专利名称：一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(mmlv-rt)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)的表达和纯化，特别涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)的可溶性表达及纯化方法。属生物化学领域。
背景技术：
RT-PCR作为重要的分子生物学研究手段，是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。由mRNA到cDNA的过程称为反转录，是由反转录酶(reversetranscriptase)催化反应的。反转录酶又称RNA指导的DNA聚合酶。是以RNA为模板合成DNA的酶，这种酶是1970年美国科学家特明(H.M.Temin)和巴尔的摩(D.Baltimore)分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。MMLV (来自Moloey鼠白血病病毒)是常用的反转录酶，是依赖于RNA的DNA聚合酶，有5'—3' DNA聚合酶活性。作为最常用的分子生物学产品，反转录酶(reverse transcriptase)市场需求量巨大，而天然反转录酶的提取技术复杂、产率低。目前，通过基因工程技术克隆的重组鼠白血病病毒逆转录酶在pET系统中表达量高，但是容易形成包涵体，纯化后只能得到很少量的活性蛋白。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，本发明通过载体构建将MMLV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温的条件下薩LV-RT与分子伴侣TF共表达，MMLV-RT蛋白的表达量可以提高到15%,而可溶性是常规方法表达的10倍。最后，利用六个组氨酸标签和肠激酶酶切来纯化得到逆转录酶(MMLV-RT)。
本发明是以如下技术方案实现的 一种重组鼠白血病病毒逆转录酶
(丽LV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是通过载体构建将MMLV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温条件下与分子伴侣共表达，来提高蛋白的表达量和可溶性。
所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(画LV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是将讓LV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温的条件下与分子伴侣共表达。
所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是将画LV-RT基因克隆到pET28a载体中实现共表达。
所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是将MMLV-RT和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中表达。
所述的MMLV-RT基因在低温条件下与分子伴侣共表达。所述构建的表达载体为pET28a-His6-EK(肠激酶)-醒LV-RT。所述表达的分子伴侣为TF和GroEL-GroES,醒LV-RT与分子伴侣TF 、
GroEL-GroES在宿主菌中共表达。
所述表达融合蛋白含六个组氨酸标签，用Ni-NTA纯化融合蛋白。所述表达的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的
可溶性表达及纯化方法，其特征是通过Ni-NTA纯化，再通过肠激酶酶切后得到
逆转录酶(MMLV-RT)。
所述表达宿主菌是i&c力eric/ iacoJi BL21 (DE3)。
本发明的优点是通过载体构建将MMLV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温的条件下MMLV-RT与分子伴侣共表达，使表达蛋白的可溶性大大增加。另外，组氨酸标签和肠激酶酶切位点的加入则使反转录酶的纯化更加简化、高效。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明
图l是融合蛋白His6-MMLV-RT在大肠杆菌中的表达图1A是重组表达载体pET28-MMLV-RT的质粒图谱图1B是重组His6-MMLV-RT蛋白表达的SDS—PAGE分析图2是逆转录酶表达条件的优化
图2A是低温发酵和分子伴侣共表达对逆转录酶可溶性的影响
图2B是在不同条件下，His6-MMLV可溶性和产量的比较
图3是纯化后His-麵LV-RT和麗LV-RT的SDS-PAGE (10%)分析
图4是纯化后的逆转录酶活性测定
图4A是起始转录速率测定
图4B是Atg7cDNA合成试验
图l、图2中
泳道l:蛋白marker(kD); -泳道2和3:分别为IPTG诱导的含有对照质粒pET28a和重组质粒pET28-MMLV-RT的BL21 (DE3)细胞裂解物细胞裂解物。
GroEL/ES +TF
总蛋白量％
相对总蛋白量
可溶性(％)
含有pET28-固LV-RT和pG-tf2的BL21 (DE3)的培养和处理如上所述，醒LV-RT、 TF和GroEL-GroES的表达条带如图所示。T、 S和I分别代表总蛋白、上清和沉淀。将单独在37。C表达的gro叩A中的总MMLV-RT (泳道1)设为1. 0，其表达总量占菌体总蛋白的15%,以此为参照，经过定量与校正，其它泳道的画LV-RT所占的比例如图下方所示，四环素的使用浓度为20Pg /1，IPTG为0. 6mM。
图2B在不同条件下，His6-MMLV可溶性和产量的比较SDS-PAGE凝胶灰度扫描分析MMLV-RT蛋白的可溶性和相应的产率
图3中纯化的His6-MMLV-RT和丽LV-RT蛋白样品用10% SDS-PAGE分析.M:蛋白分子量标准；泳道l:大量表达超声上清；泳道2: Ni2+-NTA穿过；泳道3:buffer C洗涤；泳道4: Buffer D洗脱液(1. 5 Pg);泳道5:对照，没加EK的洗脱液；泳道6: EK酶切的洗脱液(5 Pg);泳道7: Q离子交换穿过(3 Pg).
图4中逆转录反应在37"条件下进行。纯化的MMLV-RT(圆圈)和阳性对
—+—+
15141313
1. 00. 950. 870.87
563095
6照MMLV RT (Invitrogen Corp)(方框)的用量均为5 nM， poly(rA)-p(dT)12-18的浓度为25mM.每个反应重复三次，误差线表示标准误。
具体实施例方式
本发明通过重组MMLV-RT原核表达载体pET28a-MMLV-RT的构建，成功将密码子优化的MMLV-RT基因克隆至His6-tag编码序列的下游并与之处于同一阅读框，在His6-tag和廳LV-RT之间加入肠激酶的酶切位点，构建了融合蛋白MMLV-RT的的原核表达载体，测序结果表明阅读框及DNA序列全部正确。通过对比实验，发现在低温的条件下MMLV-RT与分子伴侣TF共表达，蛋白的表达量提高到15%，而可溶性是常规方法表达的10倍。通过镍亲和层析、EK酶切以及离子交换层析收穿过，得到了不带任何亲和标签的薩LV-RT。镍亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白，用肠激酶酶切后将不带任何冗余氨基酸的MMLV-RT与His6标签分离开，最后用离子交换层析去除EK和痕量的DNA，一升发酵液中得到了约23mg的MMLV-RT (纯度约95%)。 10% SDS-PAGE分析表明，纯化的MMLV-RT与理论分子量70kD相符。纯化的逆转录酶表现出禾n商品化酶相似的活性，比活约为2><105units/mg。
下面通过优选实例对本发明做更详细的论述。下述实验中的实验方法，如果无特殊说明，均属于常规方法。
1 、重组醒LV-RT原核表达载体pET28-画LV-RT的构建以合成醒LV-RT为模板，用PCR的方法扩增丽LV-RT编码序列，所用的正向引物为5' -CGGGATCCGACGACGACGACAAGATGGGGCAGCCCCTGC AAG-3'，反向引物为5' -CCGCGGCCGCTTAAGTCTCTGTGATGGCTGCC-3，。在正向引物中有一个BamHI的酶切位点(黑体)以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列(下划线部分)，反向引物中有一个Not I的酶切位点(黑体)。PCR反应的条件为94°C热变性一分钟，55。C退火一分钟，72。C延伸90秒，共进行25个循环。纯化的PCR产物采用BamH I和Not I进行双酶切，然后插入pET28a的多克隆位点。pET28a是一个T7系列的N端融合His6-tag的原核表达载体。对重组表达载体pET28a-MMLV-RT进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。
按照方法中所述的步骤，将密码子优化的顧LV-RT基因克隆至His6-tag编码序列的下游并与之处于同一阅读框，为了便于释放并纯化野生型的MMLV-RT，本发明在His6-tag和MMLV-RT之间设计并加入肠激酶的酶切位点，重组质粒经测序验证，成功构建了融合蛋白画LV-RT的的原核表达载体，阅读框及DNA序列全部正确，其简图参见图1A。2. MMLV-RT的表达
(1) 融合蛋白國LV-RT的表达
分别将MMLV-RT融合蛋白表达载体pET28a-MMLV-RT和对照载体pET28a 转入表达宿主菌五."//81^21(0￡3)，挑取单克隆接种至新鲜的1^液体培养基(含 50 mg/1的卡那霉素)。待细菌长至OD,为0.6左右，分别加入终浓度为0.6 mM 的IPTG诱导MMLV-RT的表达。诱导两个小时后收集菌体，处理后的菌体蛋白 样品走12% SDS-PAGE，使用UVP white/ultraviolet transilluminator对考马斯亮兰 染色的凝胶进行扫描记录，采用专业分析软件Grab-it 2.5和Gelwork分析目的 蛋白占菌体总蛋白的比例。
(2) 在不同的温度下，丽LV-RT和分子伴侣共表达 pG-TG是一个具有ColEl复制子、氯霉素抗性的原核表达载体。在四环素诱
导的启动子控制下能够同时表达大肠杆菌的伴侣分子TF和GroEL-GroES，该 载体由Hideki Yanagi博士 ( HSP Research Institute, Japan )惠赠[2]。将 pET28-MMLV-RT和pG-TG共同转入￡ co/z' BL21 (DE3),在双抗性的LB培养 基平板(含有50mg/l的卡那霉素和34mg/l的氯霉素)上筛选得到阳性克隆。
单克隆的过夜培养菌液分别接种至含有3ml液体LB的试管中,每只试管含有 50 mg/l卡那霉素和34 mg/l氯霉素，将上述试管均分成1,2,3和4组。l组和2组置 37t:摇床培养，3组和4组在28'C培养，转速为250rpm，在细菌生长至006()()约为 0.5时，向2组和4组的试管中加入终浓度为20 pg/l的四环素诱导分子伴侣的表达， 二十分钟后，向四组所有试管中加入终浓度为0.6 mM的IPTG诱导MMLV-RT的表 达，诱导后继续培养3个小时(l组和2组)或者5个小时(3组和4组)。
(3) 蛋白表达的分析和定量 为了比较在不同的表达条件下MMLV-RT可溶性的高低，收集数量相同的细
胞，而后用300 pl冰浴的PBS缓冲液重悬菌体，充分超声处理后，采用离心的方 法将细菌裂解物分成总蛋白、上清和沉淀三个组分，并跑12。/。SDS-PAGE。凝胶 的染色、扫描以及蛋白的定量如上所述。本文中，可溶性定义为可溶性的目的 蛋白/总的目的蛋白"00%。
在IPTG诱导后，出现了一条约为80 kD的蛋白条带，略高于MMLV-RT的理 论分子量，经凝胶扫描灰度分析，MMLV-RT约占菌体总蛋白的15。/。左右(图1B), 然而绝大部分MMLV-RT以包涵体的形式存在于胞质中。为了提高目的MMLV-RT 的可溶性及具有生物活性MMLV-RT的产率，本发明尝试了低温以及分子伴侣共 表达的方法。如图2A所示，MMLV-RT与分子伴侣TF禾B GroEL-GroES在37"C
8共表达,并没有明显提高MMLV-RT的可溶性；当降低发酵温度至28"C时，可溶形 式的MMLV-RT比例从原来的5%上升至30%;将MMLV-RT与分子伴侣TF和 GroEL-GroES在28。C共表达时，目的蛋白的可溶性骤增至95%，与37。C单独表达 相比，可溶性目的蛋白的产率提高了约10倍，SDS-PAGE灰度分析以及对纯化后 的目的蛋白的定量分析都确证了上述结果的可靠性(图2B)。实验中发现，分子伴 侣的超量表达仅仅略微降低了MMLV-RT总的表达水平，由于低温加分子伴侣对 目的蛋的可溶性贡献巨大，最终这一发酵策略还是极大地提高了自然折叠的 MMLV-RT的产量。由此得出结论低温发酵以及分子伴侣共表达都是必要的, 二者以协同作用的方式促进了在大肠杆菌内的可溶性表达，进而将其可溶性提高 了约10倍。
3、蛋白的纯化
收集一升发酵液的细胞，并用40 ml冰浴的bufferA (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0.5%Triton-X100, 10mM咪唑，10%甘油，pH7.4)重悬，超声裂解细胞，离 心取上清，上清通过buffer A预平衡的N产亲和柱，上样完毕用bufferA充分洗 涤至基线，而后用buffer B (20mM Tris-HCl, 300 mM NaCl， 80 mM咪唑，0.5% Triton-Xl00, 10%甘油，pH7.4)洗涤杂蛋白，最后用buffer C (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 250 mM咪唑，0.5% Triton-XlOO, 10%甘油，pH7.4)洗脱目的蛋白。
对于无His6亲和标签MMLV-RT的纯化，将结合了 His6-MMLV-RT的 Ni2+-NTA亲和介质用上述buffers A and B充分洗涤，接着EK酶切buffer D (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-IOO， 5%甘油，pH 8.0)洗两个柱体积。 最后按照EK (mg):目标蛋白(mg"l: 10000的比例将EK加入25%的介质悬 浮液中起始酶切反应。酶切条件为4。C/16小时。酶切洗脱出来的MMLV-RT进 一步经强阴离子交换吸附层析Q-Sepharose纯化。纯化后的酶采用Micro BCA 试剂盒定量及凝胶灰度扫描分析。 '
通过镍亲和层析、EK酶切以及离子交换层析收穿过，得到了野生型的不带 任何亲和标签的MMLV-RT。镍亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白，用肠激酶 酶切，避免了高咪唑洗脱带来的蛋白沉淀副效应，并将不带任何冗余氨基酸的 MMLV-RT与His6标签分离开，最后离子交换层析去除EK和痕量的DNA，最终从 一升发酵液中得到了约23mg的野生型MMLV-RT(纯度约95%) 。 12.5% SDS-PAGE分析表明，纯化的MMLV-RT与理论分子量70kD相符(图3)。纯化的得 率概括于下表中纯化流程 细菌超声裂解物 离心上清 Ni2+-NTA亲和层析 EK酶切
MMLV-RT总量(mg/L)
36. 5
34. 5
27. 2
23
纯化效率(%)
100
95
79
85
4.逆转录酶的活性检测方法 逆转录酶的活性采用[3H]dTTP参入法进行定量分析，具体流程参考文献(J. Biochem. 143 (2008) 261-268)。在一个cDNA合成的实例中，以人源的mRNA抽 提物作为逆转录的模板，将200个活力单位的酶加入反应体系中，具体为(25raM Tris-HCl (pH8. 3)， 50 mM KC1, 10慮DTT， 4 mM MgC12， 1 MM oligo(dT) 18, 5 Pg RNA and 200 U逆转录酶)，在42° C反应60分钟。然后以逆转录产物作 为模板进行PCR反应，采用的引物对为5' - ATGGCGGCAGCTACGGGGG -3'和 5' -GATGGTCTCATCATCGC TC-3，。
对PCR产物进行电泳和测序分析。 如图4A所示，纯化的逆转录酶表现出和商品化酶相似的活性，比活约为2X105 units/mg。该酶成功的合成了人源的自吞噬基因atg7。
权利要求
1、一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法其特征是通过载体构建将MMLV-RT基因和肠激酶(enterokinase，EK)酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温条件下通过与分子伴侣(TF，GroEL和GroES)共表达，来提高蛋白表达量和可溶性。
2、 根据权利要求1所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在 大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是将醒LV-RT基因和肠激酶酶切 位点克隆到pET28a载体中，在低温的条件下与分子伴侣共表达。
3、 根据权利要求1所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在 大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是将MMLV-RT基因克隆到pET28a 载体中实现共表达。
4、 根据权利要求3所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在 大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是MMLV-RT肠激酶酶切位点克隆 到pET28a载体中表达。
5、 根据权利要求2所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在 大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是隨LV-RT基因在低温条件下与 分子伴侣共表达。
6、 根据权利要求2所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在 大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是原核表达载体表达的重组蛋白 为His6-EK-MMLV-RT。
7、 根据权利要求3和4所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT) 在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是His6-EK-MMLV-RT与分子伴 侣TF和GroEL-GroES在宿主菌中共表达。
8、 根据权利要求6所述的的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是表达的融合蛋白含六个组氨酸(His6)标签，用镍亲和柱(Ni-NTA)纯化融合蛋白。
9、 根据权利要求6和7所述的的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是先通过Ni-NTA纯化融合蛋白，.再通过肠激酶酶切得到逆转录酶(丽LV-RT)。
10、 根据权利要求7所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是所述表达宿主菌是^ c力aric力iaco力'BL21 (DE3)。
全文摘要
本发明涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)的表达和纯化，特别涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)的可溶性表达及纯化方法。属生物化学领域。本发明通过载体构建将MMLV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温的条件下MMLV-RT与分子伴侣共表达，蛋白的表达量提高到15％，而可溶性是常规方法表达的10倍。
文档编号C12R1/93GK101684474SQ200910024869
公开日2010年3月31日 申请日期2009年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者孙启明, 徐卫国, 宇 陈 申请人:孙启明;徐卫国