一种实时荧光rt-pcr检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒的制作方法

专利名称：一种实时荧光rt-pcr检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光RT-PCR检测甲型Hmi流感病毒的试剂盒，特别是涉及 以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术早期、快速诊断甲型Hmi流感病 毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对咽拭 子、鼻咽分泌物等呼吸道样本以及血清等样品中的甲型Hmi流感病毒进行早期快速诊断。
背景技术：
流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三种流感病毒引起的急性呼吸道传染病。甲 型流感病毒根据其表面(H和N)结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型，至今甲型流 感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶9个亚型(N1-N9)。猪流感是一种因甲型流感病毒引起的猪呼吸系统疾病。猪流感病毒属于正粘病毒 科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenza virus A)。典型病毒颗粒呈球状，直 径为80nm 120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神 经氨酸酶NA和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为lOnm。猪流感病毒为 单股负链RNA病毒，基因组约为13. 6kb，由大小不等的8个独立片段组成。尽管不同亚型之 间可以组成很多种流感病毒血清型，但从猪身上分离到四种主要的亚型H1N1、H1N2、H3N2 和H3m，而造成人感染猪流感病毒的血清型主要为其中的三种H1N1、H1N2和H3N2。猪流感病毒在猪群中全年可以传播，但多数暴发于秋季末期和冬季，发病率较高， 病死率较低。猪是人源、禽源和猪源流感病毒的惟一共同易感宿主，它能将猪流感病毒传播 给人或鸟类。美国曾于1976年在新泽西州迪克斯堡的士兵中出现猪流感爆发，引起200多 例病例，其中至少4名士兵进展成肺炎，1人死亡，该病毒与当时从猪体内分离的病毒相同， 首次证实了在自然条件下，猪流感病毒可从猪传播给人。1988年，美国出现了猪流感人际间 传播的迹象，接触过一例猪流感病例的医护人员中出现了轻微的流感样疾病，并在血清中 检测出猪流感抗体。2005年12月至2009年2月期间，美国共报道了 12例人感染猪流感病 例，但均未出现死亡。1999年10月，香港1名10月龄女婴感染了猪流感病毒H3N2，现已完 全康复。这些年来，世界各地都有人感染猪流感病毒不同病毒株的报道，但并没有大规模流 行。2009年3月，墨西哥和美国等先后发生人感染猪流感病毒，为甲型流感病毒，H1N1 亚型猪流感病毒毒株，该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片断，是 一种新型猪流感病毒，世界卫生组织(WHO)称之为甲型Hmi流感病毒，可以人传染人。自 2009年4月23日起，截至4月27日，全球共4个国家报道了实验室确诊的人感染甲型Hmi 流感病毒病例，其中美国共计40例，均为轻症病例；墨西哥确诊26例，其中7例死亡；加拿 大和西班牙分别报告了 6例和1例，均无死亡病例。甲型Hmi流感病毒可直接从猪传播至人，亦可出现人际间传播。感染病毒的猪或 人是主要的感染来源，隐性感染者也具有传染性。人也可能通过接触到被甲型Hmi流感病 毒污染的物品后触摸口鼻而获得感染，因此，被甲型Hmi流感病毒污染的环境也是潜在的感染来源。传播途径与季节性流感类似。人感染甲型Hmi流感病毒后，现有资料表明，传染期为发病前1天至发病后7天。 若病例发病7天后仍有发热症状，表示仍具有传染性。儿童，尤其是幼儿，传染期可能长于 7天。潜伏期目前尚不明确，参照流感的潜伏期一般为1-3天。临床症状与流感相似，包括 发热、咳嗽、咽痛、躯体疼痛、头痛、畏寒和疲劳等。有些人还会出现腹泻和呕吐，病情可迅速 进展，突然高热、肺炎，重者可以出现呼吸衰竭、多器官损伤，导致死亡。近期分离到的该病 毒对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感，对金刚烷胺和金刚乙胺耐药。因此，世界卫生组织和美 国CDC均建议使用奥司他韦或扎那米韦治疗和预防人感染甲型mm流感病毒，但尚无有效 的预防疫苗。甲型Hmi流感病毒与流感、禽流感、上感、肺炎、SARS、传染性单核细胞增多症、巨 细胞病毒感染、军团菌肺炎、衣原体、支原体肺炎等在症状上很难鉴别。正由于缺乏有效的 疫苗，症状上鉴别非常困难，因此在如此严峻的疫情情况下急需开发一种早期快速诊断甲 型Hmi流感病毒感染的试剂盒。目前常用的检查流感病毒方法包括快速流感抗原检测、免疫荧光法(或装配的 IFA)，这两种方法区分A和B型流感病毒，但对人感染甲型Hmi流感病毒临床标本的敏感 性和特异性未知，阴性结果可能是假阴性，不能作为甲型Hmi流感病毒感染的最后诊断。 病毒培养，并进行病毒的全基因组序列测定，虽可以甲型Hmi流感病毒感染，但无法为临 床诊断及时提供结果，且灵敏度较低，因此不能排除感染甲型Hmi流感病毒。因此卫生部 印发的《人感染猪流感预防控制技术指南(试行)》中推荐用实时荧光(Real-time) RT-PCR 方法进行检测，由于其方法学上具有简便快速、灵敏度和特异性高的特点，可以实现早期快 速诊断。但目前国内外均尚未开发出检测甲型Hmi流感病毒实时荧光RT-PCR试剂盒，因 此开发该试剂盒成为当务之急。实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶 联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩 增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号， 并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光 PCR 的一禾中(Martell, M. , J. Gomez, J. Esteban, S. Sauleda, J. Quer, B. Cabot, R. Esteban, and J.Guardia.1999.High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis Cvirus RNA. J. Clin. Microbiol. 37 327~332 ；Lee Cff, Suarez DL.2004.Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5and H7subtype avian influenza virus. J Virol Methods. 119(2) : 151-8。)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR 相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相 同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探 针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过 程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团 相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的 进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。传统的RT-PCR由两个单独的反应程序或步骤完成，第一步是通过逆转录酶作用，将RNA逆转录成cDNA ；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA为模板进行PCR 扩增。与传统的RT-PCR相比较，一步法实时荧光RT-PCR技术具有如下优点1、将逆转录和 PCR扩增两个在不同反应管中分开进行的二个反应程序合并成一个反应程序，在一个PCR 反应管中完全闭管完成检测过程，大大节省了反应时间；2、通过对扩增曲线以及对数增长 期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检 测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；3、将RNA逆转录、DNA扩增与检 测三过程融合为一体，可以实时、动态监测RNA扩增的全过程，省掉了 PCR产物后处理过程， 大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；4、由于采取一种封闭的检测模式， 从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；5、由于在普通RT-PCR基础上增加了一条可 与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在RNA 样品的检测和分析中，已逐渐取代传统的RT-PCR方法，得到十分广泛的应用。我国食品与药品管理局(SFDA)已经批准了诸如HIV-1、HCV等病原体的一步法实 时荧光RT-PCR检测试剂盒的生产与临床应用。因此，通过一步法实时荧光RT-PCR方法开发 一种检测甲型Hmi流感病毒的试剂盒在技术上是可行的，它的应用将极大满足甲型mm 流感病毒快速检测与监测工作的需要。众所周知，在使用已知的一步法实时荧光RT-PCR技术检测和定量分析样品中某 特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确 性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计、筛选及制备适当 的引物和寡核苷酸探针。本发明人在此基础上利用一步法实时荧光RT-PCR技术发明了一 种检测甲型Hmi流感病毒的试剂盒，应用于甲型Hmi流感病毒的检测和分析。

发明内容
本发明涉及一种实时荧光RT-PCR检测甲型Hmi流感病毒的试剂盒，特别是涉及 以一步法实时荧光RT-PCR反应技术早期、快速诊断甲型Hmi流感病毒感染的试剂盒。本试 剂盒可以检测咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道样本以及血清等样品中的甲型Hmi流感病毒。本发明的目的是提供一种使用一步法实时荧光RT-PCR技术检测样品中甲型Hmi 流感病毒的试剂盒，特别是涉及甲型Hmi流感病毒的早期感染在实验室诊断中的应用。其 基本原理是利用一对寡核苷酸的特异性引物和一条寡聚核苷酸的特异性探针，在逆转录酶 (RT酶)、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂(RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以 及Mg2+等RT-PCR反应缓冲液中，通过DA7600、ABI7500等市售的荧光PCR扩增仪实现靶多 核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案1)使用适当的核酸分析软件分别对已知的甲型Hmi流感病毒HI型HA基因和m 型NA基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引 物设计软件(例如Primer Express 2)选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引 物和探针均具有互补于甲型Hmi流感病毒的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有 同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了甲型Hmi流感病毒检测 的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记 作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联 上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变 性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20% )电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。3)适宜于一步法实时荧光RT-PCR扩增的反应体系。反应体系包括逆转录酶、热启 动Taq酶、2’ -脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能 够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端 分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。由于要 确认甲型Hmi流感病毒，需要分别确认HI亚型和m亚型，因此本试剂盒试剂的反应体系 将包括HI亚型反应体系和m亚型反应体系两种体系。4)从待测样本中提取RNA，分别加入前述的反应体系中，直接经一步法RT-PCR扩 增，从荧光扩增曲线判断是否存在甲型Him流感病毒。本发明所提供的检测样品中甲型Him流感病毒的试剂盒包括(1)分别装有RNA 提取液(即TRIZ0L核酸抽提试剂)、H1亚型反应体系、m亚型反应体系、阴性质控品、HI亚 型阳性质控品、N1亚型阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装 这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的另一个优选实施方案，其中HI亚型反应体系包括HI亚型引物探 针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系；m亚型反应体系包括m亚型引物探针混合液、 RT-PCR反应液、RT-PCR酶系。HI亚型反应体系和附亚型反应体系中RT-PCR反应液、RT-PCR 酶系的组分相同。根据本发明的另一个优选实施方案，其中HI亚型引物探针混合液由(a)与双链靶 多核苷酸的第一条链结合的HI亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合 的HI亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和 荧光淬灭基团的HI亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5 15pmol/反应，优 选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。根据本发明的另一个优选实施方案，其中HI亚型引物探针混合液中HI亚型正向 引物的序列为5，-GGCCATTGCCGGTTTCA-3’ (SEQ ID NO :1)，HI亚型反向引物的序列为5’ -TTGTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3，(SEQ ID NO :2)，正、反向引物可向 5，和 3，端方向各延 伸10个碱基。根据本发明的另一个优选实施方案，其中HI亚型引物探针混合液中HI亚型寡核 苷酸探针的序列为5’ -ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-3’ (SEQ ID NO :3)。根据本发明的另一个优选实施方案，其中m亚型引物探针混合液由(a)与双链靶 多核苷酸的第一条链结合的m亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合 的m亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和 荧光淬灭基团的m亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5 15pmol/反应，优 选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。根据本发明的另一个优选实施方案，其中m亚型引物探针混合液中m亚型正向 引物的序列为:5，-CCAGTATCGTCTAATGGAGCAAAT-3，(SEQ ID NO 4), N1 亚型反向引物的序 列为5，-AATGCTTTTAGTTCTCCCTATCCAA-3，(SEQ ID NO :5)，正、反向引物引物可向 5，和 3，端方向各延伸10个碱基。根据本发明的另一个优选实施方案，其中m亚型引物探针混合液中m亚型寡核 苷酸探针的序列为5，-CACCATTGCCGTATTTGAATGAAAACCC-3，(SEQ ID NO :6)。根据本发明的另一个优选实施方案，RT-PCR反应液包括一步法RT-PCR反应缓冲 液和 DEPC 水，其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)、150mmol/L KC1、2. Ommol/L MgCl2。根据本发明的另一个优选实施方案，RT-PCR酶系由逆转录酶(RT酶)、热启动Taq 酶、RNasin, dNTPs、酶系稀释液组成，其中RT酶用量为1. 5 3. 5U/反应、热启动Taq酶用 量为3 7U/反应、RNasin用量为15 25U/反应、dNTPs浓度为0. 20mmol/L,酶系稀释液 为一般市售的酶系稀释液。根据本发明的一个优选实施方案，其中阴性质控品为去离子水，HI亚型阳性质控 品为含有HI亚型HA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的 载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，附亚型阳性 质控品为含有m亚型NA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市 售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，HI亚型 阳性质控品和m亚型阳性质控品浓度均为1 X 106拷贝/ml。根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间 为50°C逆转录 15min，1 个循环；94°C 15min, 1 个循环；最后 95°C 15s，55 60°C 45s，45 个 循环(收集荧光信号)。根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是咽拭子、鼻咽分泌物 等呼吸道样本以及血清等样品。本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR试剂盒可以检测出甲型Hmi流感病毒的最 低浓度为1.0X102COpieS/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。本发明分别针对甲型Hmi流感病毒HI亚型HA基因和附亚型NA基因设计特异性 引物和探针，可检测出甲型Hmi流感病毒，但不能检测出禽流感病毒H5/H7/H9亚型、普通 人流感Hmi型、猪流感病毒Hmi型、呼吸道合胞病毒、人流感病毒A型、人流感病毒B型、 副流感病毒、腺病毒等流感病毒样本或其他呼吸道病原体样本，说明本试剂盒具有很好的 特异性。本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒可以检测咽拭子、鼻咽分泌物 等呼吸道样本以及血清等样品中的甲型Hmi流感病毒；可为灵敏、快速早期诊断甲型Hmi 流感病毒感染提供可靠的实验证据。


图1显示HI亚型阳性质控品、N1亚型阳性质控品和阴性质控品的检测结果。HI 亚型阳性质控品、m亚型阳性质控品扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳 性。阴性质控品扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有ct值，可明确判定为阴性。图2显示特异性参考品的检测结果。10份特异性参考品的扩增曲线平直或斜向 下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。10份特异性参考品分别为禽流感病毒 H5/H7/H9亚型、普通人流感病毒Hmi型、猪流感病毒Hmi型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、人流感病毒A型、人流感病毒B型、副流感病毒等其他呼吸道病毒。图3显示灵敏度参考品的检测结果。8份灵敏度参考品中除了浓度为 l.OXlO'copies/ml的HI亚型HA基因的质粒和附亚型NA基因的质粒样本扩增曲线平直 或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。其余样本均可明确判定为阳性。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 甲型Hmi流感病毒检测试剂的研制1、引物和探针的设计通过对已报导甲型Hmi流感病毒的核酸序列进行序列比 对分析，分别以甲型Hmi流感病毒HI亚型HA基因和m亚型NA基因为扩增靶位点，选择 无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对 引物和探针。2、临床样本的选择根据国内外相关文献报道表明，可以咽拭子、鼻咽分泌物等呼 吸道样本以及血清等样品3、反应体系的建立与优化样品的准备以构建的含有目的扩增区域的质粒作为甲型Hmi流感病毒检测的 阳性质控品；以禽流感病毒H5/H7/H9亚型、普通人流感病毒Hmi型、猪流感病毒Hmi型、 呼吸道合胞病毒、腺病毒、人流感病毒A型、人流感病毒B型、副流感病毒作为特异性参考 品；以去离子水作为阴性质控品，分别用TRIZ0L提取上述阳性质控品与特异性参考品的 RNA，阴性质控品待用。引物探针的筛选以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性质控品与 阴性参考品的RNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合。 (如序列表中 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 6)。引物探针浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从2pmol/ 反应至15pmol/反应梯度的引物和从2pmol/反应至15pmol/反应浓度梯度的探针进行PCR 反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在5 15pmol/反应之间均可，其中最佳的引物 浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。镁离子浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从lmmol/L 至2. 5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓 度为 2. 0mmol/Lo热启动Taq酶用量的优化在25 y L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用 从1U (酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定 最佳的热启动Taq酶用量为3 7U/反应。RT酶用量的优化在25 PL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从 1U (酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳 的RT酶用量为1. 5 3. 5U/反应。RNasin用量的优化在25y L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从 5U(酶单位)至40U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最 佳的RNasin用量为15 25U/反应。
dNTPs浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0. lmmol/L 至0. 25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs 浓度为 0. 20mmol/Lo反应温度的优化根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时 间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为50°C逆转录15min，l 个循环；94°C 15min，l个循环；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45个循环(收集荧光信号)。实施例2 甲型Hmi流感病毒检测试剂盒及其使用1、制备包括下列组成成分的试剂盒RNA提取液(50ml/管)1管、HI亚型引物探针 混合液(50 ill/管)1管、N1亚型引物探针混合液(50 ill/管)1管、RT-PCR反应液(720 u 1/ 管)1管、RT-PCR酶系(150 ill/管)1管，阴性质控品(200 yl/管)1管、HI亚型阳性质控 品(lOOyl/管)1管、N1亚型阳性质控品(100 ill/管)1管。2、标本采集、运送和保存由临床医师根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括，咽拭子、鼻咽分泌 物、血清。采集方法如下①鼻咽分泌物自然咳痰或诱导吸痰(如，氧气正压法、一次性婴 儿吸痰管法和雾化蒸气吸入法)，吸取痰液，密封送检；②咽拭子拭子擦拭双侧咽扁桃体 及咽后壁，将拭子浸入4-5ml采样液中，密封送检；③血清无菌采集静脉血约1ml，分别于 室温和4°C静置2小时和1小时后，离心(8，000rpm，5分钟)分离并收集血清标本。标本可立即用于测试，也可以保存于-70°C待测，保存期为6个月。标本运送采用 0°C冰壶3、检测步骤⑴RNA提取取上述类型的样本各100 ill (样品不足100 U 1时请补加适量生理盐水重悬)，放 置于1. 5ml灭菌离心管，加入200 u 1 Trizol试剂及100 u 1氯仿，用振荡器强力振荡20秒
后静置3分钟；2 8°C下12，OOOrpm离心lOmin，吸取上清至另一干净的1. 5ml离心管；加入0. 2ml氯仿，盖紧盖子，手动用力颠倒摇动15s (不可用振荡器)，室温孵育 2 3min ；2 8°C下12000rpm离心15min后，取最上层的上清液至另一干净的1. 5ml离心 管；加入0. 5ml预冷的异丙醇，缓慢颠倒充分混勻后，_20°C静置15min，2 8°C， 12000rpm离心lOmin，小心弃尽上清液；加入1ml预冷的70 %的冰冷乙醇，手动颠倒数次洗涤沉淀，2 8°C，8000rpm离 5min，小心弃尽上清液；空气或真空干燥5 lOmin，加入50 ii 1 DEPC H20，55 60°C下孵育lOmin，手指 轻轻弹打管底，使其充分溶解，直接用于实验或-70°C保存备用。(2)PCR反应与结果分析分别取HI亚型引物探针混合液2 ill、RT-PCR反应液15 yl、RT-PCR酶系3 yl配 制成HI亚型反应体系；取m亚型引物探针混合液2 ill、RT-PCR反应液15 ill、RT-PCR酶 系3 ill配制成m亚型反应体系。
取阴性质控品、标本、HI亚型阳性质控品、m亚型阳性质控品各5 ill，分别加入HI 亚型反应体系和m亚型反应体系中使用市售的荧光定量PCR仪(如ABI7500)进行PCR扩 增。PCR循环条件是50°C逆转录15min，l个循环；94°C 15min，1个循环；最后95°C 15s, 55 60°C 45s, 45个循环(收集荧光信号)。反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。 如扩增曲线有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。实施例3 应用甲型Hmi流感病毒检测试剂盒检测样品以实施例1中的阳性质控品、阴性质控品、特异性参考品作为待检样本，按照实施 例2的方法分别检测这些样本，阳性质控品检测结果为阳性，阴性质控品和特异性参考品 检测结果均为阴性(参见附图1，2)。实施例4 甲型Hmi流感病毒检测试剂盒灵敏度实验分别由浓度为 1. 0X104copies/ml、l. 0X103copies/ml、l. 0X102copies/ml、 1. OXIO'copies/ml的含有甲型Hmi流感病毒HI亚型HA基因的质粒和附亚型NA基因的 质粒组成灵敏度参考品，按照实施例2的方法分别检测这8份样本，检测结果表明，本试剂 盒的灵敏度为1. OX 102COpieS/ml (见附图3)。序列表<110>中山大学达安基因股份有限公司<120> 一种实时荧光RT-PCR检测甲型Hmi流感病毒的试剂盒<140><141><160>6
<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>1ggccattgccggtttca<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>2ttgttagtaatctcgtcaatggcatt<210>3<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。<400>3atatgcagccgacctgaagagcacaca<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>4ccagtatcgtctaatggagcaaat<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>5aatgcttttagttctccctatccaa<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。<400>6caccattgccgtatttgaatgaaaaccc
权利要求
一种实时荧光RT-PCR检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，试剂盒包括(1)分别装有RNA提取液、H1亚型反应体系、N1亚型反应体系、阴性质控品、H1亚型阳性质控品、N1亚型阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中H1亚型反应体系包括H1亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系，其特征在于H1亚型引物探针混合液中H1亚型正向引物的序列为5’-GGCCATTGCCGGTTTCA-3’，H1亚型反向引物的序列为5’-TTGTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3’，正、反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于Hl亚型引物探针混合液中Hl亚型寡核苷 酸探针的序列为5’ -ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-3，。
3.根据权利要求ι的试剂盒，其中m亚型反应体系包括m亚型引物探针混合 液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系，其特征还在于附亚型引物探针混合液中附亚型正 向引物的序列为5’ -CCAGTATCGTCTAATGGAGCAAAT-3’，附亚型反向引物的序列为 5’-AATGCTTTTAGTTCTCCCTATCCAA-3’，正、反向引物引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱 基。
4.根据权利要求ι的试剂盒，其特征还在于m亚型引物探针混合液中m亚型寡核苷 酸探针的序列为5’ -CACCATTGCCGTATTTGAATGAAAACCC-3，。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于Hi亚型正、反向引物，m亚型正、反向引物 的浓度均为5pmol/反应，Hl亚型寡核苷酸探针、Nl亚型寡核苷酸探针的浓度均为5pmol/ 反应。
6.根据权利要求1的试剂盒，RT-PCR酶系由逆转录酶(RT酶)、热启动Taq酶、RNasin、 dNTPs、酶系稀释液组成，其特征还在于其中RT酶用量为1. 5 3. 5U/反应、热启动Taq酶 用量为3 7U/反应、RNasin用量为15 25U/反应、dNTPs浓度为0. 20mmol/L。
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的最佳反应温度和时间为50°C 逆转录15min，1个循环；94°C 15min, 1个循环；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45个循环(收 集荧光信号)。
全文摘要
本发明涉及一种实时荧光RT-PCR检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术早期、快速诊断甲型H1N1流感病毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道样本以及血清等样品中的甲型H1N1流感病毒进行早期快速诊断。
文档编号C12R1/93GK101886136SQ200910039409
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者何蕴韶, 李明, 陈华云, 高秀杰 申请人:中山大学达安基因股份有限公司