专利名称：一种猪流感病毒实时荧光rt-pcr分型试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪流感病毒分型试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转 录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行猪流感病毒分型的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵 敏度和特异性，通过本发明的试剂盒对呼吸道样本、血清、肺组织等样品中的猪流感病毒进 行分型，从而实现猪流感病毒的早期快速诊断，监控其流行趋势。
背景技术：
猪流感(Si)是一种因猪流感病毒引起的猪呼吸系统疾病，此病在世界各地都有 发生，危害严重，经济损失巨大，并对人类的健康构成威胁。猪流感病毒(SIV)属于正粘病 毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenza virus Α)。典型病毒颗粒呈球状， 直径为SOnm 120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、 神经氨酸酶NA和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为lOnm，它含核蛋白 (neucleoprotein,NP), 3禾中多聚酶蛋白(polymerase protein Ι,ΡΒΙ ；polymerase protein 2，PB2 ；polymerase protein A)和病毒单链RNA。猪流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组 约为13. 6kb，由大小不等的8个独立片段组成。猪流感病毒能够在多种动物的细胞和鸡胚 增殖。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性无明显的区分。由于病毒受到抗体的压力 很大，因此病毒的变异频繁。尽管不同亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型，但从猪身 上分离到四种主要的亚型Hmi、HlN2、H3N2和H3W，其中有三种亚型造成人感染，分别为 HlNU H1N2 和 H3N2。猪流感病毒在猪群中全年可以传播，但多数暴发于秋季术期和冬季，具有高发病 率(几乎100% )和低病死率(病死率< )的特点。猪流感病毒感染可使患病猪生产性 能下降，推迟上市；还可引起呼吸道细菌和病毒继发或混合感染，使疫情更为严重，造成猪 只死亡。猪是人源、禽源和猪源流感病毒的惟一共同易感宿主，因此猪在禽-猪-人的流感 种间传播过程中，起着中间宿主及多重宿主的作用，它能将猪流感病毒传播给人或鸟类。美 国曾于1976年在新泽西州迪克斯堡的士兵中出现猪流感爆发，引起200多例病例，其中至 少4名士兵进展成肺炎，1人死亡，该病毒与当时从猪体内分离的病毒相同，首次证实了在 自然条件下，猪流感病毒可从猪传播给人。1988年，美国出现了猪流感人际间传播的迹象， 接触过一例猪流感病例的医护人员中出现了轻微的流感样疾病，并在血清中检测出猪流感 抗体。2005年12月至2009年2月期间，美国共报道了 12例人感染猪流感病例，但均未出 现死亡。1999年10月，香港1名10月龄女婴感染了猪流感病毒H3N2，现已完全康复。这 些年来，世界各地都有人感染猪流感病毒不同病毒株的报道，但并没有大规模流行。2009年 3月，墨西哥及美国等部分地区暴发了人感染猪流感疫情，即甲型Hmi流感病毒感染，可以 人传染人，可能出现全球性爆发流行的潜在危险。人感染猪流感的潜伏期尚不明确，参照流感的潜伏期一般为1-3天。临床症状与 流感相似，包括发热、咳嗽、咽痛、躯体疼痛、头痛、畏寒和疲劳等。有些人还会出现腹泻和呕 吐，甚至引起严重疾病(肺炎和呼吸衰竭)和死亡。人感染猪流感病毒后，现有资料表明，传染期为发病前1天至发病后7天。若病例发病7天后仍有发热症状，表示仍具有传染性。 儿童，尤其是幼儿，传染期可能长于7天。猪作为流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程中起着 重要的作用。由于猪上皮细胞具有唾液酸2，6-半乳糖苷和唾液酸2，3-半乳糖苷，人流感 病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合，因此，猪上皮细胞就能够被人流感病毒和禽 流感病毒感染，而成为毒株间基因重组的活载体。1998年从美国北卡罗来纳州分离到一株 H3N2亚型SIV，其HA，NA和PBl基因为人型流感病毒基因，M，NP和NS基因为猪型流感病毒 基因，PB2、PA基因为禽型流感病毒基因。1978年，日本暴发的H1N2 SIV是由Hmi和H3N2 基因重组而产生的新亚型。国内从山东猪分离出H9N2流感病毒，分析可能是由鸡和鸭流感 病毒重组的结果。继H9N2亚型流感病毒1998年首次从猪群中分离到，研究表明，通过进行 部分序列分析发现，猪源H9N2亚型与国内分离的禽流感病毒高度同源。SI和人流感之间也 可以发生交叉感染和传播。1978年，从台湾的一个猪群中分离到了 H3N2亚型SIV，通过测 序发现，此病毒发生了人流感病毒和SI病毒基因片段的重组。2009年墨西哥和美国出现的 甲型Hmi流感病毒，被认为该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片 断。因此研究SIV在不同时间和地域的型别变化，开展相应的流行病学调查，可以预 测人流感的发展趋势，具有深远的公共卫生学意义。由于本病的流行和危害日益严重，因此 对SIV分型研究已成为国内外兽医界、医学界和微生物学界的热点之一。目前常用的猪流感病毒分型检测方法包括1)血清学方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫法、血凝抑制试验等， 这些血清学的方法需要对样本预先进行鸡胚或组织培养，无法实现快速诊断，且需要相当 完整的靶抗原和型特异性的免疫血清，操作步骤繁琐。2)核酸检测方法；包括RT-PCR方法，由于PCR技术具有简便、快速、灵敏、特异性 强等特点，可用于猪流感病毒分型检测和分子流行病学调查等，是实现猪流感病毒快速分 型检测的推荐方法。基因芯片方法，该方法具有快速、灵敏和通量高等优点，但价格昂贵，不 利于大规模推广。测序分型和全基因组测序的方法，具有准确度高，获取的信息量大的特 点，可进行病毒的进化分析，但其对仪器的要求高，检测时间较RT-PCR和基因芯片长。实时荧光(Real-time)RT-PCR技术是在RT-PCR技术上发展起来的。实时荧光 PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR 扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按 照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总 到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光PCR的一种(Martell， Μ.，J. Gomez, J. Esteban，S. Sauleda，J. Quer, B. Cabot, R. Esteban，and J. Guardia. 1999. High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis Cvirus RNA. J. Clin. Microbiol. 37:327-332 ;Lee CW, Suarez DL 2004. Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus. J Virol Methods. 119 (2) :151_8。)，它是一禾中 直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于前者在反应体系 中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处 于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出 荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程 中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振 能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩 增而呈现线性增强。传统的RT-PCR由两个单独的反应程序或步骤完成，第一步是通过逆转录酶作用， 将RNA逆转录成cDNA ；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA为模板进行PCR 扩增。与传统的RT-PCR相比较，一步法实时荧光RT-PCR技术具有如下优点1、将逆转录和 PCR扩增两个在不同反应管中分开进行的二个反应程序合并成一个反应程序，在一个PCR 反应管中完全闭管完成检测过程，大大节省了反应时间；2、通过对扩增曲线以及对数增长 期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检 测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；3、将RNA逆转录、DNA扩增与检 测三过程融合为一体，可以实时、动态监测RNA扩增的全过程，省掉了 PCR产物后处理过程， 大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；4、由于采取一种封闭的检测模式， 从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；5、由于在普通RT-PCR基础上增加了一条可 与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在RNA 样品的检测和分析中，已逐渐取代传统的RT-PCR方法，得到十分广泛的应用。我国食品与药品管理局(SFDA)已经批准了诸如HIV-1、HCV等病原体的一步法实 时荧光RT-PCR检测试剂盒的生产与临床应用。因此，通过一步法实时荧光RT-PCR方法开 发一种猪流感病毒分型试剂盒在技术上是可行的，再加之其方法学上具有简便快速、灵敏 度和特异性高的特点，可以实现早期快速分型检测。但目前国内外均尚未开发出检测猪流 感病毒实时荧光RT-PCR分型试剂盒，因此开发该试剂盒成为当务之急，它的应用将极大满 足猪流感病毒快速分型检测与监测工作的需要。在使用已知的一步法实时荧光RT-PCR技术检测和定量分析样品中某特定靶核酸 的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键 性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计、筛选及制备适当的引物和寡核 苷酸探针。本发明人在此基础上利用一步法实时荧光RT-PCR技术发明了一种进行猪流感 病毒分型的试剂盒，应用于猪流感病毒分型检测及流行状况监测。
发明内容
本发明涉及一种猪流感病毒分型试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转 录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行猪流感病毒分型的试剂盒。本试剂盒可以对呼吸道 样本、血清、肺组织等样品中的猪流感病毒进行分型。本发明的目的是提供一种使用一步法实时荧光RT-PCR技术进行猪流感病毒分型 的试剂盒，特别是涉及猪流感病毒的早期感染在实验室诊断中的应用及其流行状况监测。 其基本原理是利用一对寡核苷酸的特异性引物和一条寡聚核苷酸的特异性探针，在逆转录 酶(RT酶)、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂(RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 以及Mg2+等RT-PCR反应缓冲液中，通过DA7600、ABI7500等市售的荧光PCR扩增仪实现靶 多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。
为了实现本发明，我们采用了以下技术方案1)使用适当的核酸分析软件分别对已知的猪流感病毒Hl型、H3型HA基因和m 型、N2型NA基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适 当的引物设计软件(例如Primer Express 2)选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设 计的引物和探针均具有互补于猪流感病毒相应型别的序列，而且与其他病原体的核苷酸序 列没有同源性，不同型别的猪流感病毒之间不存在交叉反应的情况，也不包括任何常见的 核酸内切酶的酶切位点，所以提高了猪流感病毒分型检测的可靠性和准确度。2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析 法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记 作为荧光发生基团(报告基团)&6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联 上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变 性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20% )电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。3)适宜于一步法实时荧光RT-PCR扩增的反应体系。反应体系包括逆转录酶、热启 动Taq酶、2’ _脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能 够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端 分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。由于要 分别确认H抗原和N抗原的型别，两者结合起来才能判断猪流感病毒的具体亚型，因此本试 剂盒试剂的反应体系将包括四种分别是Hl亚型反应体系、H3亚型反应体系、m亚型反应 体系和N2亚型反应体系。4)从待测样本中提取RNA，分别加入前述的反应体系中，直接经一步法RT-PCR扩 增，从荧光扩增曲线判断猪流感病毒的型别。本发明所提供的样品中猪流感病毒进行分型的试剂盒包括(1)分别装有RNA提 取液(即TRIZOL核酸抽提试剂)、H1亚型反应体系、H3亚型反应体系、m亚型反应体系和 N2亚型反应体系、阴性质控品、Hl亚型阳性质控品、H3亚型阳性质控品、Nl亚型阳性质控 品和N2亚型阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶 或管的包装盒。根据本发明的另一个优选实施方案，其中Hl亚型反应体系包括Hl亚型引物探 针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系；H3亚型反应体系包括H3亚型引物探针混合液、 RT-PCR反应液、RT-PCR酶系；附亚型反应体系包括附亚型引物探针混合液、RT-PCR反应 液、RT-PCR酶系；N2亚型反应体系包括N2亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶 系。其中Hl亚型反应体系、H3亚型反应体系、附亚型反应体系、N2亚型反应体系中RT-PCR 反应液、RT-PCR酶系的组分均相同。根据本发明的另一个优选实施方案，其中Hl亚型引物探针混合液由(a)与双链靶 多核苷酸的第一条链结合的Hl亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合 的Hl亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和 荧光淬灭基团的Hl亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5 15pmol/反应，优 选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。根据本发明的另一个优选实施方案，其中Hl亚型引物探针混合液中Hl亚型正向 引物的序列为:5，-TGGCACCAAGATATGCTTTTG-3，(SEQ ID NO 1), Hl亚型反向引物的序列为5，-CAAGTCGCATTGCAGTCATG-3’ (SEQ ID NO :2)，正、反向引物可向 5，和 3，端方向各延 伸10个碱基。根据本发明的另一个优选实施方案，其中Hl亚型引物探针混合液中Hl亚型寡核 苷酸探针的序列为5’ -CGGGTATCATAACATCGGATGCACCA-3’ (SEQ ID NO :3)。根据本发明的另一个优选实施方案，其中H3亚型引物探针混合液由(a)与双链靶 多核苷酸的第一条链结合的H3亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合 的H3亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和 荧光淬灭基团的H3亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5 15pmol/反应，优 选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。根据本发明的另一个优选实施方案，其中H3亚型引物探针混合液中H3亚型正向 引物的序列为5，-CGTCGTGAAAGCGTGAACAG-3，(SEQ ID NO :4)，H3亚型反向引物的序列为 5，-CGGCATGGTCACGTTCAG-3，(SEQ ID NO :5)，正、反向引物可向 5，和 3，端方向各延伸 10
个碱基。根据本发明的另一个优选实施方案，其中H3亚型引物探针混合液中H3亚型寡核 苷酸探针的序列为5，-CCGTCTGAACTGGCTGCATAACCTGG-3，(SEQ ID NO :6)。根据本发明的另一个优选实施方案，其中m亚型引物探针混合液由(a)与双链靶 多核苷酸的第一条链结合的W亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合 的m亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和 荧光淬灭基团的m亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5 15pmol/反应，优 选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。根据本发明的另一个优选实施方案，其中m亚型引物探针混合液中m亚型正向 引物的序列为5，-GACCTTGCTTTTGGGTTGAACT-3’ (SEQ ID NO 7), Nl亚型反向引物的序列 为5，-AAGGATATGCTGCTCCCACTAGTC-3，(SEQ ID NO :8)，正、反向引物引物可向 5，和 3，端 方向各延伸10个碱基。根据本发明的另一个优选实施方案，其中m亚型引物探针混合液中m亚型寡核 苷酸探针的序列为5，-CAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATC-3，(SEQ ID NO :9)。根据本发明的另一个优选实施方案，其中N2亚型引物探针混合液由(a)与双链靶 多核苷酸的第一条链结合的N2亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合 的N2亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两术端分别结合有荧光报告基团和 荧光淬灭基团的N2亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5 15pmol/反应，优 选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。根据本发明的另一个优选实施方案，其中N2亚型引物探针混合液中N2亚型正向 引物的序列为5，-GGGCACCACCCTGAACAA-3’ (SEQ ID NO: 10)，N2亚型反向引物的序列为 5，-CGTTCATCAGCAGGGTACGA-3，(SEQ ID NO :11)，正、反向引物引物可向 5，和 3，端方向各 延伸10个碱基。根据本发明的另一个优选实施方案，其中N2亚型引物探针混合液中N2亚型寡核 苷酸探针的序列为5’ -CCATAGCAACGATACCGTGCATGATCG-3，(SEQ ID N0:12)。根据本发明的另一个优选实施方案，RT-PCR反应液包括一步法RT-PCR反应缓冲 液和 DEPC 水，其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)、150mmol/LKCl,2. Ommol/L MgCl20根据本发明的另一个优选实施方案，RT-PCR酶系由逆转录酶(RT酶)、热启动Taq 酶、RNasin, dNTPs、酶系稀释液组成，其中RT酶用量为1. 5 3. 5U/反应、热启动Taq酶用 量为3 7U/反应、RNasin用量为15 25U/反应、dNTPs浓度为0. 20mmol/L,酶系稀释液 为一般市售的酶系稀释液。根据本发明的一个优选实施方案，其中阴性质控品为去离子水，Hl亚型阳性质控 品为含有Hl亚型HA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的 载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2，H3亚型阳性质 控品为含有H3亚型HA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售 的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，附亚型阳 性质控品为含有m亚型NA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过 市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，N2亚 型阳性质控品为含有N2亚型NA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物 通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID N0:10和SEQ ID NO=Il, 以上阳性质控品浓度均为IX IO6拷贝/ml。根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间 为50°C逆转录 15min，l 个循环；94°C 15min，1 个循环；最后 95°C 15s，55 60°C 45s，45 个循环(收集荧光信号)。根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是呼吸道样本、血清、肺 组织等样品。本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR试剂盒可以检测出猪流感病毒不同亚型的 最低浓度为1.0X102COpieS/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。本发明分别针对猪流感病毒Hl亚型、H3亚型HA基因和附亚型、N2亚型NA基因 设计特异性引物和探针，可分别检测出猪流感病毒相应亚型，但不能检测出猪繁殖与呼吸 综合征病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环 病毒2型、口蹄疫病毒阳性样本，说明本试剂盒具有很好的特异性。本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒可以检测呼吸道样本、血清、肺 组织等样品中的猪流感病毒不同亚型；可为灵敏、快速早期诊断猪流感病毒感染，监控其流 行状况提供可靠的实验证据。
图1显示Hl亚型阳性质控品、H3亚型阳性质控品、附亚型阳性质控品、N2亚型阳 性质控品和阴性质控品的检测结果。Hl亚型阳性质控品、H3亚型阳性质控品、m亚型阳性 质控品、N2亚型阳性质控品扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性。阴性 质控品扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。图2显示特异性参考品的检测结果。9份特异性参考品的扩增曲线平直或斜向下 且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。9份特异性参考品分别为禽流感病毒H5/ H7/H9各亚型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株、伪狂 犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒。
图3显示Hmi型猪流感病毒样本检测结果。Hl亚型、Nl亚型的扩增曲线有明显 指数增长期成S型，可明确判定为阳性，其余亚型的扩增曲线扩增曲线平直或斜向下且与 基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，因此可明确判定为Hmi型猪流感病毒。图4显示H3N2型猪流感病毒样本检测结果。H3亚型、N2亚型的扩增曲线有明显 指数增长期成S型，可明确判定为阳性，其余亚型的扩增曲线扩增曲线平直或斜向下且与 基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，因此可明确判定为H3N2型猪流感病毒。图5显示H1N2型猪流感病毒样本检测结果。Hl亚型、N2亚型的扩增曲线有明显 指数增长期成S型，可明确判定为阳性，其余亚型的扩增曲线扩增曲线平直或斜向下且与 基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，因此可明确判定为H1N2型猪流感病毒。图6显示灵敏度参考品的检测结果。16份灵敏度参考品中除了浓度为 1. 0 X lO^opies/ml的4份质粒样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可 明确判定为阴性。其余样本均可明确判定为阳性。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 猪流感病毒分型检测试剂的研制1、引物和探针的设计通过对已报导猪流感病毒的核酸序列进行序列比对分析， 分别以猪流感病毒Hl型、H3型HA基因和m型、N2型NA基因为扩增靶位点，选择无二级结 构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探 针。2、临床样本的选择根据国内外相关文献报道表明，可以使用呼吸道样本、血清、 肺组织等样品。3、反应体系的建立与优化样品的准备以构建的含有各目的扩增片断的质粒作为阳性质控品，以禽流感病 毒H5/H7/H9各亚型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异 株、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒阳性样本作为阴性参考品；以去 离子水作为阴性质控品，分别用TRIZOL提取上述阳性质控品与特异性参考品的RNA，阴性 质控品待用。引物探针的筛选以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性质控品与 阴性参考品的RNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合。 (如序列表中 SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 12)。引物探针浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从2pmol/ 反应至15pmol/反应梯度的引物和从2pmol/反应至15pmol/反应浓度梯度的探针进行PCR 反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在5 15pmol/反应之间均可，其中最佳的引物 浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。镁离子浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从lmmol/L 至2. 5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓 度为 2. Ommol/Lο热启动Taq酶用量的优化在25 μ L反应体系中 他组分不变的情况下，分别使用从IU (酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定 最佳的热启动Taq酶用量为3 7U/反应。RT酶用量的优化在25μ L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从 IU (酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳 的RT酶用量为1. 5 3. 5U/反应。RNasin用量的优化在25 μ L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从 5U(酶单位)至40U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最 佳的RNasin用量为15 25U/反应。dNTPs浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0. lmmol/L 至0. 25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs 浓度为 0. 20mmol/Lo反应温度的优化根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时 间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为50°C逆转录15min， 1个循环；94°C 15min, 1个循环；最后95°C 15s, 55 60°C 45s, 45个循环(收集荧光信 号)。实施例2 猪流感病毒分型检测试剂盒及其使用1、制备包括下列组成成分的试剂盒RNA提取液(50ml/管)1管、Hl亚型引物探针 混合液(50 μ 1/管)1管、Η3亚型引物探针混合液(50 μ 1/管)1管、、m亚型引物探针混合 液(50 μ 1/管)1管、Ν2亚型引物探针混合液(50 μ 1/管)1管、RT-PCR反应液(1440 μ 1/ 管)1管、RT-PCR酶系(300 μ 1/管)1管，阴性质控品(200 μ 1/管)1管、Hl亚型阳性质控 品(100 μ 1/管)1管、Η3亚型阳性质控品(100 μ 1/管)1管、Nl亚型阳性质控品(100 μ 1/ 管)1管、Ν2亚型阳性质控品(100 μ 1/管)1管。2、标本采集、运送和保存根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括呼吸道样本、血清、肺组织等样 品。采集方法如下①呼吸道样本拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子浸入4-5ml采 样液中，密封送检；②血清无菌采集静脉血约1ml，分别于室温和4°C静置2小时和1小时 后，离心(8，000rpm，5分钟)分离并收集血清标本；③肺组织利用支气管镜对肺部可疑病 灶进行活组织取样，并用组织勻浆器对组织样本进行勻浆待用。标本可立即用于测试，也可以保存于-70°C待测，保存期为6个月。标本运送采用 0°C冰壶3、检测步骤(I)RNA 提取取上述类型的样本各100 μ 1 (样品不足100 μ 1时请补加适量生理盐水重悬)，放 置于1. 5ml灭菌离心管，加入200 μ 1 Trizol试剂及100 μ 1氯仿，用振荡器强力振荡20秒
后静置3分钟；2 8°C下12，OOOrpm离心lOmin，吸取上清至另一干净的1. 5ml离心管；加入0. 2ml氯仿，盖紧盖子，手动用力颠倒摇动15s (不可用振荡器)，室温孵育 2 3min ；2 8°C下12000rpm离心15min后，取最上层的上清液至另一干净的1. 5ml离管；加入0. 5ml预冷的异丙醇，缓慢颠倒充分混勻后，_20°C静置15min，2 8°C， 12000rpm离心lOmin，小心弃尽上清液；加入Iml预冷的70%的冰冷乙醇，手动颠倒数次洗涤沉淀，2 8°C，8000rpm离心 5min，小心弃尽上清液；空气或真空干燥5 10min，WA 50 μ 1 DEPC H2O, 55 60°C下孵育lOmin，于指 轻轻弹打管底，使其充分溶解，直接用于实验或-70°C保存备用。(2) PCR反应与结果分析分别取Hl亚型引物探针混合液2 μ 1、RT-PCR反应液15 μ 1、RT-PCR酶系3 μ 1配 制成Hl亚型反应体系；取Η3亚型引物探针混合液2 μ 1、RT-PCR反应液15 μ 1、RT-PCR酶 系3 μ 1配制成Η3亚型反应体系；取Μ亚型引物探针混合液2 μ 1、RT-PCR反应液15 μ 1、 RT-PCR酶系3 μ 1配制成附亚型反应体系；取N2亚型引物探针混合液2 μ 1、RT-PCR反应 液15 μ 1、RT-PCR酶系3 μ 1配制成Ν2亚型反应体系。取阴性质控品、标本各5 μ 1，分别加入Hl亚型反应体系、Η3亚型反应体系、Nl亚 型反应体系、Ν2亚型反应体系中，另外取Hl亚型阳性质控品5μ 1加入Hl亚型反应体系、 Η3亚型阳性质控品5 μ 1加入Η3亚型反应体系、Nl亚型阳性质控品5 μ 1加入附亚型反 应体系、Ν2亚型阳性质控品5 μ 1加入Ν2亚型反应体系使用市售的荧光定量PCR仪(如 ΑΒΙ7500)进行PCR扩增。PCR循环条件是50°C逆转录15min，1个循环；94°C 15min, 1个 循环；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45个循环(收集荧光信号)。反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。 如扩增曲线有明显指数增长期，则判定为相应亚型阳性，否则为阴性。如Hi亚型阳性、m亚型阳性，其余亚型为阴性，则为Hmi型猪流感病毒；如H3亚型阳性、N2亚型阳性，其余亚型为阴性，则为H3N2型猪流感病毒；如Hl亚型阳性、N2亚型阳性，其余亚型为阴性，则为H1N2型猪流感病毒；如H3亚型阳性、附亚型阳性，其余亚型为阴性，则为H3W型猪流感病毒。实施例3 应用猪流感病毒分型检测试剂盒检测样品以实施例1中的阳性质控品、阴性质控品、特异性参考品作为待检样本，按照实施 例2的方法分别检测这些样本，阳性质控品检测结果为阳性，阴性质控品和特异性参考品 检测结果均为阴性(参见附图1，2)。分别以Hmi型猪流感病毒、H3N2型猪流感病毒、H1N2型猪流感病毒样本作为待 检样本，按照实施例2的方法分别检测这些样本，HlNl型猪流感病毒、H3N2型猪流感病毒、 H1N2型猪流感病毒均准确分型(参见附图3，4，5)。实施例4 猪流感病毒分型检测试剂盒灵敏度实验分别以猪流感病毒Hl亚型HA基因的质粒、H3亚型HA基因的质粒、Nl亚型NA基 因的质粒、N2亚型NA基因的质粒作为待测样本，各质粒浓度均稀释为1. OX 104COpieS/ml、 1. 0X103copies/ml、l. 0X102copies/ml、l. OXlOkopies/ml 组成灵敏度参考品，按照实施 例2的方法分别检测这16份样本，检测结果表明，本试剂盒的灵敏度为1. 0X102copies/ ml (见附图6)。序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司<120> 一种猪流感病毒实时荧光RT-PCR分型试剂盒<140><141><160>12<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>1tggcaccaagatatgcttttg<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>2caagtcgcattgcagtcatg<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。<400>3cgggtatcataacatcggatgcacca<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>4cgtcgtgaaagcgtgaacag<210>5<211>18页<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>5cggcatggtcacgttcag<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。<400>6ccgtctgaactggctgcataacctgg<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>7gaccttgcttttgggttgaact<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>8aaggatatgctgctcccactagtc<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。<400>9cagagggcgacccaaagagaacacaatc<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷·g序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>10
gggcaccaccctgaacaa
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷·I序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>11
cgttcatcagcagggtacga
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷1:I序列设计，以用作PCR扩增的探针。
<400>12
ccatagcaacgataccgtgcatgatcg
权利要求
一种猪流感病毒实时荧光RT-PCR分型试剂盒，试剂盒包括分别装有RNA提取液、H1亚型反应体系、H3亚型反应体系、N1亚型反应体系和N2亚型反应体系、阴性质控品、H1亚型阳性质控品、H3亚型阳性质控品、N1亚型阳性质控品和N2亚型阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于H1亚型引物探针混合液中H1亚型正向引物的序列为5’-TGGCACCAAGATATGCTTTTG-3’，H1亚型反向引物的序列为5’-CAAGTCGCATTGCAGTCATG-3’，正、反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于HI亚型引物探针混合液中HI亚型寡核苷 酸探针的序列为5’ -CGGGTATCATAACATCGGATGCACCA-3，。
3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于H3亚型引物探针混合液中H3亚 型正向引物的序列为5，-CGTCGTGAAAGCGTGAACAG-3，，H3亚型反向引物的序列为: 5’ -CGGCATGGTCACGTTCAG-3’，正、反向引物引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于H3亚型引物探针混合液中H3亚型寡核苷 酸探针的序列为5’ -CCGTCTGAACTGGCTGCATAACCTGG-3，。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于m亚型引物探针混合液中m亚型 正向引物的序列为5，-GACCTTGCTTTTGGGTTGAACT-3’，N1亚型反向引物的序列为: 5，-AAGGATATGCTGCTCCCACTAGTC-3，，正、反向引物引物可向5，和3，端方向各延伸10个碱 基。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于m亚型引物探针混合液中m亚型寡核苷 酸探针的序列为5’ -CAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATC-3，。
7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于N2亚型引物探针混合液中N2亚 型正向引物的序列为5’ -GGGCACCACCCTGAACAA-3’，N2亚型反向引物的序列为 5，-CGTTCATCAGCAGGGTACGA-3’，正、反向引物引物可向5，和3，端方向各延伸10个碱基。
8.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于N2亚型引物探针混合液中N2亚型寡核苷 酸探针的序列为5’ -CCATAGCAACGATACCGTGCATGATCG-3，。
9.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于HI亚型正、反向引物，H3亚型正、反向引 物，m亚型正、反向引物，N2亚型正、反向引物的浓度均为5pmol/反应，HI亚型寡核苷酸探 针、H3亚型寡核苷酸探针、m亚型寡核苷酸探针、N2亚型寡核苷酸探针的浓度均为5pmol/ 反应。
10.根据权利要求1的试剂盒，RT-PCR酶系由逆转录酶(RT酶)、热启动Taq酶、RNasin、 dNTPs、酶系稀释液组成，其特征还在于其中RT酶用量为1. 5 3. 5U/反应、热启动Taq酶 用量为3 7U/反应、RNasin用量为15 25U/反应、dNTPs浓度为0. 20mmol/L。
全文摘要
本发明涉及一种猪流感病毒分型试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行猪流感病毒分型的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒对呼吸道样本、血清、肺组织等样品中的猪流感病毒进行分型，从而实现猪流感病毒的早期快速诊断，监控其流行趋势。
文档编号C12Q1/70GK101886134SQ20091003940
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者何蕴韶, 李明, 陈华云, 高秀杰 申请人:中山大学达安基因股份有限公司