专利名称：一种在杆状病毒—昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7蛋白的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在杆状病毒一昆虫表达系统生产德国 小蠊过敏原Bla g 7蛋白的方法。
背景技术：
过敏性疾病是人类重大疾病之一。其发病率目前估计约占世界人口的30 40%，而 且正以每年大于1%的速度增加，以儿童患者的发病率上升最为明显。在过去几十年， 过敏性疾病的发生率在全球有显著和迅速的增加，西方国家比发展中国家多，城市比农 村地区多。以过敏性哮喘(哮喘)为例，英国现有520万哮喘病人UO万儿童(占儿童 总人口的1/10)和410万成人(占成人总人口的1/12)，平均每年有1400人死于哮喘。根 据美国健康调查统计报告，2002美国约有3800万病人2190万成人，890万0 17岁 的儿童。2004年世界哮喘日会议报告指出在过去的20年内，哮喘的发病率在亚太地区 一些国家上升了近5倍，值得关注。我国近年来对全国的大规模调査显示，儿童哮喘发 病率比10年前明显增加，仅小儿哮喘患者达1000万之多，其中过敏为主要诱因(全国 哮喘儿童防治协作组2003)。此外，与癌症和心脑血管疾病不同，哮喘对人类社会和经 济的影响是不能简单地以其死亡率来衡量的，而要从这种疾病的发作频度来衡量其给人 类造成的经济负担。由于哮喘多发生在年轻人群，其对人类社会和经济的影响就更严重。 世界卫生组织认为哮喘造成的社会负担超过艾滋病与肺结核的总和，以英国为例就超 过了年88.9亿英镑。目前治疗过敏性疾病的方法主要体现在减轻症状。患者经常服用一 些抗组胺类以及类固醇药物以缓解症状，然后这些药物并不能抑制IgE抗体的产生并经 常带来副作用。近年来特异性免疫治疗(脱敏治疗)在过敏性疾病中的作用得到了肯定， 被认为是当前过敏性疾病唯一的对因治疗方法。该疗法是在确定患者的过敏原后，对患 者给予由低到高剂量的过敏原治疗。通过反复给药诱导其对此过敏原的耐受性，当再次 接触此类过敏原时就不产生或减轻过敏反应。然而，用于治疗的过敏反应提取物是从天 然来源分离得到的蛋白质和非蛋白质成分的粗混合物，这些资源或者含有大量与过敏原 无关的成分，或者几乎不含有造成患者高敏感性的过敏原。在最近几年，随着杂交瘤技 术的进展，可以利用基于单克隆抗体的免疫试验对主要过敏原含量进行鉴定，由此导致 了在过敏反应提取物的标准化方面取得了重要进展，所有对一种特定的过敏反应提取物 敏感的患者都继续接受含全部提取物成分的相同的复杂混合物的治疗，但是这有可能导 致副作用的产生，这个副作用主要是由于对提取物中所有蛋白质成分具有抗性的另外的IgE抗体所引起。就过敏诊断而言，这种使用整个过敏反应提取物来进行皮肤测试的方 法妨碍了导致患者敏感的特殊过敏原的检测。针对这些缺点，许多研究人员采用生物化 学分离和纯化技术的方法得到单独的过敏原。然而，尽管这个方法对于过敏原的鉴定可 能有效，但却不足以制备工业规模上的过敏原。因为这个过程极其耗费人力，并且从昂 贵的自然资源中纯化出过敏原产量通常情况下都很低。基于这些原因，用于合成过敏原 蛋白质的重组DNA技术引起了人们的注意。利用可生长在大发酵罐的微生物表达系统 可以大规模获得重组过敏原。因此，这些技术使得重组过敏原以一致纯度大量生产。除 此以外，使用重组DNA技术可以表达抗原表位片断或修饰的过敏原以方便应用于过敏 性疾病的诊断或处理。早在上世纪60年代，就有蟑螂引起哮喘的报道。但直到近年来， 蟑螂在哮喘发病中的作用才逐渐受到人们的关注。资料显示，美国哮喘患者中蟑螂过敏 的发生率达到27.5 42%，欧洲为3.9 24.5%，非洲为30 44.6%，在我国，北京、上 海等大城市中儿童哮喘患者的蟑螂过敏率也高达27.8~43.8%。哮喘发病率的不断升高， 在很大程度上与蟑螂污染加剧有关，蟑螂已经成为仅次于尘螨的第二大过敏源。目前常 见的美洲大蠊和德国小蠊过敏原已经被鉴定出来，包括3种美洲大蠊过敏原和7种德国 小蠊过敏原被鉴定出来。这使得运用DNA重组技术生产蟑螂过敏原用于蟑螂过敏诊断 和治疗成为可能。德国小蠊的肌球蛋白，(German cockroach tropomyosin),简称BIag7 为德国小蠊主要过敏原。它是一种肌球蛋白，也是一种泛过敏原。约有40%的蟑螂过敏 病人对Blag7阳性。目前该过敏原在大肠杆菌和酵母菌中被表达，但是没有在杆状病 毒一 昆虫系统中表达的报道。杆状病毒一 昆虫细胞表达系统其表达产物的生物学特性与 天然产物相似，具有可糖基化、磷酸化、酰胺化、信号肽和蛋白切割等后加工修饰功能， 而且具有很高的克隆容量，表达产量高，细胞培养简单，适合大规模生产等优点，现已 被广泛的用于各种外源基因的表达。杆状病毒具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物， 相对于其他病毒载体，如腺病毒、痘病毒等载体而言，其安全性好。Blag7是来源于昆 虫(蟑螂)的蛋白，在昆虫细胞中表达能保证表达产物具有活性，蛋白质表达后修饰加 工，信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似。因 此是非常好的生产昆虫过敏原的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种在杆状病毒一昆虫表达系统生产德国小蠊 过敏原Blag7蛋白的方法。其蛋白与国外德国小蠊过敏原Blag7有两个位点的差异。 未解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
一种在杆状病毒一昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7蛋白的方法，包括如 下步骤
4(1) 从德国小蠊组织提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得德国小蠊 过敏原Blag7编码基因；
(2) 将该编码基因克隆到杆状病毒载体中，转化昆虫细胞以表达Blag7蛋白；
(3) 采用亲和层析方法对Bla g 7蛋白进行纯化，从而到德国小蠊过敏原Bla g 7蛋白。
步骤(1)中，所述的Blag7编码基因如SEQIDNo:l所示。 步骤(1)中，所述的Blag7编码基因，其所编码的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。 与国外来源的德国小蠊过敏原Bla g 7有两个位点氨基酸差异。分别是第6位为Met,而 不是Lys;第43位为Gin而不是Arg。
步骤(2)中，所述的杆状病毒载体为/^aW^7c/7TJ。
步骤(2)中，所述的昆虫细胞为#-9细胞。
步骤G)中，所述的亲和层析方法为Nickel亲和层析法。所述的Nickel亲和层析 具体包括如下步骤P0病毒以感染复数为1感染500mL sf9细胞，其细胞密度为 2xl06/ml，到细胞出现肿胀的时候收集细胞，超声裂解细胞，离心得到上清，上Nickel 亲和柱，用20mM Tris-HCl洗去非特异性结合蛋白，该Tris-HCl含有300mM NaCl和 5n/。(v/v)甘油，之后改用20mM Tris-HCl洗脱，该Tris-HCl含有300mM NaCl、 250mM咪 唑和5。/。(v/v)甘油，洗脱下的蛋白即为Blag7蛋白。
有益效果本发明方法通过杆状病毒一昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7 蛋白，从而避免在不同的表达系统中(例如细菌和酵母菌)对Bla g 7过敏原结构造成 影响的问题，并提供一种亲和层析的方法，解决天然Bla g 7过敏原纯化工艺复杂的问 题。
图1为重组Bacmid的PCR鉴定。其中1、 2、 3为鉴定阳性的重组Bacmid。
图2为重组Bacmid的转化到昆虫细胞Sf9后，诱导表达蛋白的免疫印迹(western blot)鉴定。其中，1.上清；2.细胞裂解物；3.质粒Bacmid感染的sf-9 (阴性对照)。
图3为重组Bacmid诱导表达及其纯化的SDS-PAGE图谱。其中1.质粒bacmid 感染的sf-9; 2.重组质粒感染的Sf-9全细胞裂解物；3.细胞裂解物离心后沉淀；4.细 胞裂解物离心后上清；5.上清上Nickel柱后穿透峰；6.用20mM Tris-HCl (含有300mM NaCl, 5%甘油，pH8.0)洗下的蛋白；7.用20mMTris-HCl (含有300mMNaCl 5%甘 油，20mM咪唑，pH8.0)洗脱后的蛋白；8-12.用20mMTris-HCl (含有300mMNaCl 5%甘油，250mM咪唑，pH8.0)洗脱下的蛋白；13. Ni亲和胶上残留蛋白。
图4为纯化后的蛋白(Blag7)电泳图。其中，1.用20mM Tris-HCl (含有300mMNaCl， 5%甘油，250mM咪唑，pH8.0)洗脱下的蛋白；2在20mM Tris-HCl (含有300mM
NaCl，5。/。甘油)中透析后的蛋白。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例l:德国小蠊总RNA的提取。
取人工饲养的冻存德国小蠊(来自江苏省疾病控制中心)，液氮研磨，按照100mg/mL Trizol试剂加入Trizol试剂。提取德国小蠊总RNA。
实施例2: PCR扩增出德国小蠊过敏原Blag 7的基因并克隆。
将提取出来的总RNA反转录为cDNA。根据已发表的德国小蠊过敏原Bla g 7基因 序列设计引物5'-ATGGATGCCATCAAGAAGATG-3，禾tl 5'-TTAGTTGCCAATA AGTTGGGT-3'，用PCR方法(94。C预变性10分钟后，94°C30秒，55°C45秒，72°C1 分钟共35个循环)扩增出Blag7基因，并克隆到pMD18-T载体中，转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞中。涂板过夜培养。筛选阳性菌，抽提质粒PCR和测序鉴定。得到 德国小蠊过敏原Blag7基因，其核苷酸序列如SEQIDNo: 1所示。
实施例3:德国小蠊过敏原Bla g 7杆状病毒载体pFas但acHTA的构建。
将得到的Bla g 7基因通过EcoR I和Sal I酶切位点克隆到质粒pFastBacHTA中， 转化感受态JM109。筛选出阳性克隆。
实施例4:重组杆状病毒质粒(Bacmid)的构建及其PCR鉴定。
以含有Bla g 7基因的pFastBacHTA质粒转化感受态DH10Bac，在DH10Bac菌内 质粒助手的帮助下，Blag7基因可转座到含杆状病毒基因组的Bacmid大质粒上。得到 重组Bacmid。抽提重组Bacmid， PCR鉴定。结果见图1。
实施例5:'重组Bacmid的转化到昆虫细胞Sf9。
将PCR鉴定阳性的重组Bacmid，用Cellfectin试剂盒转染昆虫细胞Sf9。在HyQ 液体培养基中27'C培养7天后。收集上清得到PO病毒。对上清及细胞进行表达鉴定。 用His单抗做western blot，发现在35 50kDa之间有反应条带，表明Bla g 7蛋白被诱
导表达(图2)。
实施例6: Pl病毒扩增。
PO病毒以感染复数O.l感染100mLsf9细胞(2xl06/1111)，4天收集上清得到Pl病毒 (4 dpi)。
实施例7:大规模感染和纯化
PO病毒以感染复数为1感染500mLsf9细胞(2><106/ml)，到细胞出现肿胀的时候 收集细胞。超声裂解细胞离心得到上清。上Nickel亲和柱，用20mM Tris-HCl (含有 300mMNaCl， 5%甘油)洗去非特异性结合蛋白后，改用20mM Tris-HCl (含有300mM NaCl, 250mM咪唑,5%甘油)洗脱，洗脱下的蛋白即为Blag 7蛋白。SEQUENCE LISTING
<110〉江苏省人民医院
〈120〉 一种在杆状病毒一昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7蛋白的方法
〈130〉 JPH090220
〈160> 4
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
<211> 849
〈212〉 DNA
〈213〉 德国小蠊(German cockroach)
<220>
<221> CDS <222> (1)..(849)
<400> 1
gat gcc ate aag aag atg Asp Ala lie Lys Lys Met 1 5
gcg atg gat cgc gcc ctt Ala Met Asp Arg Ala Leu 20
ate egg gcc gag aag get lie Arg Ala Glu Lys Ala 35
ate cag cag att gag aat lie Gin Gin lie Glu Asn 50
caa gtc aax: gcc aag ctg Gin Val Asn Ala Lys Leu 65 70
atg cag gcg atg aag ctg gag aag gac aac 48 Met Gin Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp Asn 10 15
etc tgc gaa cag cag gcc cgc gac gcc aac 96 Leu Cys Glu Gin Gin Ala Arg Asp Ala Asn 25 30
gag gag gag gcc caa tec ctg cag aag aag 144 Glu Glu Glu Ala Gin Ser Leu Gin Lys Lys 40 45
ga/t ctt gat cag acc atg gag cag ttg atg 192 Asp Leu Asp Gin Thr Met Glu Gin Leu Met 55 60
gac gag aag gac aag gcc ctg cag aat get 240 Asp Glu Lys Asp Lys Ala Leu Gin Asn Ala 75 80
8gag agt gag gtc get gcc etc Glu Ser Glu Val Ala Ala Leu 85
aac cgc cga ate caa ctg ctg gag gag Asn Arg Arg lie Gin Leu Leu Glu Glu 90 95
288
gat ctt gag agg tct gag gaa Asp Leu Glu Arg Ser Glu Glu 100
cgt ttg gcc aca gcc acc gcc aag ttg Arg Leu Ala Thr Ala Thr Ala Lys匕eu 105 110
336
get gag get tec cag get gcc Ala Glu Ala Ser Gin Ala Ala 115
gat gag tea gag cga get cgt aag att Asp Glu Ser Glu Arg Ala Arg Lys lie 120 125
384
ctt gaa tec aaa ggc ctg gca Leu 'Glu Ser Lys Gly Leu Ala 130 135
gat gaa gag cgt atg gat get ttg gag Asp Glu Glu Arg Met Asp Ala Leu Glu 140
432
aac cag ctg aag gaa gcc agg Asn Gin Leu Lys Glu Ala Arg 145 150
ttc atg get gag gaa get gac aag aaa Phe Met Ala Glu Glu Ala Asp Lys Lys 155 160
480
tat gat gag gtc gca cgt aag Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys 165
ttg get atg gtt gag gcc gac ttg gaa Leu Ala Met Val Glu Ala Asp Leu Glu 170 175
528
aga gca gaa gag cgt gcc gag Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu 180
act ggt gaa tec aag att gtg gag ctt Thr Gly Glu Ser Lys lie Val Glu Leu 185 190
576
gag gaa gaa ctg cgc gtt gtc Glu Glu Glu Leu Arg Val Val 195
ggc aac aac ctg aag tec ctt gag gtg Gly Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val 200 205
624
tct gaa gag aag gcc aac ctg cgt gag gaa gag tac aag caa cag att Ser Glu Glu Lys Ala Asn Leu Arg Glu Glu Glu Tyr Lys Gin Gin lie 210 215 220
672
aag act ctg aat acc agg cta.agig gag get gaa get cgt get gag ttc Lys Thr Leu Asn Thr Arg Leu Lys Glu Ala Glu Ala Arg Ala Glu Phe 225 230 235 240
720
get gaa aga tec gtg cag aaa ttg cag ate agg ttg aca ggc ttg &gg Ala Glu Arg Ser Val Gin Lys Leu Gin lie Arg Leu Thr Gly Leu Arg 245 250 255
768atg aat tggMet Asn Trp
ctt gat atgLeu Asp Met275
tac acg aga aag gag aag tac aag tac att tgt gac gat 816
Tyr Thr Arg Lys Glu Lys Tyr Lys Tyr lie Cys Asp Asp260265 270
act ttc acc gaa ctt att ggc aac 849
Thr Phe Thr Glu Leu lie Gly Asn280
<210〉 2<211> 283<212> PRT
〈213〉 德国小蠊(German cockroach)<400> 2
Asp Ala lie Lys Lys Met Met Gin Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp Asn15 10 15
Ala Met Asp Arg Ala Leu Leu Cys Glu Gin Gin Ala Arg Asp Ala Asn20 25 30
lie Arg Ala Glu Lys Ala Glu Glu Glu Ala Gin Ser Leu Gin Lys Lys35 40 45
lie Gin Gin lie Glu Asn Asp Uu Asp Gin Thr Met Glu Gin Leu Met50 55 60
Gin Val Asn Ala Lys Leu Asp Glu Lys Asp Lys Ala Leu Gin Asn Ala65 70 75 80
Glu Ser Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg Arg lie Gin Leu Leu Glu Glu85 90 95
Asp Leu Glu Arg Ser Glu Glu Arg Leu Ala Thr Ala Thr Ala Lys Leu100 105 110Ala Glu Ala Ser Gin Ala Ala Asp Glu Ser Glu Arg Ala Arg Lys lie115 120 125
Leu Glu Ser Lys Gly Leu Ala Asp Glu Glu Arg Met Asp Ala Leu Glu130 135 140
Asn Gin Leu Lys Glu Ala Arg Phe Met Ala Glu Glu Ala Asp Lys Lys145 150 155 160
Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala Met Val Glu Ala Asp Leu Glu165 170 175
Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Thr Gly Glu Ser Lys lie Val Glu Leu180 185 190
Glu Glu Glu Leu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val195 200 205
Ser Glu Glu Lys Ala Asn Leu Arg Glu Glu Glu Tyr Lys Gin Gin lie210 215 220
Lys Thr Leu Asn Thr Arg Leu Lys Glu Ala Glu Ala Arg Ala Glu Phe225 230 235 240
Ala Glu Arg Ser Val Gin Lys Leu Gin lie Arg Leu Thr Gly Leu Arg245 250 255
Met Asn Trp Tyr Thr Arg Lys Glu Lys Tyr Lys Tyr lie Cys Asp Asp260 265 270
Leu Asp Met Thr Phe Thr Glu Leu lie Gly Asn275 280
<210〉 3
〈211〉 21
<212> 腿
〈213> Artificial
〈220〉
<223>根据己发表的德国小蠊过敏原Bla g 7基因序列设计引物
〈400〉 3
atggatgcca tcaagaagat g 21
<210> 4
<211> 21
〈212> DNA
<213> Artificial
<220〉
〈223〉根据已发表的德国小蠊过敏原Bla g 7基因序列设计引物
〈400〉 4
ttagttgcca ataagttcgg t 2权利要求
1、一种在杆状病毒-昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Blag 7蛋白的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)从德国小蠊组织提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得德国小蠊过敏原Blag 7编码基因；(2)将该编码基因克隆到杆状病毒载体中，转化昆虫细胞以表达Blag 7蛋白；(3)采用亲和层析方法对Blag 7蛋白进行纯化，从而到德国小蠊过敏原Blag 7蛋白。
2、 根据权利要求1所述的在杆状病毒一 昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7 蛋白的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的Blag7编码基因如SEQIDNo:l所示。
3、 根据权利要求l所述的在杆状病毒一昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g7蛋 白的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的Bla g 7编码基因，其所编码的氨基酸序列 如SEQ ID No:2所示。
4、 根据权利要求l所述的在杆状病毒一昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Blag7蛋 白的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的杆状病毒载体为p尸"w5ac//7^。
5、 根据权利要求l所述的在杆状病毒一昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7蛋 白的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的昆虫细胞为s/^细胞。
6、 根据权利要求l所述的在杆状病毒一 昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7蛋 白的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的亲和层析方法为Nickel亲和层析法。
7、 根据权利要求6所述的在杆状病毒一 昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7 蛋白的方法，其特征在于所述的Nickel亲和层析具体包括如下步骤P0病毒以感染复 数为1感染500mL sf9细胞，其细胞密度为2><106/ml，到细胞出现肿胀的时候收集细胞， 超声裂解细胞，离心得到上清，上Nickel亲和柱，用20mMTris-HCl洗去非特异性结合 蛋白，该Tris-HCl含有300mM NaCl和5%甘油，之后改用20mM Tris-HCl洗脱，该 Tris-HCl含有300mM NaCl、 250mM咪唑和5%甘油，洗脱下的蛋白即为Bla g 7蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种在杆状病毒—昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7蛋白的方法从德国小蠊组织提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得德国小蠊过敏原Bla g 7编码基因；将该编码基因克隆到杆状病毒载体，转化昆虫细胞以表达；采用亲和层析方法进行纯化，从而到德国小蠊过敏原Bla g 7蛋白。该蛋白与国外来源的Bla g 7蛋白有2个氨基酸位点的差异。本发明方法通过杆状病毒—昆虫表达系统生产德国小蠊过敏原Bla g 7蛋白，从而避免在不同的表达系统中(例如细菌和酵母菌)对Bla g 7过敏原结构造成影响的问题，并提供一种亲和层析的方法，解决天然Bla g 7过敏原纯化工艺复杂的问题。
文档编号C12N15/866GK101492692SQ20091002499
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者何韶衡, 魏继福 申请人:江苏省人民医院