专利名称：一种人染色体p16基因探针的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人染色体P16基因探针的制备方法，还涉及利用人染色体P16基 因探针制备一种人染色体P16基因检测试剂盒，应用本发明的人染色体P16基因探针及相 应的试剂盒可以对人染色体P16基因异常进行准确、快速的检测。
背景技术：
P16 基因又叫 MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，定位于人染色体 9p21， 直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株中发现有纯合 子缺失、突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因。P16基因已经在肺癌、乳 腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中发现纯合子缺 ^zUR^XAsXR^m^^ [Kaye FJ. RB and cyclin dependent kinase pathways defining a distinction between RB and pl61oss in lung cancer[J]. Oncogene,2002, 21(45) :6908-6914. ][Bazan V,Zanna I,Migliavacca M,et al. Prognostic significance of pl6INK4a alterations and 9p211oss of heterozygosity in locally advanced laryngeal squamous cell carcinoma [J]. J Cell Physiol，2002，192 (3) :286_293.] [Yoshida S,Todoroki T，Ichikawa Y, et al. Mutations of pl6Ink4/CDKN2 and pl5Ink4B/ MTS2genes in biliary tract cancers [J]. Cancer Res,1995,55 (13) :2756_2760.] [Calero Moreno TM, Gustafsson G, Garwicz S,et al. Deletion of the Ink4_locus(the pl6ink4a, pl4ARF and pl5ink4b genes)predicts relapse in children with ALL treated according to the Nordic protocols N0PH0 86 and N0PH0 92 [J]. Leukemia, 2002,16(10) =2037 2045.]，表明P16基因以缺失，突变方式广泛参与肿瘤形成，检测P16基 因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。目前常用的染色体组型分析可以进行染色体异常的分析，但这需要进行细胞培养 和制备高质量的中期染色体片，而这对于肿瘤细胞来说是极其困难和耗时的。为了解决这 个技术难题，其中一个思路是筛选并制备相应的区段分析基因探针，但目前染色体区段分 析基因探针制备缺乏一个系统和成熟的方法。本发明人在长期研究的基础上设计及筛选人染色体P16基因探针，并利用荧光原 位杂交技术检测中期或间期细胞中的人染色体P16基因。它应用荧光物质标记的双链DNA 核酸探针与染色体DNA互补序列杂交，在核中或染色体上显示DNA序列的位置。在此基础 上本发明人还开发人染色体P16基因检测试剂盒，该试剂盒具有快速、无创性、敏感度高和 特异性强等优点，无需进行细胞培养，就能够在中期和间期细胞中检测人染色体P16基因 的异常。由于本发明提供了这种人染色体P16基因探针的制备方法，并在此基础上自主研 制开发人染色体P16基因检测试剂盒，对摆脱对进口试剂的依赖，填补国内该检测领域的 空白具有十分重大的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种人染色体P16基因探针的制备方法。根据本发明一个优选的实施方案人染色体P16基因探针的制备步骤包括(1)克隆筛选P16基因位于人染色体9p21区段，挑选包含有该基因的克隆。(2)克隆培养和鉴定购买克隆，取适量克隆菌液添加到500ml的TB培养液(氯 霉素抗性)中，37°C摇床中摇菌培养24 48小时；使用STS引物对进行克隆鉴定。(3)P16基因探针制备对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过适当稀释质 粒DNA，对质粒DNA定量；然后，通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进 行乙醇沉淀和浓缩；获得P16探针，避光、-20°C储存。(4)P16基因探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中挑选的克隆号为 RP11-14912 (Invitrogen RPCI11.C)。根据本发明一个优选的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物序列分 别为上游引物 5’ -ATCCAACATGCCATAGCTCC-3，和下游引物 5’ -TTTGTCCCATGTCACTGGAA-3，， PCR 扩增条件为95°C 5 分钟；(94°C 30 秒，56°C 30 秒，72°C 45 秒)X40 循环；72°C 10 分钟。根据本发明一个优选的实施方案，P16基因探针制备步骤中克隆质粒DNA提取可 使用市售的质粒提取试剂盒，优选Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。根据本发明一个优选的实施方案，P16基因探针制备步骤中克隆质粒DNA的定量 是将质粒DNA稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。根据本发明一个优选的实施方案，P16基因探针制备步骤中质粒DNA进行荧光标 记可以使用市售的缺口平移标记试剂盒，优选abbott公司的Nick Translation Kit。根据本发明一个优选的实施方案，P16基因探针标记的荧光素为荧光素标记的 dUTP，并优选 Spectrum dUTP。根据本发明一个优选的实施方案，P16基因探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使 用 5ulHuman Cot-IDNA(lug/ul)溶解沉淀。本发明的另一个目的是利用P16基因探针制备一种P16基因探针检测试剂盒。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案(1)样本处理和制片按照原位杂交方法对各类型样本进行处理。(2)杂交配制杂交液，主要包括标记探针和杂交缓冲液。合适温度下进行8 16 小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。(3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，观察P16基因是否缺失或扩增。基于以上技术方案发明的试剂盒包括1)杂交液、DAPI复染剂，和2)分隔并集中 包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记的P16基因探针和H20 配制成杂交液，其中每人份杂交液中使用P16基因探针的量为1. 5ul 3ul，杂交缓冲液为 7111，用 H20 补至 10ulo根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫 酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50% 70%，硫酸葡聚糖浓度为0. lg/ml。
根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50 250ng DAPI 溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行 P16基因检测。本发明与现有技术相比，具有下列优点(1)可以对人P16基因进行准确、快速的检测、且结果重复性好；(2)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞 P16基因计数，操作相对简单；(3)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学、产前诊断等领域的 应用，了解P16基因与肿瘤发生等的联系。
图1显示克隆鉴定的电泳结果。目的产物184bp。图2显示人类正常分裂中期淋巴细胞P16基因检测结果。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 人P16基因探针的制备方法(1)引物设计克隆筛选P16基因位于人染色体9p21区段，挑选包含有该基因的克 隆:RPll-149I2o(2)克隆培养和鉴定购买相应克隆Invitrogen RPCI11. C，取50ul添加到500ml 的TB培养液(氯霉素抗性)中，37°C摇床中摇菌培养24 48小时；菌液使用STS引 物对进行克隆鉴定。STS引物对上游引物5 ’ -ATCCAACATGCCATAGCTCC-3，和下游引物 5，-TTTGTCCCATGTCACTGGAA-3，，PCR 扩增条件为95 V 5 分钟；(94 °C 30 秒，56°C 30 秒， 72V 45秒)X40循环；72°C 10分钟。扩增产物进行电泳验证，结果184bp左右具有明亮的 条带(参见附图1)。(3)P16基因探针制备鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit, 按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸 光度对质粒DNA定量；按照公式双链DNA浓度(ng/ul) = 0D260 X 50 (ng/ul)计算质粒DNA 浓度。采用高压灭菌的超纯水稀释为lOOng/ul，采用1. 5ml的离心管分装，_20°C密封保存。通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR
反应体系。
10XNT buffer5ul
dTTP(lmM)0. 5ul
d3TPs(lmM)lul
Spectrum-Orange dUTP0. 5ul
NT 酶lOul
DNA(100ng/ul)lOul
H2023ul总体积50ul配完后震荡混勻，在15°C标记12小时，再70°C孵育10分钟灭活酶。取5ul使用 2%琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1. 5ml离心管中依次加入醋酸钠 和无水乙醇，避光、冰上配制标记产物45ulHuman Cot-IDNA5ul醋酸钠(3mol/L)5ul无水乙醇125ul混勻后置于_70°C冰箱中至少2小时，4°C 13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿 搅动沉淀，加入1ml的70%乙醇，4°C 13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀， 避光干燥。使用5ul Human Cot-IDNA(lug/ul)溶解沉淀，获得P16基因探针，避光、-20°C储存。(4)P16基因探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含 中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。
实施例2 :P16基因检测试剂盒制备 以10人份/盒为例。(1)杂交液配制取少量P16基因探针稀释成50ng/ul，按下表配制杂交液 (2)DAPI复染剂配制
抗褪色液全程操作必须避光，10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，加入9ml甘油， 反复震荡混勻，调节PH为9.0，-20°C储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色，假如呈现 黄色或者橙色则需废弃并重新配制。用去离子水配制lmg/ml DAPI储存液。取2. 5ul的DAPI溶液(lmg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混 勻，-20°C避光密闭保存。(3)成品组装 实施例3 :P16基因检测试剂盒的使用方法以人类正常分裂中期淋巴细胞为例。(1)人外周血培养及染色体制备采血用肝素润湿注射针筒(0. 2ml)后，常规取静脉血1 2ml，转动针筒混勻肝 素。接种(在超净工作台中无菌操作)在每个培养瓶中(含20%血清的1640培养液5ml， pH7. 2)，加入全血0.25 0.30ml (7号针头13 15滴)、PHA 5mg，盖紧胶塞，轻轻摇勻。培 养将培养瓶放在37°C恒温培养箱内培养72h。终止培养前2 4h，加入0. 01%秋水仙素 溶液(100 u g/ml) 1 2滴(7号针头)，使终浓度为0. 2 u g/ml培养液。轻轻摇勻后，放回 培养箱继续培养2 4h。收获将培养后的血细胞收集在离心管中，平衡后lOOOr/min离 心8min，弃去上清。(2)样品处理低渗向离心管中加入37°C 0. O75mol/LKC1溶液至8ml，用吸管轻轻吹打混勻细 胞，置于37°C水浴箱温育15min。预固定向离心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液 1 2ml，用吸管轻轻吹打混勻后lOOOr/min离心8min，弃去上清。固定加入新配制的固 定液至8ml，室温静置30min。3000r/min离心8min，弃去上清。可再重复固定1次。制片 根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液(0. 5 1ml)，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管 吸取少量细胞悬液，滴至载玻片上，镜检。(3)制片取干净载玻片，重悬细胞后分别取3ul，10ul和30ul悬液滴加到载玻片上的不同 位置，注意不要重叠；室温下晾干；用20X物镜在相差显微镜下观察三个区域的细胞密度， 记录细胞没有明显重叠，且数量在100 200个以上所加的细胞悬液量；如果细胞密度及数 目合适，另取一张干净的载玻片，滴加适量的细胞悬液；如果滴加30ul悬液的区域仍然细 胞数目太少，另取30ul悬液重复滴到该区域，晾干，观察；如果滴加3ul悬液的区域仍然细 胞数目太多，用新鲜固定液稀释细胞悬液，重复步骤滴片观察。(4)玻片乙醇老化将热台加热到95度；取出盖玻片，擦干备用；一块折叠为方形的4 8层纱布，浸 透无水乙醇；在载玻片的杂交区域上各滴加160ul的无水乙醇；轻轻盖上24 X 24mm的盖玻 片，轻压紧；将载玻片置于95°C预热的热台上，盖上浸透了无水乙醇的纱布(完全覆盖载玻 片)，再盖上事先准备好的方形盖子(完全覆盖载玻片)，计时2分钟；从热台上去除盖子、 纱布，取下载玻片，轻轻去除盖玻片，继续预处理步骤。(5)玻片预处理玻片放入37士 1°C的1XPBS中孵育5分钟，胃蛋白酶溶液中消化15分钟；1XPBS 室温洗涤3分钟；多聚甲醛/PBS室温固定10分钟；1XPBS室温洗涤3分钟；70%、85%、 100%梯度乙醇脱水各3分钟；室温晾干玻片；继续杂交过程。(6)样品和探针同时变性从试剂盒中取出杂交液，震荡混勻，瞬时离心；加8ul的杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均勻分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆 盖盖玻片与载玻片接触的边缘；78士 1°C的热台上变性2分钟30秒；将玻片放入预热的杂 交盒中，避光，37士 1°C孵育过夜(约16小时)；继续杂交后洗涤步骤。(7)杂交后洗涤及复染一般洗涤方法(推荐使用)取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻 片；将玻片放入37 士 1 °C的50 %甲酰胺/2 X SSC洗涤15分钟；再将其放入2 X SSC的染色缸 中，37 士 1°C洗涤15分钟；再将其放入盛有0. 1% NP40/2XSSC的染色缸中，37 士 1°C洗涤5 分钟；室温70%、85%、100%梯度乙醇依次脱水各3分钟；暗处晾干。快洗方法取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入 73 士 1°C的0. 3 % NP40/0. 4 X SSC中，洗涤2分钟；再将其放入0. 1 % NP40/2 X SSC中，室温 洗涤2分钟；室温70%、85%、100%梯度乙醇依次脱水各3分钟；暗处晾干。复染滴加10ul DAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗 处存放，待观察。(8)结果分析在Olympus BX60荧光显微镜下，用WU、WG滤镜组分别观察DAPI复染的分裂相和 杂交的荧光信号，用C⑶照相记录。在40X物镜下寻找，在100X物镜下计数；调整合适的 焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时，要 注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到信 号点；记录观察每个细胞中的P16基因数目。(9)结果判定按处理方法要求进行操作，记录P16基因数目(参见附图2)。荧光原位杂交结果 显示，中期染色体上可见两个信号点，未见其它荧光信号；间期细胞核中仅见两个信号点， 未见其它荧光信号。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120> 一种人染色体P16基因探针的制备方法及其应用<140><141><160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220> <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1atccaacatgccatagctcc<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>2tttgtcccatgtcactggaa
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权利要求
一种人染色体P16基因探针的制备方法，其特征在于制备步骤包括(1)克隆筛选P16基因位于人染色体9p21区段，挑选包含有该基因的克隆；(2)克隆培养和鉴定购买克隆，取适量克隆菌液添加到500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养24～48小时；使用STS引物对进行克隆鉴定；(3)P16基因探针制备对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过适当稀释质粒DNA，对质粒DNA定量；然后，通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩；获得P16探针，避光、-20℃储存；(4)P16基因探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。
2.根据权利要求1的方法，其特征还在于克隆筛选步骤中挑选的克隆号为 RP11-149I2。
3.根据权利要求1的方法，其特征还在于克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物序列 分别为上游引物 5，-ATCCAACATGCCATAGCTCC-3，和下游引物 5，-TTTGTCCCATGTCACTGGAA-3。
4.根据权利要求1的方法，其特征还在于克隆培养和鉴定步骤中PCR扩增条件均为 950C 5 分钟；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 45 秒)X 40 循环；72°C 10 分钟。
5.根据权利要求1的方法，其特征还在于P16基因探针标记的荧光素为荧光素标记的 dUTPo
6.一种P16基因探针检测试剂盒，包括1)杂交液、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包 装这些试剂瓶或管的包装盒，其中杂交液由杂交缓冲液、荧光标记的P16基因探针和H2O配 制而成，其特征在于每人份杂交液中使用P16基因探针的量为1. 5ul 3ul，杂交缓冲液为 7ul。
7.根据权利要求6的试剂盒，其特征还在于杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度为50% 70%。
全文摘要
本发明涉及一种人染色体P16基因探针的制备方法，还涉及利用人染色体P16基因探针制备一种人染色体P16基因检测试剂盒，应用本发明的人染色体P16基因探针及相应的试剂盒可以对人染色体P16基因异常进行准确、快速的检测。
文档编号C12Q1/68GK101886104SQ20091003941
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者何瑰, 李明, 陈娟 申请人:中山大学达安基因股份有限公司