专利名称：：鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组鸡痘病毒，具体涉及一种为共表达H5亚型禽流感病毒主要保护性抗原基因HA和鸡白细胞介素2基因的重组鸡痘病毒，以及它的构建方法和应用。与单表达HA的重组鸡痘病毒疫苗相比，本发明的鸡痘病毒作为疫苗应用可显著提高免疫保护水平，降低H5亚型禽流感病毒感染鸡后的排毒水平。
背景技术：
：鸡痘病毒(FowlpoxVirus，FPV)为痘病毒科、禽痘病毒属的成员，是迄今发现的动物病毒中最大的一种病毒。最独特的性质是它们在感染细胞的胞桨复制，而不在细胞核内。成熟的病毒粒子为砖型，大小为250X350nm，FPV的基因组为双股线性DNA，大小约300kb，分子量约为2~4X105KD，G+C含量达35%，且其DNA不具有感染性。通过重组DNA技术，以FPV为载体研制禽类基因工程重组活病毒疫苗，或哺乳动物非复制型重组活病毒载体疫苗受到越来越多研究者的重视。FPV基因组庞大，可插入较长外源基因，构建多价或多联重组病毒活疫苗，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。FPV载体与已报道的病毒载体如痘苗病毒、乳头状瘤病毒、腺病毒、细小病毒、马立克氏病病毒、烟草花叶病毒等相比具有明显的优势。FPV自然条件下只感染禽类，但能在哺乳动物细胞产生顿挫性感染，虽不产生有感染性的子代病毒粒子，却能自动合成加工外源抗原并提呈到细胞表面，刺激机体产生免疫应答反应。已有多种类型的具有生物活性的蛋白质在重组鸡痘病毒(recombinantfowlpoxvirus,rFPV)中得到表达。如禽流感病毒(AIV)的血凝素基因(HA)、新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因、马立克氏病病毒(MDV)的gB基因、传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因、狂犬病病毒糖蛋白和麻疹病毒融合蛋白基因等，以表达外源基因的rFPV进行免疫，在SPF鸡或无母源抗体的商品鸡均可提供特异性的免疫保护，因此，FPV载体不仅可以用作家禽的疫苗，而且可以用作哺乳动物的疫苗。现有技术中，FPV疫苗在商品禽中已使用了70多年，此疫苗可引起轻微的、自限性局部感染。同时，FPV宿主范围较窄，仅感染禽，因此是相对比较安全的疫苗病毒。鸡痘病毒载体已经研究了近二十年，但能应用于临床的重组病毒寥寥无几，原因何在？一个主要原因就是母源抗体的干扰。就拿我国的现状来说，为控制疫情的发生，减少经济损失，种鸡一般需要反复接种针对MDV、NDV、AIV、IBDV、FPV等的多种疫苗，导致我国的商品鸡普遍带有高母源抗体。其中针对H9N2亚型AIV的母源抗体高达27-28，H5N1亚型AIV的母源抗体也达到了25-26，这就给商品鸡疫苗的使用和疫情的监测带来不便。当前我国对禽流感的控制主要依赖常规疫苗的免疫接种，但常规疫苗灭活苗存在成本高及干扰临床检测等缺陷，开发新型疫苗势在必行。鸡痘病毒载体表达外源基因已发展到相当成熟的程度，但现有的重组鸡痘疫苗都存在着免疫保护效果不如灭活疫苗的问题，需要通过改善鸡痘病毒载体和提供免疫增强剂的方法来提供其免疫效力。根据本实验室的前期研究发现，本室以前构建的插入载体pllS(陈素娟，孙蕾，石火英，等.禽流感病毒H5亚型主要保护性抗原在禽痘病毒中的高效表达.中国兽医学报,2007,27(2):200-202)的复制非必需区pFPV7s(彭大新，刘秀梵，吴艳涛，等.鸡痘病毒载体复制非必需片段优化及强启动子的筛选.农业生物技术学报，2000,8(2):129-132.)正好处于开放性阅读框架上，可能破坏了IL-18结合蛋白基因。目前已有学者发现，经细胞表达的IL-18结合蛋白能够抑制机体IL-18依赖性IFN-Y的产生(XiangY,MossB.IL-18bindingandinhibitionofinterferoninductionbyhumanpoxvirusencodedproteins.ProcNatlAcadSci,1999,96:1537-11542.和AizawaY，AkitaK,TaniaiM，etal.Cloningandexpressionofinterleukin-18bindingprotein.FEBSLett,1999，445:338-342.)。据实验证实，IL-18是IL-1家族中具有多种功能的致炎症细胞因子，其能够诱导机体产生IFN-Y、Th-l型免疫应答并激活NK细胞的活性，这对小鼠诱导产生有效抗VV感染的免疫应答起到重要的作用。而IL-18结合蛋白可能具有对抗机体炎症反应的功能，对病毒在宿主体内的繁殖与扩散是有利的。为了解决这一缺陷，本实验室重新筛选了鸡痘病毒严格的复制非必需区？PV12，构建了高效鸡痘病毒表达载体pP12LS(孙蕾，刘武杰，陈素娟等.鸡痘病毒复制非必需区的选择对重组鸡痘病毒免疫效力的影响.微生物学报，2005，45(3):359-362)。以白介素等细胞因子作为免疫佐剂可能是解决目前众多疫苗效果不良的有效途径之一。白介素2(IL2)由Th细胞分泌，是免疫应答过程中的一个初始因子，在特异性免疫应答反应中起重要作用。IL2选择性的增强Thl细胞分化、增殖，诱导IFN及IL2的分泌;能抑制Th2细胞发育，诱导Th2向Thl细胞免疫应答类型转变；对NK具有多种促进作用；能参与机体的信息传递，并可创造一个局部细胞因子微环境。IL2和其它细胞因子能诱导相应B淋巴细胞的克隆增殖，分化成浆细胞和记忆性细胞。这些特点是IL2作为免疫佐剂的理论依据。以IL2作为免疫增强剂可能是解决目前众多疫苗效果不良或不稳定问题的有效途径之一；是一种被人们普遍看好，并有广阔应用前景的新型佐剂。已有研究表明应用鸡痘病毒作为载体共表达HIV-1和哺乳动物IL-2可增强机体的细胞免疫(JiangW,JinN，CuiS,etal.ConstructionandcharacterizationofrecombinantfowlpoxviruscoexpressingHIV-l(CN)gpl20andIL-2.JVirolMethods.2005,130(l-2):95-101)。与哺乳动物IL2类似，鸡白介素2(Chickeninterleukin2,chiIL-2)在DNA疫苗也显示较好的免疫增强作用，如与IBDV、IBV、鸡球虫等保护性抗原基因共表达可提高DNA疫苗的保护效力(KumarS,AhiYS,SalunkheSSetal.EffectiveprotectionbyhighefficiencybicistronicDNAvaccineagainstinfectiousbursaldiseasevirusexpressingVP2proteinandchickenIL-2.Vaccine.2008;XuQ,SongX,XuL,etal.VaccinationofchickenswithachimericDNAvaccineencodingEimeriatenellaTA4andchickenIL-2inducesprotectiveimmunityagainstcoccidiosis.VetParasitol.2008，156(3-4):319-323;TangM，WangH,ZhouS,etal.Enhancementoftheimm皿ogenicityofaninfectiousbronchitisvirusDNAvaccinebyabicistronicplasmidencodingnucleocapsidproteinandinterleukin-2.JVirolMethods.2008,149(1):42隱48.)。
发明内容本发明的第一个目的是为了克服现有H5亚型禽流感重组鸡痘病毒基因工程疫苗免疫效力较低的缺点，提供一种能在母源抗体阳性的商品鸡群使用的重组鸡痘病毒基因工程疫苗。本发明疫苗为含共表达H5亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素2(Chickeninterleukin2,chiIL-2)基因的重组鸡痘病毒疫苗rFPV-AIH5/IL2，于2008年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC:2831。本发明的重组鸡痘病毒疫苗为既含H5亚型AIVHA基因又含chiIL-2基因的重组鸡痘病毒(recombinatFowlpoxvirus,rFPV)疫苗，与单表达HA的重组鸡痘病毒疫苗相比，可显著提高免疫保护水平，降低H5亚型禽流感病毒感染鸡后的排毒水平。使得重组鸡痘病毒活疫苗早日应用于临床，可预防H5亚型禽流感。本发明的第二个目的是提供一种重组鸡痘病毒疫苗rFPV-AIH5/IL2的构建方法包括以下步骤(1)获得含H5亚型AIVHA基因整个阅读框架的基因片段；(2)获得含chilL-2基因整个阅读框架的基因片段；6(3)将上述基因片段置于各自合适的启动子下游，背向串联插入到含FPV复制非必需片段FPV12和报告基因的鸡痘病毒表达载体pP12LS中构建成转移载体pP12HAIL-2，长度为12745bp;(4)用转移载体pP12HAIL-2转染已感染wt-FPV的鸡胚成纤维细胞，通过同源重组获得共表达H5型AIVHA基因和chilL-2基因的重组鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2。通过以上方法能得到增强免疫效力、降低禽流感感染鸡的病毒的重组鸡痘病毒活疫苗，其方法科学、可靠性强，获得的疫苗稳定性好，纯度高。步骤(1)中，H5亚型AIVHA基因可以通过以下方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，根据巳发表的H5亚型AIVHA基因序列设计引物，PH5A15'-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTCTTTCTT-3，PH5A25，-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG隱3'先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H5亚型AIVHA基因整个阅读框架。步骤(2)中，chilL-2基因由本实验室构建质粒PT-IL2，通过以下引物，PchiIL-2-l5，-AAAGGATCCGCCACCATGATGTGCAAAGTACTGATC-3，PchilL-2-25'-CCCTCTAGAAAGCTTATAAAAATTATTTTTGCAGATATCTCAC-3'通过PCR扩增出chilL-2基因整个阅读框架。分别将H5亚型AIVHA基因和chilL-2基因连接到T-载体，测序证明所得的基因序列的正确性。在步骤(3)中，为了分别表达H5亚型AIVHA和chilL-2基因，需要足够长度和功能活性的启动子连接到上述各自基因上。启动子可以是任何能够在重组鸡痘病毒(rFPV)感染细胞中指导基因转录的FPV早晚期启动子、痘苗病毒早晚期启动子或人工合成早晚期启动子，启动子和上述基因可以通过酶切加接的方法或用PCR设计引物加接的方法连接在一起，按常规方法将其插入到含FPV复制非必须片段和报告基因LacZ的FPV表达载体pP12LS中获得转移载体，在将此连接产物转化到适当的宿主细胞中，按常规方法纯化并分析重组体，以确保得到正确的转移载体。碱裂解方法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA。在步骤(4)中，用GeneJammerTM转染试剂将转移载体分别与wt-FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有X-gal的营养琼脂覆盖，蓝斑筛选纯化得重组病毒rFPV-AIH5/IL2。rFPV中外源基因的插入和表达，可通过核酸杂交、PCR扩增外源基因、重组病毒与特异性抗体结合的反应性及所表达外源基因产物的生物学特性等方法予以鉴定。最后，还可将共表达H5亚型AIVHA基因和chilL-2基因的rFPV在CEF单层上增殖，使病毒在CEF中大量扩增。长成完全病变后收获，分别吸取0.1ml病毒液，以细胞培养液作连续10倍稀释，取10"4、10—5、10—6三个稀释度的病毒液接种生长于24孔细胞培养板内的形成致密单层的CEF，每个稀释度接种4孔，每孔接种0.1ml病毒液。37t:培养72h，然后观察病变，计算接种每一稀释度病毒液的CEF上形成的蚀斑数目，根据计数结果计算病毒原液中含有的病毒蚀斑形成单位(PFU)。接种实验用动物。本发明的第三个目的在于发明重组鸡痘病毒疫苗rFPV-AIH5/IL2的用途，用于防治H5亚型禽流感。本重组鸡痘病毒疫苗rFPV-AIH5/IL2用于防治H5亚型禽流感，特别是禽类皮下使用本发明所述的疫苗，使用量为10M()SpFU/羽。可对H5亚型禽流感病毒具有良好的防治效果。附图i^明图l:PCR扩增H5亚型AIVHA基因M:200bpDNAladdermaker1:H5亚型AIVHA基因PCR产物图2:PCR扩增chilL2基因M:1OObpDNAladdermaker1:chilL2基因PCR产物图3构建含H5亚型AIVHA基因和chilL-2基因的转移载体pP12HAIL-2的策略图图4显示重组质粒pP12HAIL-2的酶切鉴定电泳图谱。M:1OObpDNAladdermaker1:pP12HAIL-2(teffl^ASo/);2:pP12HAIL-2(/ME);3:pP12HAIL-2图5显示纯化重组鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2感染CEF后形成的兰色空斑图6重组鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2中chilL-2表达的RT-PCR鉴定M:100bpDNAmarker1:rFPV-IL2中chilL-2基因的RT-PCR产物82:rFPV-AIH5/IL2中chilL-2基因的RT-PCR产物3:wt-FPV中chilL-2基因的RT-PCR产物图7显示重组鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2感染CEF后表达HA蛋白的荧光图1:rFPV-AIH5/IL22:wt-FPV具体实施例方式以下涉及生物材料重组鸡痘病毒(Fow/;wxWnw)rFPV-AIH5/IL2，于2008年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC:2831。T-HA:贾立军，彭大新，张艳梅，等.H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建及其遗传稳定性与免疫效力.微生物学报，2003年43,(6):722-727.PT-IL2:邵卫星，彭大新，卢建红，等.表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测.生物工程学报,2004,20(1):136-139.pGEM-Teasyvector:购自Promega公司。PUC18PELNA:陈素娟.用不同鸡痘病毒载体构建单表达或双表达抗H5和H9亚型禽流感的重组疫苗及其免疫效力.扬州大学博士论文，2005.pP12LS:孙蕾，刘武杰，陈素娟等.鸡痘病毒复制非必需区的选择对重组鸡痘病毒免疫效力的影响.微生物学报，2005，45(3):359-362wt-FPV疫苗株282E4株，购自中国兽药监察所。步骤一H5亚型AIVHA基因的扩增、克隆及序列分析根据己发表的H5亚型AIVHA基因的序列(DQ201829)，设计HA基因的PCR扩增引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。H5亚型AIVHA基因的扩增引物上游引物PH5A1的5'端引入^wHI位点和Kozak序列，下游引物PH5A2的5'端引入SalI位点外，还引入了痘病毒基因组早期基因的转录终止信号。上、下游引物跨幅约为1.7kb，覆盖整个HA基因编码框。PH5A15'-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTCTTTCTT-3，PH5A25'-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3，取含H5亚型AIVHA基因的质粒T-HA，用ExpandHighFidelityPCRsystem扩增HA基因。轻轻混匀后，按下列循环参数进行PCR扩增94'C预变性5min;94'C变性1min，58t退火lmin，72°C延伸2min，一共进行30个循环；72。C再延伸10min，4。C保存。循环结束后，取5WPCR反应产物通过0.8。/。琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(图l)。进行回收和纯化，并与pGEM-Teasyvector进行连接。用50附///+&//双酶切法筛选，以切出1.7Kb大小条带的质粒为阳性重组质粒，命名为pTHA。阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序，得到确证。步骤二鸡白细胞介素2基因的扩增、克隆及序列分析chilL-2基因根据由本实验室构建质粒PT-IL2，设计chilL-2的PCR扩增引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。chiL-2基因的扩增引物上游引物PchilL-2-l的5'端引入5^w^/位点和Kozak序列，下游引物PchilL-2-2的5，端引入;ftfl/、历^////位点外，还引入了痘病毒基因组早期基因的转录终止信号。上、下游引物跨幅约为469bp。PchiIL-2-l5'-AAAGGATCCGCCACCATGATGTGCAAAGTACTGATC-3，PchilL-2-25'-CCCTCTAGAAAGCTTATAAAAATTATTTTTGCAGATATCTCAC-3'以质粒PTIL2为模板，用PchiIL-2-l和PchilL-2-2引物和ExpandHighFidelityPCRsystem对chiIL-2基因进行PCR扩增，使chiIL-2基因翻译起始区前连接一段Kozak序列，终止密码子后连接痘病毒早期转录终止信号T5NT。PCR循环参数94'C预变性5min;94°C变性lmin，60。C退火45s，72'C延伸lmin，一共进行30个循环；循环结束后72。C再延伸10min。PCR产物通过电泳鉴定后(图2)，进行回收和纯化，并与pGEM-Teasyvector进行连接。用5"mHI+//^dni双酶切法筛选，以切出460bp大小条带的质粒为阳性重组质粒，命名为pIL-2。阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序，得到确证。chilL-2基因的序列如SEQIDNO.l所示。步骤三转移载体(pP12HAIL-2)的构建如图3所示，将质粒pTHA用SamHI和Sa/I酶切电泳回收1.7kb片段，分别与用Ba附HI和fe/I酶切的载体质粒pP12LS连接，构建成转移载体pP12HA。将质粒pIL-2用5ami//和力"//双酶切电泳回收450bp左右片段与用^W7///和；《^//双酶切质粒载体PUC18PELNA连接，构建重组质粒PE/L-IL2。在重组质粒PE/L-IL2中，鸡chilL-2编码区基因处于FPV早晚期启动子PE/L的下游。将质粒PE/L-IL2用///m////酶切电泳回收500bp左右片段与用历"d///酶切质粒pP12HA连接，构建重组质粒pP12HAIL-2。^m/f/酶切鉴定重组质粒pP12HAIL-2基因插入的方向。筛选反向插入的阳性重组质粒命名为pP12HAIL-2。在重组质粒pP12HAIL-2中，FPV早晚期启动子PE/L和启动子Ps反向串联。重组质粒pP12HAIL-2的酶切鉴定电泳图谱见图4。步骤四转染与纯化转染按GeneJammerTM6转染试剂的说明进行。在60mm培养皿中培养SPF成纤维细胞至形成单层，以0.1MOI的wt-FPV疫苗株感染CEF，37'C培养3~4h，倒去上清用DMEM基础基洗涤两次后加4ml备用。将l-2吗pP12HAIL-2分别溶于30^1的TE，按1:6将GeneJammerTM6稀释到lOOplDMEM基础培养基中，轻轻混匀，置室温作用15min，将pP12HAIL-2的上述混合物缓慢滴加至已感染wt-FPVCEF的DMEM基础培养基中混匀；37'C培养6h后换维持液，待细胞完全病变后收获病毒，-701]~37°0反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选。将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有200pg/mlX-gal的营养琼脂覆盖，37'C培养72h，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑进一步克隆纯化，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色(图S)。'步骤五共表达H5和鸡白细胞介素2基因重组鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的鉴定重组病毒rFPV-AIH5/IL2中chilL-2基因表达的鉴定用rFPV-AIH5/IL2感染形成致密单层的CEF，并分别设单表达chilL-2基因的重组鸡痘病毒rFPV-IL2与野生型鸡痘病毒作对照。在37°C、5%C02条件下培养直至出现典型蚀斑后，倾去培养液，以PBS(O.OIM，pH7.4)洗涤一次，收获病变细胞，按常规方法提取细胞总RNA，RT-PCR方法扩增chilL2mRNA。取PCR反应产物通过P/o琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(图6)。重组病毒rFPV-AIH5/IL2中HA基因表达产物的鉴定用rFPV-AIH5/IL2感染形成致密单层的CEF，并设野生型鸡痘病毒作对照。在37'C、5%(:02条件下培养直至出现典型蚀斑后，倾去培养液，以PBS(O.OIM，pH7.4)洗涤一次，然后用冷甲醇固定10min;加入稀释度为1:1000的鼠抗H5亚型AIVF株的单克隆抗体，37。C孵育lh;以含0.05%吐温-80的0.01MPBS(简称PBST，pH7.2)洗5minx3次，再加入稀释度为1:200的羊抗鼠IgG-FITC荧光抗体，37'C孵育lh;用PBST洗涤5minx3次后置荧光显微镜下观察并拍照记录结果(图7)。应用重组鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的免疫效力实验1、rFPV-AIH5/IL2在SPF鸡抵抗H5亚型AIV的免疫效力(以保护临床不发病不死亡为指标)7日龄白来航SPF雏鸡随机分组，分别于颈部皮下免疫rFPV-AIHA、rFPV-AIHA和rFPV-IL2联合使用，rFPV-AIH5A/IL2、wt-FPV、rFPV-IL2、PBS和H5亚型AI油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡。于免疫后7，14，21天采血，分离血清检测HI抗体效价。免疫后21天，用剂量为10"ELD5o/只的A/mallard/Huadong/S/2005株进行滴鼻攻毒攻，毒后3天采集口11腔棉拭子，用10日龄非免疫鸡胚分离病毒。所有试验鸡于攻毒后持续观察18天，记录试验鸡的发病和死亡情况。在SPF鸡的免疫保护试验中，免疫后14天时rFPV-AIH5A/IL2组诱生HI抗体水平最高，且整齐度最好的产生，其PI为100，感染鸡的排毒率最低，为10.5%，显著高于单表达H5亚型AIVHA的重组鸡痘病毒rFPV-HA。表1SPF鸡接种rFPVs后诱生的针对H5亚型AIV的HI抗体的效价组别制鲁cpp丁nHI(nlong2)dpi7dpi14dpi21rFPV-IL2+rFPV-HA2xl03+2xl040.16±0.37a1.11±0.811.32±0.95rFPV-IL2+rFPV-HA2xl04+2xl040.05±0.23a1.05±0.970.79±l.(i3rFPV-AIH5A/IL22xl040.16±0.37a2.42±1.12a2.47±U2arFPV-HA2xl0401.37±1.120.84±0.83Wt-FPVLP000rFPV-IL22xl04000H5AIkilledvaccine0.2ml02.37±1.54a3.42±2.1aPBS0.2ml000HI抗体效价(nlog2广平均HI抗体效价(nlog2卢标准差；dpi=dayspostimmunization.;a表示组间差异显著，p<0表2.SPF鸡接种rFPVs后抵抗H5亚型AIV强毒攻击的免疫保护作用组别剂量(PFU)死亡数/总数保护指数(O病毒分离,(％)rFPV-IL2+rFPV-HA2xl03+2xl042/1989.526.3rFPV-IL2+rFPV-HA2xl04+2xl046/1968.466.7rFPV-AIH5A/IL22xl040/1910010.5rFPV-HA2xl042/1989.516.7Wt-FPVLP2xl0419/190-rFPV國IL22xl0419/190-H5AIkilledvaccine0.2ml0/1910021.1PBS0.2ml5/50-2、rFPV-AIH5A/IL2在商品鸡抵抗H5亚型AIV的免疫效力(以保护临床不发病不死亡为指标)7日龄商品代伊莎蛋鸡随机分组，分别于颈部皮下免疫rFPV-AIH5A、rFPV-AIH5A和rFPV-IL2联合使用，rFPV-AIH5A/IL2、wt-FPV、PBS和H5亚型AI油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡。于免疫后7，14，21天采血，分离血清检测HI抗体效价。免疫后21天，用剂量为10"ELD5o/只的A/mallard/Huadong/S/2005株进行滴鼻攻毒攻，毒后3天采集口腔棉拭子，用10日龄非免疫鸡胚分离病毒。有试验鸡于攻毒后持续观察18天，记录试验鸡的发病和死亡情况。在有母源抗体鸡的免疫保护试验中，免疫后rFPV-AIH5A/IL2组诱生HI抗体水平、免疫保护力高于单表达H5亚型AIVHA的重组鸡痘病毒rFPV-HA，感染鸡的排毒率显著低于后者。表3商品鸡接种rFPVs后诱生的针对H5亚型AIV的HI抗体的效价<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注HI抗体效价(nlog2广平均HI抗体效价(nlog2卢标准差；dpi=dayspostimmunization.;a表示组间差异显著，p<0.05。表4商品鸡接种rFPVs后抵抗H5亚型AIV强毒攻击的免疫保护作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>SEQUENCELISTING〈uo〉扬州大学〈120〉鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2及其构建方法和应用<160>1<210>1<211>432<212>DNA<213>人工序列<400〉1stg3tgtgcactttggctgtstttcggtsgC33tgct33tgsctscsgct60tatgg3gc3tctctatc3tc3333CtCttC33sgg3ttt3120cstctcgsgctCt3C3C3CCasctgaLgacc180C3gg3gtgcsCCC3gC333Ctctgcsgtgttscctgggsgaagtggttactctg33g333240gaatttgtaactgct3ttcs300sags3cctc3agagtcttacgggtct333tcsc3ccgg33gtg33tgcs3g3tctgtgss360tcctgattttctccatg3sctgsccssctttgtg3g3t3t420CtgC33333t334321权利要求1、一种鸡痘病毒(Fowlpoxvirus)rFPV-AIH5/IL2CGMCCNO2831。2、如权利要求1所述鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)获得含H5亚型AIVHA基因整个阅读框架的基因片段；(2)获得含chilL-2基因整个阅读框架的基因片段；(3)将上述基因片段置于各自合适的启动子下游，背向串联插入到含FPV复制非必需片段FPV12和报告基因的鸡痘病毒表达载体pP12LS中构建成转移载体pP12HAIL-2，长度为12745bp;(4)用转移载体pP12HAIL-2转染己感染wt-FPV的鸡胚成纤维细胞，通过同源重组获得共表达H5型AIVHA基因和chilL-2基因的重组鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2。3、根据权利要求2所述鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，H5亚型AIVHA基因可以通过以下方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，通过以下引物PH5A15，-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTCTTTCTT-3'PH5A25'-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3'先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H5亚型AIVHA基因整个阅读框架。4、根据权利要求2所述鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，chilL-2基因由本实验室构建质粒pT-IL2，通过以下引物，PchilL-2陽l5'-AAAGGATCCGCCACCATGATGTGCAAAGTACTGATC-3，PchilL-2-25'-CCCTCTAGAAAGCTTATAAAAATTATTTTTGCAGATATCTCAC-3，通过PCR扩增出chilL-2基因整个阅读框架。5、根据权利要求2所述鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，启动子是任何能够在重组鸡痘病毒感染细胞中指导基因转录的FPV早晚期启动子、痘苗病毒早晚期启动子或人工合成早晚期启动子。6、根据权利要求2或5所述鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，启动子和步骤(1)、(2)所得基因通过酶切加接的方法或用PCR设计引物加接的方法连接在一起，按常规方法将其插入到含FPV复制非必须片段FPV12和报告基因LacZ的FPV表达载体中。7、根据权利要求2所述鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，用GeneJammer转染试剂将转移载体分别与wt-FPV共转染鸡胚成纤维细胞，将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有X-gal的营养琼脂覆盖，蓝斑筛选纯化得重组病毒rFPV-AIH5/IL2。8、根据权利要求2所述鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的制备方法，其特征在于，将共表达H5亚型AIVHA基因和chilL-2基因的rFPV在CEF单层上增殖，使病毒在CEF中大量扩增。9、权利要求1所说的鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的在制备预防H5亚型禽流感疫苗中的应用。全文摘要本发明涉及一种重组鸡痘病毒，具体涉及一种为共表达H5亚型禽流感病毒主要保护性抗原基因HA和鸡白细胞介素2基因的重组鸡痘病毒，以及它的构建方法和应用。所说的重组鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2，为共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡白细胞介素2基因的重组鸡痘病毒，保藏号为CGMCCNO2831。该鸡痘病毒rFPV-AIH5/IL2的在制备预防H5亚型禽流感疫苗中应用，得到的疫苗与单表达HA的重组鸡痘病毒疫苗相比，本发明的疫苗可显著提高免疫保护水平，降低H5亚型禽流感病毒感染鸡后的排毒水平。文档编号C12N7/01GK101486997SQ200910025600公开日2009年7月22日申请日期2009年2月11日优先权日2009年2月11日发明者云水丽,刘武杰,刘秀梵,吴艳涛,张小荣,彭大新,陈素娟申请人:扬州大学