IBDV多表位基 因的长度为471bp，编码155aa，命名为印is，其序列为:
ATG CCT AAG ACT CAT AAT TCT GGT CGT TCT AAT GTG GAT GGT GGA GGT TCG ACG CTT
MPKTHNSGRSNVDGGGSTL CAT CTG CCG CAT TTG TGG CGG CCT CTT TCT GGT GGA GGT TCG CAT AAT GCG MG TAT
HLPHLWRPLSGGGSHNAKY GTG TCG GCT GAG TCT TGG GGT GGA GGT TCG CAT CCG GAT AGT ATT CAT CCG TTT CTG
VSAESWGGGSHPDSIHPFL GCG TCT CCT GGT GGA GGT TCG GAT ACT CTT CAT GGG CAT GGT TTT ACT AAT TGG TTT
ASPGGGSDTLHGHGFTNWF GGT GGA GGT TCG CCT AAG ACT CAT MT TCT GGT CGT TCT AAT GTG GAT GGT GGA GGT
GGGSPKTHNSGR'SNVDGGG TCG ACG CTT CAT CTG CCG CAT TTG TGG CGG CCT CTT TCT GGT GGA GGT TCG CAT AAT
STLHLPHLWRPLSGGGSHN GCG AAG TAT GTG TCG GCT GAG TCT TGG GGT GGA GGT TCG CAT CCG GAT AGT ATT CAT
AKYVSAESWGGGSHPDSIH CCG TTT CTG GCG TCT CCT GGT GGA GGT TCG GAT ACT CTT CAT GGG CAT GGT TTT ACT
PFLASPGGGSDTLHGHGFT AAT TGG TTT TAA TAG
NWF水 承
4)重组表达质粒pET-epis的构建及其在大肠杆菌中表达
公
化学合成IBDV多表位基因epis，用pMD18-T载体(购自大连宝生物TaKaRa 司)克隆，获得epis重组克隆质粒pMD-epis。根据pET28b(+)(购自Novagen公司) 启动子下游阅读框，将epis基因的克隆质粒pMD-epis和pET28b(+)质粒用限制性内 切酶Sad和HindIII酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收pMD-epis的epis基因片段(约 500bp)和pET28b(+)的载体片段(约5.3kb)，用T4 DNA连接酶连接两片段，转化大 肠杆菌JM109 (Novagen公司)，涂布于含终浓度为30吗/mL卡那霉素(kan)的LB
8琼脂平板上，37。C培养14h。挑取单菌落，接种在3mL含kan的LB培养基中，振荡培养14h，抽提质粒，酶切鉴定，获取阳性重组表达质粒pET-epis。
用pET-印is转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，获得重组菌pET-epis/BL21 ，挑取单菌落，接种在3mL含kan的LB培养基中，37。C振荡培养14h。次日，以1%接种在含kan的新鲜LB培养基中，37。C振荡培养2h后，向LB培养基中加入终浓度为lmmol/L的IPTG， 37。C继续培养4h，诱导生产重组IBDV多表位蛋白rEPIS。取1.5mL细菌培养液，高速离心，SDS-PAGE分析，扫描分析rEPIS的表达量与分子量。rEPIS的表达量约30%，分子量约20kDa。
5)重组IBDV多表位蛋白rEPIS免疫反应性分析
以免疫印迹法(Western-blotting)用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体进行平行试验，分析rEPIS的特异性和免疫反应性。方法是将诱导前后的重组菌pET-epis/BL21进行SDS-PAGE (分离胶浓度15%)，然后电转移到硝酸纤维膜(Amersham PharmaciaBiotech公司产品)上，将膜按泳道剪成条，用抗IBDV单克隆抗体HNF1、 HNF7、B34、 2B1、 2G8混合液和碱性磷酸酶(AP)标记的兔抗鼠IgG (购自南京生兴生物技术公司)先后与转移膜反应，显色，观察显色条带位置，分析rEPIS的特异性和免疫反应性。在用IBDV多克隆抗体(购自南京生兴生物技术公司)进行的平行对照试验中，只是用IBDV多克隆抗体和AP标记的羊抗兔(购自南京生兴生物技术公司)IgG替代对应抗体，其它与单克隆抗体试验相同。试验同步设BL21(DE3)和pET28b转化的BL21(DE3)菌对照。在免疫印迹试验中，IBDV单克隆抗体和多克隆抗体均可与rEPIS反应，在约20kDa处出现一条蛋白印迹，与SDS-PAGE的分析结果一致，表明rEPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。
2.表达重组IBDV多表位蛋白rEPIS的免疫攻毒实验
1) 免疫抗原的制备
用PBS调整重组IBDV多表位蛋白rEPIS的蛋白抗原浓度至至1000吗/mL，抗原与白油佐剂按l:l配比，乳化。
2) 动物分组与免疫
14日龄SPF来航鸡(中牧集团乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂)180只，随机分成3组rEPIS加佐剂免疫组、单用佐剂对照组和饲养对照组，60只/组，隔离饲养。rEPIS加佐剂免疫组，胸部肌肉注射佐剂型rEPIS免疫物，rEPIS的有效免疫剂量为50ng/只/次，单用佐剂对照组则只注射等体积的佐剂，均免疫注射2次，间隔7d;词养对照组中的鸡不进行免疫，只是与两个免疫组在相同条件下饲养。实验鸡每间隔7d经翅下静脉采血，以常规间接ELISA测定血清中IBDV抗体的效价。
3) 攻毒
在第2次免疫7d后，用1:100稀释的IBDV强毒株GX8/99 (参考文献崔治中，孙淑红，单忠芳，蒋玉雯，金文杰.鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株GX8/99株的致病性.病毒学报，2002, 18(2):162-166.)感染鸡法氏囊组织悬液在实验鸡的眼和鼻内各滴0.1mL (病毒量约200个ELD50)，实验观察7d，及时取出死亡鸡、剖解检查法氏囊变化，记录实验结果。4)免疫攻毒实验结果
用IBDV间接ELISA检测rEPIS免疫鸡血清抗体，第一次免疫7d后抗体效价为1:1600;第二次免疫7d后抗体效价升高到1:12800 (表1)。从攻毒后的第3d，单用佐剂和饲养对照两个组的攻毒鸡开始死亡，在7d的实验观察期间，单用佐剂对照组的发病率为83.3% (50/60)(发病率包括IBD临床症状阳性、法氏囊组织IBD病变阳性和IBDV检测阳性)、死亡率为35.0% (21/60)，饲养对照组的发病率为85.0% (51/60)、死亡率为36.7% (22/60);rEPIS加佐剂组攻毒后的发病率为0.0% (0/60)、死亡率为1.7%(1/60)、免疫保护率为98.3% (59/60)(表2)。攻毒实验结果表明，注射免疫100吗重组IBDV多表位蛋白rEPIS的SPF鸡(50吗/次><2次)能够抵抗IBDV强毒的攻击。表1重组IBDV多表位蛋白rEPIS免疫SPF雏鸡后的血清抗体检测结果
分组0了142128
rEPIS+佐剂100320012800256000512000
佐剂对照100100100100100
空白对照100100100100100
表2重组IBDV多表位蛋白rEPIS免疫SPF雏鸡的攻毒试验结果
分组抗攻毒时的抗体效价发病率#死亡率免疫保护率
rEPIS+佐剂128000.0%(0/60)1.7% (1/60)98.3% (59/60)
佐剂对照10083.3%(50/60)35.0% (21/60)_
空白对照100■85.0% (51/60)36.7% (22/60)_
#发病率包括IBD临床症状阳性、法氏囊组织IBD病变阳性和IBDV检测阳性。
3. IBDV表位基因工程疫苗的制备与使用
疫苗制备方法培养诱导重组菌pET-epis/BL21， 10000 r/min高速离心20 min沉淀菌体，弃上清液，用PBS缓冲液(pH7.2)悬浮菌体，置于O'C冰水浴，超声波破碎菌体(超声功率500~600W、每次超声时间10min、重复2~4次)直至浑浊菌液变为透明菌液，即抗原重组IBDV多表位蛋白rEPIS。用PBS调整抗原浓度至1000吗/mL，抗原与白油佐剂按1:1配比，乳化，即为IBDV表位基因工程疫苗。
疫苗使用方法肌肉注射0.2ml/只/次(rEPIS的有效含量50吗)，两周后进行第2次免疫，可使免疫鸡产生有效的抗IBDV抗体。SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
中国人民解放军南京军区军事医学研究所
<120>模拟IBDV多表位基因的分子设计及其应用<130> 说明书<160> 12
<170>Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221>模拟IBDV多表位基因epis序列<222> (1)..(471)<223><400> 1
atgcctaaga ctcataattc tggtcgttct aatgtggatg gtggagg"c gacgcttcat 60
ctgccgcatt tgtggcggcc tctttctggt ggaggttcgc ataatgcgaa gtatgtgtcg 120
gctgagtcU ggggtggagg Ucgcatccg gatagtattc atccgtttct ggcgtctcct 180
ggtggaggtt cggatactct tcatgggcat ggttttacta attggtttgg tggaggttcg 240
cctaagactc ataattctgg tcgttctaat gtggatggtg gaggttcgac gcttcatctg 300
ccgcatttgt ggcggcctct ttctggtgga ggttcgcata atgcgaagta tgtgtcggct 360
gagtcUggg gtggaggttc gcatccggat agtattcatc cgtttctggc gtctcctggt 420
ggaggttcgg atactcttca tgggcatggt tttactaatt ggttttaata g 471
<210> 2
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工合成<220>
<221> 多表位蛋白rEPIS
<222> (1)..(155)<223>
<400> 2
11Met Pro Lys Thr His Asn Ser Gly Arg Ser Asn Val Asp Gly Gly Gly15 10 15
Ser Thr Leu His Leu Pro His Leu Trp Arg Pro Leu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Ser His Asn Ala Lys Tyr Val Ser Ala Glu Ser Trp Gly Gly Gly Ser
35 40 45
His Pro Asp Ser lie His Pro Phe Leu Ala Ser Pro Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Asp Thr Leu His Gly His Gly Phe Thr Asn Trp Phe Gly Gly Gly Ser65 70 75 80
Pro Lys Thr His Asn Ser Gly Arg Ser Asn Val Asp Gly Gly Gly Ser
85 90 95
Thr Leu His Leu Pro His Leu Trp Arg Pro Leu Ser Gly Gly Gly Ser
100 105 110
His Asn Ala Lys Tyr Val Ser Ala Glu Ser Trp Gly Gly Gly Ser His
115 120 125
Pro Asp Ser lie His Pro Phe Leu Ala Ser Pro Gly Gly Gly Ser Asp
130 135 140
Thr Leu His Gly His Gly Phe Thr Asn Trp Phe145 150 155
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> IBDV单克隆抗体
<220>
<221> HNFl基因
<222> (1)..(36)<223>
<400> 3
cctaagactc ataattctgg tcgttctaat gtggat 36
<210> 412PRT
IBDV单克隆抗体
<211><212><213><220><221><222><223>
<400>Pro Lys1
<210><211><212><213><220>
HNFl抗原表位12肽优势序列("…(12)
4
Thr His Asn Ser Gly Arg Ser Asn Val Asp5 10
36
DNA
IBDV单克隆抗体<formula>formula see original document page 13</formula><400> 9
catccggata gtattcatcc gUtctggcg tctcct 36
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> IBDV单克隆抗体 <220>
<221> 2B1抗原表位12肽优势序列
<222> (1)..(12) <223>
<400> 10
His Pro Asp Ser lie His Pro Phe Leu Ala Ser Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> IBDV单克隆抗体
<220>
<221> 2G8基I大J
<222> (1)..(36) <223>
<400> 11
gatactcttc atgggcatgg ttttactaat tggttt 36
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213》 IBDV单克隆抗体 <220>
<221> 2G8抗原表位12肽优势序列
<222> (1)..(12) <223>
<400> 12
Asp Thr Leu His Gly His Gly Phe Thr Asn Trp Phe 1 5 10
1权利要求
1、模拟IBDV多表位基因epis，其特征在于，该基因的长度为471bp，编码155aa，命名为epis，其序列为SEQ ID NO.1。
2、 权利要求1所述模拟IBDV多表位基因epis的所编码的多表位蛋白rEPIS， 其氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
3、 权利要求1所述模拟IBDV多表位基因epis的基因工程应用。
4、 权利要求1所述模拟IBDV多表位基因epis的重组表达质粒pET-epis。
5、 根据权利要求4的所述模拟IBDV多表位基因epis的重组表达质粒pET-epis， 其构建方法为化学合成权利要求1所述IBDV多表位基因epis，用pMD18-T载体克隆，获得 epis重组克隆质粒pMD-epis，根据pET28b(+)启动子下游阅读框，将epis基因的克隆 质粒pMD-epis和pET28b(+)质粒用限制性内切酶Sacl和HindIII酶切，经琼脂糖凝胶 电泳后，回收pMD-epis的epis基因片段和pET28b的载体片段，用T4 DNA连接酶 连接两片段，转化大肠杆菌JM109，涂布于含终浓度为30ng/mL卡那霉素的LB琼脂 平板上，37t:培养14h，挑取单菌落，接种在3mL含kan的LB培养基中，振荡培养 14h，抽提质粒，酶切鉴定，获取阳性重组表达质粒pET-epis。
6、 权利要求4或5所述模拟IBDV多表位基因epis的重组表达质粒pET-epis转 化大肠杆菌BL21(DE3)而获得的重组菌pET-epis/BL21 。
7、 权利要求1所述模拟IBDV多表位基因epis的IBDV表位基因工程疫苗。
8、 根据权利要求7所述的IBDV表位基因工程疫苗，其制备方法为 培养诱导权利要求5所述的重组菌pET-epis/BL21 ， 10000 r/min高速离心20 min沉淀菌体，弃上清液，用pH7.2的PBS缓冲液悬浮菌体，置于Or冰水浴，超声功率 500 600W、每次超声时间10min、重复2~4次超声波破碎菌体直至浑浊菌液变为透明 菌液，即为抗原重组模拟IBDV多表位蛋白rEPIS，用PBS调整抗原浓度至1000ng/mL， 抗原与白油佐剂按l:l配比，乳化，即为IBDV表位基因工程疫苗。
9、 权利要求7或8所述IBDV表位基因工程疫苗在制备传染性法氏囊病诊 断抗原方面的应用。
全文摘要
本发明涉及模拟IBDV多表位基因的分子设计及其应用，属于生物制药领域。根据对免疫保护有效的抗原表位基序设计合成具有免疫保护功能的模拟IBDV多表位基因epis，运用基因工程技术构建重组表达质粒pET-epis，使epis基因在大肠杆菌中表达，然后以大肠杆菌表达的重组IBDV多表位蛋白rEPIS作为抗原，加上相应的佐剂制成IBDV表位基因工程疫苗，可用于预防控制传染性法氏囊病。在进行epis分子设计时，由于采用线性化序列模拟了IBDV空间构象依赖性表位基序，因此重组大肠杆菌表达的rEPIS制备工艺简单、成本低、生物安全性高。
文档编号C12N15/40GK101487011SQ20091002557
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月10日 优先权日2009年2月10日 公开号200910025577.发明者唐雨德, 夏兴霞, 张改平, 施正良, 银 李, 欧阳伟, 英 潘, 潘群兴, 王忠灿, 王晓丽, 王永山, 王选年, 诸玉梅, 谭维国, 陈光华 申请人:江苏省农业科学院;中国人民解放军南京军区军事医学研究所