专利名称：：沉默巨噬细胞游走抑制因子表达的小干扰rna序列的制作方法沉默巨噬细胞游走抑制因子表达的小干扰RNA序列
技术领域：
：本发明涉及一种沉默巨噬细胞游走抑制因子表达的小干扰RNA序列。
背景技术：
：目前恶性肿瘤治疗常采用手术、化疗、放疗、生物反应调节剂治疗相结合的综合治疗，但总体疗效仍不令人满意。因此，人们在不断寻找新的治疗方法。随着新理论的确立和新技术的不断涌现，为恶性肿瘤新疗法的出现打下基础。巨噬细胞游走抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor,以下简称MIF)在包括胃癌、月市癌、月干癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中都高表达，MIF能促进恶性肿瘤增殖和血管生成、抑制恶性肿瘤凋亡，因而对恶性肿瘤的发生和发展起重要作用。
发明内容本发明的目的在于提供一种沉默巨噬细胞游走抑制因子(MIF)表达的小干扰RNA序列。本发明由两对沉默巨噬细胞游走抑制因子(MIF)表达的小干扰RNA序列所组成。两对沉默MIF表达的小干扰RNA(siRNA)(将它们分别命名为MIFsi-l和MIFsi-2)的序列分别为MIFsi-1:正义5，-ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3'，反义5，-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT墨3，。MIFsi-2:正义5，-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT陽3，，反义5，-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3'。本发明具有沉默MIF表达效率高，对恶性肿瘤有抑制作用，因而对多种恶性肿瘤有潜在治疗作用。沉默MIF表达的siRNA对胃癌细胞增殖的抑制作用研究1细胞培养及转染1.1细胞培养细胞培养箱设置为37°C，5%C02，饱和湿度条件下，人胃癌AGS细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中传代养。1.2MIFsiRNA的设计针对人类MIF基因mRNA序列，设计MIFsiRNA和阴性对照(NC)siRNA如下(siRNA寡核苷酸序列均由27碱基构成)。MIFsi-1:正义5，-ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3，，反义5，-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT-3，。MIFsi-2:正义5，-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT-3，，反义5,-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3，。:正义5，-GUUGCGCCCGCGAAUGAUAUUUAUAAUdTdT-3'，反义5，-AUUAUAAAUAUCAUUCGCGGGCGCAACdTdT-3，。1.3细胞转染1.3.1转染前一天，将处于对数生长期的1.5X1(^个AGS细胞接种在6孔板上，1.5ml含10%FBS的RPMI-1640培养基培养，24h细胞密度达到30-50%。1.3.2200pmolMIFsi-l用无血清Opti-MEM细胞培养基稀释成终体积185ul，轻轻混匀。1.3.3在24ul的无血清Opti-MEM细胞培养基中加入脂质体Oligofectamine6ul，轻轻混匀室温下放置5min。1.3.4将稀释好的MIFsi-l和Oligofectamine试剂混合，轻轻混匀室温放置20min，以便形成复合物。1.3.5将215ul的复合物加入800ul无血清Opti-MEM细胞培养基的6孔板中，总体积为1015ul，siRNA的终浓度为100pmol/ml，37°C,5%C02的培养箱内继续培养4-6h。1.3.64-6h后吸净6孔板内旧培养液，加入2ml含10%FBS的RPMI-1640新鲜培养基，37°C，5%(302的培养箱，继续培养，分别于24h、48h、72h提RNA或蛋白。1.3.7MIFsi-2和阴性对照组转染NC操作同上，终浓度为100pmol/ml;空白对照组Mock组加1ml无血清Opti-MEM细胞培养基(含6ulOligofectamine),4-6h后换成2ml10%FBS的RPMI-1640新鲜培养基。2.细胞的RNA抽提采用Trizol试剂一歩法提取胃癌细胞RNA。3.RT-PCR检测MIF基因表达实验步骤3.1逆转录反应3丄1取薄壁离心管(RNasefree)加入如下反应体系，7(TC变性5分钟(min)，立即4。C冷却。模板RNA(totalRNA)2ugOligo(dT)(0.1ug/ul)0.5ugdNTPmix(各2.5mM)0.5ul加H20(DEPC处理)至总体积5ul3丄2按反应体系下面顺序依次加入各试剂，37'C反应5min5Xbuffer2ulRTase0.5ulRibonucleaseinhibitor0.25ul加H20(DEPC处理)至总体积10ul3.1.3在PCR仪上进行逆转录反应，42。C温育60min，70°C15min终止反应，《C冷却。逆转录的cDNA于-2(TC贮存备用。3.2PCR扩增反应3.2.1根据Genbank人类的MIF的cDNA序列(GeneID:4282)，应用引物设计软件Primers设计引物，并由Invitrogen公司合成。由于OligoDNA呈很轻的膜状附在管壁上，在使用前先瞬时离心，再轻轻打开管盖，用去离子水溶解为10pmol/ul后，贮存-2(TC备用。各引物序列如下表2:PCR各引物序列及片段大小基因序列长度(bp)GAPDHsense5'-TTTGGTATCGTGGAAGGAC-3'Antisense5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'410MIFsense5，-CAGTGGTGTCCGAGAAGTCAG-3'440antisense5'-TAGGCGAAGGTGGAGTTGTT陽3'3.2.2取出已扩增的cDNA在冰上溶解，因为内参GAPDH和目的条带MIF的长度相近，所以要分别进行PCR反应。3.2.3PCR反应体系如下TemplatecDNA1ulPremixTaq酶12.5ulPrimerMIF/GAPDH(sense+antisense)_1ul加H20(DEPC处理)至总体积25ul3.2.4PCR扩增程序94°C5min热启动，94°C30sec,57°C35sec,72°C45sec，扩增35个循环。72。C延伸7min，后-2(TC存储。3.2.5DNA电泳取10ulPCR扩增产物加入含EB的1.5%琼脂糖凝胶中，以100v/cm电压电泳约30min，在紫外线照射下可见相应长度的人MIF扩增条带，用凝胶电泳成像分析系统扫描分析电泳图像。4.细胞样品的蛋白提取将细胞培养基弃去后，用PBS液清洗三次后，每1-5乂105个细胞重悬于50ul裂解液中，吹打均匀，冰浴下用细胞刮，刮后将细胞液移至EP管中，冰上静置30min，于4。C离心，20000gX30min，收集上清，经Bradford法测定蛋白含量，贮存-8(TC备用。5.蛋白质含量测定(Bradford法)75.1蛋白质标准曲线的制备分别取浓度为1ug/ul的小牛血清蛋白(BSA)0,5ul,10ul，15ul,20ul和25ul置试管中，分别加水100ul,95ul,90ul,85ul,80ul,75ul，再于每只试管分别加入Bradford工作液lml，混匀后放置2min，以含BSAOug/ul的溶液为空白对照，lh内测定各管在595nm处吸收值，做标准曲线。5.2样本蛋白质含量测定取1ul蛋白样本溶液，加99ulddH20和1mlBradfordl工作液混匀，放置2min，以含BSAOug/ul的溶液为空白对照，测定595nm处吸收值。将吸收值带入步骤6.1所得到的标准曲线，计算样本蛋白质含量。5.3蛋白样品的变性按h1比例混合样品和5XSDS-PAGE样品缓冲液，煮沸5min，室温冷却5min。6.免疫印迹(Westernblot)检测MIF的表达6.1SDS-PAGE电泳6丄1分离胶/浓縮胶的灌制按照表1配制丙烯酰胺分离胶溶液，将所配溶液灌入玻璃板后，覆盖水压平液面，室温聚合，弃去覆盖液。表312%聚丙烯酰胺分离胶配方分离胶(12%)mlddH201.651.25Acr/Bis(30%)210%SDS0.0510%APS0.05TEMED0.003Total5按照表4配制丙烯酰胺浓縮胶液，将所配溶液立即加在聚合好的分离胶上，插入梳子，室温聚合。表45%聚丙烯酰胺浓縮胶配方浓縮胶(5%)mlddH201.021.5mol/LTris-HCL(pH6.8)0.1875Acr/Bis(30%)0.2510%SDS0.01510%APS0.015TEMED0.003Total1.56.1.2SDS-PAG蛋白质电泳蛋白质样品上样:调整样品蛋白质浓度，使每个泳道上样的蛋白质为20ug。以蛋白Marker作为分子量对照。电泳在Bio-Rad电泳槽中进行，样品在浓縮胶中运行电压为60v，到达分离胶界面时，电压调升至80v，继续电泳直至溴酚兰到分离胶底部。6.2电转移6.2.1切除弃去浓縮胶。在分离胶右下切角作标记，在转移缓冲液中平衡15min。剪取与分离胶大小相同并做好标记的PVDF膜和两块3mm滤纸。PVDF膜先在甲醇中浸透约15sec，然后转入ddH20中平衡5min，取出后浸入转移缓冲液5-10min。滤纸亦在转移缓冲液中浸5-10min。自下而上依次叠放滤纸、膜、凝胶、另外一张滤纸，叠放时每一歩都要注意赶除气泡。6.2.2放置在Bio-Rad半干电转仪阳极板上，盖上带阴极板的上盖。设置恒电压10v，45min-lh。6.2.3转移结束后，将PVDF膜浸入甲醇10sec，后转入ddH20中平衡5min。6.3免疫检测及EC.L化学发光6.3.1用封闭液(5%脱脂奶粉和0.5%Tween的TBST)室温下封闭转移后的PVDF膜lh。6.3.2根据蛋白Marker指示的MIF，a-Tubulin的位置将PVDF膜剪开，然后分别放入用塑料薄膜手套自制的杂交袋中，分别加入用封闭液1:200稀释的兔抗人MIF多克隆抗体，1:1000稀释的小鼠抗人a扁Tubulin单克隆抗体，赶除气泡后封袋口，4。C摇床过夜。6.3.3TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。6.3.4分别加入相应的用封闭液1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠和山羊抗兔抗体，室温反应lh。6.3.5TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。6.3.6ECL化学发光检测等量混合ECL中的A液和B液(按照0.1ml反应胶/cm2PVDF的量配置)平铺于封口膜上，然后将PVDF膜的蛋白印迹面向下盖于其上，轻轻赶走气泡，室温孵育反应3-5min。6.3.7沥干PVDF膜上多余的ECL试剂，将PVDF膜置于两层保鲜膜间，小心赶去气泡，膜的蛋白印迹面向上放入暗盒。于暗室内压X底片曝光，显影、定影，水洗胶片晾千后保存。7.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖7.1实验步骤7丄1接种细胞用含10%胎小牛血清得RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔3.5乂103个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，每个样品设三个复孔。7丄2培养细胞及转染次日细胞处于对数生长期，分别取100nmol/L浓度MIFsi画l，MIFsi-2，NC转染胃癌AGS细胞。7丄3呈色转染培养于24h,48h,72h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS，pH值7.4)20ul。在37。CC02培养箱继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ulDMSO，振荡5min，使结晶物充分融解。7丄4比色:选择492nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(A)，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。8.细胞克隆形成实验实验步骤8.1首先进行6孔板细胞转染，具体操作同方法1.3，于转染48h后终止培养，PBS洗两次，加适量的0.25%胰蛋白酶消化液消化1-2min，注入1.5ml左右的培养液中止消化，吸管吹打至呈单细胞状态。8.2用细胞计数板计数后，按500个细胞/孔接种于6孔培养板中，补足2ml培养液，置37"C,5y。C02培养箱中培养。8.3培养13天后弃去培养液，用PBS洗涤2次，加甲醇3ml左右固定15min，弃去固定液，姬姆萨染色40min，ddH20缓慢洗去染色液，空气干燥，将6孔板倒置并轻微划上网格线，普通光学显微镜下计数克隆数。9.统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以均数土标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，两因素间的差异比较及相关性分析采用\2检验；尸<0.05为有统计学意义。结果提示AGS细胞转染MIFsi-l、MIFsi-2和NC比较，24h、48h、72h的MIFmRNA抑制率分别为为MIFsi-l62.83%、67.28%和76.91%，MIFsi陽256.65%、65.78%和73.86%;MIF蛋白抑制率为MIFsi-l71.00%、72.73%和76.51%，MIFsi-262.94%、66.21%和73.55%。用RNA干扰沉默MIF基因后，MTT实验结果显示MIFsi-l和MIFsi-2在转染4天后细胞数分别为原来2.55±0.13倍和2.62±0.15倍，倍增时间分别为2.58±0.14天和2.42±0.17天，而NC组和Mock组细胞数则为原来的4.21±0.32倍和4.33±0.48倍，倍增时间为1.25±0.06天和1.08士0.14天。平板克隆实验结果显示经MIFsi-l和MIFsi-2沉默MIF基因IO天后，AGS细胞集落形成数为33.15士4.12个和43.25士2.63个，显著低于阴性对照组的103.27土2.80个和未转染组(Mock组)的112.50士2.10个(均尸O.OOl)。同时，MIF沉默后，PCNA表达下调。表明沉默MIF表达对胃癌AGS细胞增殖有抑制作用。沉默MIF表达的siRNA对卵巢癌细胞增殖和侵袭力的抑制作用研究方法瞬时转染小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)革巴向敲除MIF基因，以RT-PCR和Westernblot检测MIF在mRNA和蛋白水平的表达，通过体外迁移、侵袭实验和噻唑蓝比色法(MTT)分析MIF对HO-8910和OVCAR-3细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响。结果显示与阴性对照组细胞比较，瞬时转染MIFsiRNA的HO-8910和OVCAR-3细胞中MIF基因表达水平明显降低。MTT结果显示，转染MIFsiRNA的两株卵巢癌细胞增殖率显著低于阴性对照组(尸<0.05)。转染MIFsiRNA的HO-8910细胞穿膜细胞数(MIFsi-l:48.0±7.3,MIFsi-2:38.0±3.6)与阴性对照组(78.0土8.5)比较差异有统计学意义CP0.05)，其穿过铺了Matrigel膜的细胞数(MIF-sil:35.0±5.0，MIF-si2:30.0±5.6)也显著少于阴性对照组(尸<0.05)。同样，转染了MIFsiRNA的OVCAR-3细胞穿膜细胞数(MIFsi-l:40.0±4.5，MIFsi-2:42.0±3.0)与阴性对照组(65±2.1)比较，差异也有统计学意义(尸<0.05)，其穿过铺了Matrigel膜的细胞数(MIFsi-l:25.0±3.0,MIFsi-2:27.0±3.4)也明显低于阴性对照组(尸<0.05)。表明沉默MIF表达对卵巢癌细胞增殖和侵袭力有抑制作用。本发明具有如下优点沉默MIF表达效率高，对恶性肿瘤有抑制作用，因而对多种恶性肿瘤有潜在治疗作用。具体实施方式下面结合实例对本发明做详细描述一、实验材料1细胞系及培养条件人胃癌AGS细胞株购自中国科学院上海生物细胞研究所，在37°C、5%C02、饱和湿度条件下，培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，0.25%胰蛋白酶(含0.02。/。EDTA)消化传代。2主要试剂Trizol为美国Invitrogen公司产品。M-MulV逆转录酶、01igo(dT)(0.5ug/ul)、10mmol/LdNTP、RNA酶抑制剂(Ribonucleaseinhibitor)、10XPCRbufferwith(NH4)2S04、25mmol/LMgCl2、TaqDNA聚合酶(1U/ul)、6Xloadingbuffer均为MBIFermentas公司产品。琼脂糖为加拿大BBI公司产品；5XTAE为上海捷瑞生物工程有限公司产品。十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸按溶液(APS)、甘氨酸、Trisbase、EDTA、MTT、DMSO、DEPC、TritonX等均为Ameresco公司产品。蛋白质预染Marker为美国MBIFermentas公司产品。考马斯亮蓝、硫脲为美国Sigma公司产品，CHAPS、DTT、Pharmlyte试剂为美国AmershamBioSciences公司产品。兔抗人MIF多克隆抗体为美国SantaCruz公司产品。RT-PCR试剂购自大连TaKaRa公司。RPMI-1640为美国Gibco公司产品；胎牛血清为美国Hyclone公司产品；胰蛋白酶为美国Difco公司产品。丙烯酰胺(Aerylamide，Acr)、N，N，甲叉双丙烯酰胺(Bis)为美国Sigma公司产品。PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)为美国Piecee公司产品。ECL化学发光试剂(SupersignalwestPicoluminol/Enhancersolution,supersignalwestPicostablePeroxidesolution)为美国Piecee生物技术公司产品。二氨基联苯胺(DAB)显色试剂由美国DAKO公司提供。柯达(Kodak)医用X射线胶片为科达(中国)股份有限公司产品。沉默MIF基因的siRNA和阴性对照siRNA均为大连TaKaRa公司合成，其中阴性对照siRNA为一对无任何靶基因的双链RNA。转染试剂Oligofectamine为美国Invitrogen公司产品。姬姆萨粉、RNaseA、碘化丙啶(propidineiodide,PI)为Sigma公司产品。鼠抗人PCNA单克隆抗体为武汉博士德公司产品。3%多聚甲醛为广州威家科技公司。3主要设备超速低温离心机德国西门子公司。恒温离心机美国Eppendorf公司。Ultrospec3000紫外分光光度度计英国Pharmacia生物技术公司。多通道PCR仪(MJPT-220):美国Bio-Rad公司。酶标仪Multisranspectrum:美国Thermo公司。凝胶电泳成像分析系统美国Bio-Rad公司，GelDoc-2000型。稳压稳流电泳仪及水平电泳槽美国Bio-Rad公司。垂直电泳槽、电泳仪、Trans-BlotSD半干电转仪美国Bio-Rad。大型多功能分光光度计美国MBIFermentas公15司。OLYMPUS光学显微镜日本Olympus公司。酸度计意大利Hanna公司，PHZn型。Imagescanner扫描仪美国AmershamBiosciences公司。TS-1型脱色摇床江苏海门市麒麟医用仪器厂。C02细胞培养箱美国MBIFermentas公司。超净工作台上海汇龙电子仪表有限公司。恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司，DK-522型。倒置相差荧光显微镜德国Leica公司，ZeissAxiovert200型。各型移液枪、枪头、细胞培养板、培养瓶德国ComingCostar公司广口no二、实验方法i细胞培养及转染i.i细胞培养细胞培养箱设置为37°C，5%C02，饱和湿度条件下，人胃癌AGS细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中传代养。1.2MIFsiRNA的设计针对人类MIF基因mRNA序列，设计MIFsiRNA和阴性对照(NC)siRNA如下(siRNA寡核苷酸序列均由27碱基构成)。MIFsi-1:正义5，匿ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3，，反义5，-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT墨3，。MIFsi-2:正义5，-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT墨3，，反义5，-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3，。:正义5，-GUUGCGCCCGCGAAUGAUAUUUAUAAUdTdT-3'，反义5，-AUUAUAAAUAUCAUUCGCGGGCGCAACdTdT陽3，。1.3细胞转染1.3.1转染前一天，将处于对数生长期的1.5Xl(f个AGS细胞接种在6孔板上，1.5ml含10%FBS的RPMI-1640培养基培养，24h细胞密度达到30-50%。1.3.2200pmolMIFsi-l用无血清Opti-MEM细胞培养基稀释成终体积185ul，轻轻混匀。1.3.3在24ul的无血清Opti-MEM细胞培养基中加入脂质体01igofectamineTM6ul，轻轻混匀室温下放置5min。1.3.4将稀释好的MIFsi-l和Oligofectamine试剂混合，轻轻混匀室温放置20min，以便形成复合物。1.3.5将215ul的复合物加入800ul无血清Opti-MEM细胞培养基的6孔板中，总体积为1015ul,siRNA的终浓度为100pmol/ml，37°C,5%C02的培养箱内继续培养4-6h。1.3.64-6h后吸净6孔板内旧培养液，加入2ml含10%FBS的RPMI-1640新鲜培养基，37°C，5%(302的培养箱，继续培养，分别于24h、48h、72h提RNA或蛋白。1.3.7MIFsi-2和阴性对照组转染NC操作同上，终浓度为100pmol/ml;空白对照组Mock组加lml无血清Opti-MEM细胞培养基(含6ulOligofectamine),4-6h后换成2ml10%FBS的RPMI-1640新鲜培养基。2.细胞的RNA抽提采用Trizol试剂一步法提取胃癌细胞RNA。3.RT-PCR检测MIF基因表达实验步骤3.1逆转录反应3丄1取薄壁离心管(RNasefree)加入如下反应体系，7(TC变性5min，立即4。C冷却。模板RNA(totalRNA)2ugOligo(dT)(0.1ug/ul)0.5ugdNTPmix(各2.5mM)0.5ul加H20(DEPC处理)至总体积5ul3丄2按反应体系下面顺序依次加入各试剂，37。C反应5min5Xbuffer2ulRTase0.5ulRibonucleaseinhibitor0.25ul加H20(DEPC处理)至总体积10ul3.1.3在PCR仪上进行逆转录反应，42。C温育60min，70°C15min终止反应，4'C冷却。逆转录的cDNA于-2(TC贮存备用。3.2PCR扩增反应3.2.1根据Genbank人类的MIF的cDNA序列(GeneID:4282)，应用引物设计软件Primers设计引物，并由Invitrogen公司合成。由于OligoDNA呈很轻的膜状附在管壁上，在使用前先瞬时离心，再轻轻打开管盖，用去离子水溶解为10pmol/ul后，贮存-2(TC备用。各引物序列如下表2:PCR各引物序列及片段大小基因序列长度(bp)GAPDHsense5'-TTTGGTATCGTGGAAGGAC-3'410Antisense5'陽AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'MIFsense5，-CAGTGGTGTCCGAGAAGTCAG-3'440antisense5'墨TAGGCGAAGGTGGAGTTGTT-33.2.2取出已扩增的cDNA在冰上溶解，因为内参GAPDH和目的条带MIF的长度相近，所以要分别进行PCR反应。3.2.3PCR反应体系如下TemplatecDNA1ulPremixTaq酶12.5ulPrimerMIF/GAPDH(sense+antisense)_1ul加H20(DEPC处理)至总体积25ul3.2.4PCR扩增程序94°C5min热启动，94。C30sec,57°C35sec,72°C45sec，扩增35个循环。72。C延伸7min，后-2(TC存储。3.2.5DNA电泳取10ulPCR扩增产物加入含EB的1.5%琼脂糖凝胶中，以100v/cm电压电泳约30min，在紫外线照射下可见相应长度的人MIF扩增条带，用凝胶电泳成像分析系统扫描分析电泳图像。4.细胞样品的蛋白提取将细胞培养基弃去后，用PBS液清洗三次后，每1-5乂105个细胞重悬于50ul裂解液中，吹打均匀，冰浴下用细胞刮，刮后将细胞液移至EP管中，冰上静置30min，于4。C离心，20000gX30min，收集上清，经Bradford法测定蛋白含量，贮存-8(TC备用。5屋白质含量测定(Bradford法)5.1蛋白质标准曲线的制备分别取浓度为1ug/ul的小牛血清蛋白(BSA)0，5ul,10ul，15ul,20ul和25ul置试管中，分别加水100ul,95ul,90ul,85ul,80ul,75ul，再于每只试管分别加入Bradford工作液lml，混匀后放置2min，以含BSAOug/ul的溶液为空白对照，lh内测定各管在595nm处吸收值，做标准曲线。5.2样本蛋白质含量测定取lul蛋白样本溶液，加99ulddH20和1mlBradford工作液混匀，放置2min，以含BSAOug/ul的溶液为空白对照，测定595nm处吸收值。将吸收值带入步骤6.1所得到的标准曲线，计算样本蛋白质含量。5.3蛋白样品的变性按1:1比例混合样品和5XSDS-PAGE样品缓冲液，煮沸5min，室温冷却5min。6.免疫印迹(Westernblot)检测MIF的表达6.1SDS-PAGE电泳6丄1分离胶/浓縮胶的灌制按照表1配制丙烯酰胺分离胶溶液，将所配溶液灌入玻璃板后，覆盖水压平液面，室温聚合，弃去覆盖液。表312%聚丙烯酰胺分离胶配方分离胶(12%)mlddH201.651.5mol/LTris-HCL(pH8.8)1.25Acr/Bis(30%)210%SDS0.0510%APS0.05TEMED0.003Total5按照表4配制丙烯酰胺浓縮胶液，将所配溶液立即加在聚合好的分离胶上，插入梳子，室温聚合。表45%聚丙烯酰胺浓縮胶配方浓缩胶(5%)mlddH201.021.5mol/LTris-HCL(pH6.8)0.1875Acr/Bis(30%)0.2510%SDS0.01510%APS0.015TEMED0.003Total1.56.1.2SDS-PAG蛋白质电泳蛋白质样品上样调整样品蛋白质浓度，使每个泳道上样的蛋白质为20ug。以蛋白Marker作为分子量对照。电泳在Bio-Rad电泳槽中进行，样品在浓缩胶中运行电压为60v，到达分离胶界面时，电压调升至80v，继续电泳直至溴酚兰到分离胶底部。6.2电转移6.2.1切除弃去浓縮胶。在分离胶右下切角作标记，在转移缓冲液中平衡15min。剪取与分离胶大小相同并做好标记的PVDF膜和两块3mm滤纸。PVDF膜先在甲醇中浸透约15sec，然后转入ddH;zO中平衡5min，取出后浸入转移缓冲液5-10min。滤纸亦在转移缓冲液中浸5-10min。。自下而上依次叠放滤纸、膜、凝胶、另外一张滤纸，叠放时每一步都要注意赶除气泡。6.2.2放置在BioRad半干电转仪阳极板上，盖上带阴极板的上盖。设置恒电压10v，45min陽lh。6.2.3转移结束后，将PVDF膜浸入甲醇10sec，后转入ddH20中平衡5min。6.3免疫检测及ECL化学发光6.3.1用封闭液(5%脱脂奶粉和0.5%Tween的TBST)室温下封闭转移后的PVDF膜1h。6.3.2根据蛋白Marker指示的MIF,a-Tubulin的位置将PVDF膜剪开，然后分别放入用塑料薄膜手套自制的杂交袋中，分别加入用封闭液1:200稀释的兔抗人MIF多克隆抗体，1:1000稀释的小鼠抗人a-Tubulin单克隆抗体，赶除气泡后封袋口，4"C摇床过夜。6.3.3TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。6.3.4分别加入相应的用封闭液1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠和山羊抗兔抗体，室温反应lh。6.3.5TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min。6.3.6ECL化学发光检测等量混合ECL中的A液和B液(按照0.1ml反应胶/cm2PVDF的量配置)平铺于封口膜上，然后将PVDF膜的蛋白印迹面向下盖于其上，轻轻赶走气泡，室温孵育反应3-5min。6.3.7沥干PVDF膜上多余的ECL试剂，将PVDF膜置于两层保鲜膜间，小心赶去气泡，膜的蛋白印迹面向上放入暗盒。于暗室内压X底片曝光，显影、定影，水洗胶片晾千后保存。7.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖7.1实验步骤7丄1接种细胞用含10%胎小牛血清得RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔3.5X1()S个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，每个样品设三个复孔。7丄2培养细胞及转染次日细胞处于对数生长期，分别取10Onmol/L浓度MIFsi-l，MIFsi-2，NC转染胃癌AGS细胞。7丄3呈色:转染培养于24h,48h，72h后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS，pH值7.4)20ul。在37。CC02培养箱继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ulDMSO，振荡5min，使结晶物充分融解。7丄4比色选择492nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(A)，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。8.细胞克隆形成实验实验步骤8.1首先进行6孔板细胞转染，具体操作同方法1.3，于转染48h后终止培养，PBS洗两次，加适量的0.25%胰蛋白酶消化液消化1-2min，注入1.5ml左右的培养液中止消化，吸管吹打至呈单细胞状态。8.2用细胞计数板计数后，按500个细胞/孔接种于6孔培养板中，补足2ml培养液，置37"C，5y。C02培养箱中培养。8.3培养13天后弃去培养液，用PBS洗涤2次，加甲醇3ml左右固定15min，弃去固定液，姬姆萨染色40min，ddH20缓慢洗去染色液，空气干燥，将6孔板倒置并轻微划上网格线，普通光学显微镜下计数克隆数。9.统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以均数士标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，两因素间的差异比较及相关性分析采用^2检验；尸<0.05为有统计学意义。三、结果显示AGS细胞转染MIFsi-l、MIFsi-2和NC比较，24h、48h、72h的MIFmRNA抑制率分别为为MIFsi-l62.83%、67.28%和76.91%，MIFsi-256.65%、65.78%和73.86%;MIF蛋白抑制率为MIFsi隱l71.00%、72.73%和76.51%,MIFsi-262.94%、66.21%和73.55%。用RNA干扰沉默MIF基因后，MTT实验结果显示MIFsi-l和MIFsi-2在转染4天后细胞数分别为原来2.55±0.13倍和2.62±0.15倍，倍增时间分别为2.58±0.14天和2.42±0.17天，而NC组和Mock组细胞数则为原来的4.21±0.32倍和4.33±0.48倍，倍增时间为1.25±0.06天和1.08±0.14天。平板克隆实验结果显示经MIFsi-1和MIFsi-2沉默MIF基因IO天后，AGS细胞集落形成数为33.15士4.12个和43.25土2.63个，显著低于阴性对照组的103.27土2.80个和未转染组(Mock组)的112.50士2.10个(均尸O駕)。同时，MIF沉默后，PCNA表达下调。上述结果表明用siRNA沉默MIF表达对胃癌细胞增殖有抑制作用。<110〉中山大学附属第一医院朱，森林<120〉沉默巨噬细胞游走抑制因子表达的小干扰RNA序列<130><160>2<170〉Patentlnversion3.4<210>1〈211〉58<212>RNA<213〉人工序列<400〉1acaucaacuauuacgacaugaacgcggddccgcguucaugucguaauaguugaugudd58<210〉2<211〉58<212>RNA〈213>人工序列〈400〉2caucaugccgauguucaucgimaacacddguguuuacgaugaacaucggcaugaugdd58权利要求1、一种沉默巨噬细胞游走抑制因子表达的小干扰RNA序列，其有两对，将它们分别命名为巨噬细胞游走抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)si-1和巨噬细胞游走抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)si-2，其特征在于它们的序列分别为MIFsi-1正义5’-ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3’，反义5’-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT-3’；MIFsi-2正义5’-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT-3’，反义5’-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3’。全文摘要本发明涉及一种沉默巨噬细胞游走抑制因子(Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)表达的小干扰RNA，将它们分别命名为MIFsi-1和MIFsi-2。它们的序列分别为MIFsi-1正义5’-ACAUCAACUAUUACGACAUGAACGCGGdTdT-3’，反义5’-CCGCGUUCAUGUCGUAAUAGUUGAUGUdTdT-3’。MIFsi-2正义5’-CAUCAUGCCGAUGUUCAUCGUAAACACdTdT-3’，反义5’-GUGUUUACGAUGAACAUCGGCAUGAUGdTdT-3’。本发明具有沉默巨噬细胞游走抑制因子表达效率高，对多种恶性肿瘤有潜在治疗作用。文档编号C12N15/11GK101591656SQ20091004045公开日2009年12月2日申请日期2009年6月23日优先权日2009年6月23日公开号200910040454.0发明者孔祥复,朱森林,胡品津,丹谢,贺龙君申请人:中山大学附属第一医院;朱森林