魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法

专利名称：魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法
技术领域：
本发明属于植物病虫害检疫领域，更具体涉及一种魔芋中芋花叶病毒(DsMV) 分子快速检测方法，利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分子生物学技术对魔 芋中DsMV进行快速检测。
背景技术：
魔芋(^rarp力叩/ a7hs)属天南星科魔芋属多年生草本植物，也是我国贫困 山区重要经济作物之一。我国主要分布于湖北、云南、四川等长江流域。因魔芋 地下球茎中含有葡甘露聚糖，目前广泛用于食品、纺织印染、石油钻探、制药、 日用化工等领域，有很好的经济效益。但因常年无性繁殖，使病毒积累，种性退 化，丰产性和品质无法保证。芋花叶病毒(dasheen mosaic virus, Ds匿)是确定 在天南星科植物上发生最普遍和危害最严重的病毒病原。Zettler等(1987)指 出芋花叶病毒(DsMV)使天南星科Ca7st/Zt朋、Z ieiTey 力ac力ia、 /%j7oote77rfrOT和 Zs/7"eofe"力^等属作物减产约60%。虽然相继有多位学者对天南星科植物病毒 病害进行了探索性研究，但由于该科植物本身材料的特点使研究相对难以深入。 到目前为止，天南星科植物上鉴定和分离的病毒相对较少，而且该科植物侵染的 病毒研究方法还局限于传统生物学方法。近年来发展的反转录聚合酶链反应 (RT-PCR)方法因其具有灵敏、快速、特异性强等优点，在植物病毒的检测上显示 出强大的优势。自1990年起，国内外已相继用RT-PCR方法检测了多种病毒，如 马铃薯Y病毒(PVY)，马铃薯巻叶病毒(PLRV)，马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd) 等，但至今国内外至今未见有关魔芋中芋花叶病毒的报道。本发明通过合成一对 扩增DsMV特异性外壳蛋白(")基因中间部分核心序列的寡核苷酸引物，利用 RT-PCR技术建立了一种经济简便检测魔芋中芋花叶病毒的方法。此方法将对魔 芋脱毒苗的检测和DsMV的控制起到重要作用。200910060893.8
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发明内容
本发明目的是在于提供一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法。该方法操 作方便，经济快速，且可10(m检测魔芋是否带DsMV，从而为魔芋中DsMV的防治、 脱毒苗的检测提供有效手段。
为达到上述目的，本发明采用以下技术措施-
根据已报道的DsMV—对特异性外壳蛋白(cp)基因序列，首先合成l对扩增 DsMV的c/7基因中间部分核心序列的寡核苷酸引物；然后将提取的魔芋叶片的总 RNA反转成complement DNA，再以complement DNA为模板，结果扩增得到了与预 期大小一致的O. 35kb片段，接种DsMV后感病的魔芋也扩增到了此片段，而对照(清 水和健康魔芋)中未扩增到任何产物。 一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法，其步骤是
A、依据陈集双主编的《天南星科植物病毒的分子诊断和半夏研究》合成DsMV 检测的特异性引物DF: 5 ' -GGG CTT GGG TGA TGA TGG A - 3 ' ， DR: 5 ' -GCC TTT CAG TGT TCT CGC TTG -3.'，目的片段长度O. 35kb;
B、 用RNApr印pure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取带 芋花叶病毒的魔芋(dasheen mosaic virus, DsMV)叶片总RNA;
C、 取一微量离心管，加入提取的RNA 8iiL， 10 uM的oligo-d(T) 4"， 72 'C下变性5min，取出置于冰上放置5 min，再依次加入反转录酶缓冲液8yL， lOmMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸4uL， 40U/u L的RNA酶抑制剂1 u L， 20U/uL 的反转录酶2yL，加入O. 1%(V/V)焦碳酸二乙酯处理过的重蒸水15yL，将反应 混合物于42。C PCR仪中延伸lh， - 20。C保存备用
D、在12. 5wLPCR反应体系中，取上述反转录产物compleraent DNA 2 n L，加 lOuM的引物DF和DR各luL， lOraMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸O. 8 u L，反转录酶 缓冲液2uL， 20mMol的氯化镁0.7uL， 2u/nl的Taq酶O. 5nL，重蒸水4. 5uL; 反应条件是94。C预变性3min， 94。C变性30s， 56。C退火30s, 72。C延伸30s， 30个 循环，最后再72'C延伸5min，在PCR仪上扩增，取扩增产物2.5ixL进行琼脂糖 凝胶电泳，通过凝胶成像系统检测到0.35kb片段长度条带的为带病毒植株，无条 带的为健康植株。
上述用RT-PCR技术快速检测魔芋中芋花叶病毒的方法，所用试剂为副Apr印pure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，5XM-MuLV反 转录酶缓冲溶液(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，三磷酸碱基脱氧核苷 酸(dNTPs)(鼎国生物技术有限公司生物技术有限公司)，RNA酶抑制剂(RNasin) (普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，M-MuLV反转录酶(普洛麦格(北京) 生物技术有限公司)，10XTaq Reaction buffer(鼎国生物技术有限公司)，Taq DNA Polymerase (鼎国生物技术有限公司)，6XLoading Buffer (大连宝生物工程 有限公司)，DL2000 Marker(鼎国生物技术有限公司)。
本发明与常规生物学方法测定芋花叶病毒(DsMV),具有以下优点和效果。 首先，将反应循环中的变性时间和退火时间縮短为30 s ,并将循环次数减为30 次，此改进措施可节省PCR反应时间40min;其次，PCR总反应体积由通常的25 y L 降至12.5uL，反转录酶只用2nL，试剂用量少，成本大幅度降低；最后，在提 取植物总RNA同时，也含有芋花叶病毒，从而避免了分离病毒的繁琐过程，使操 作方便，快速，重复性好，克服了ELISA法需制备抗血清的限制且灵敏度不高， 易出现假阳性的缺点。另外，本方法通过特异片段的有无，能100%判断魔芋是否 带芋花叶病毒。本方法在分子水平上为魔芋中DsMV的检测提供了一种快速、灵敏、 简便的新方法，为魔芋中DsMV的防治、脱毒苗的检测提供了有效手段。
具体实施例方式
一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法，其步骤是
1、依据陈集双主编的《天南星科植物病毒的分子诊断和半夏研究》合成DsMV 检测的特异性引物DF: 5 ' -GGG CTT GGG TGA TGA TGG A - 3 ' ， DR: 5 ' -GCC TTT CAG TGT TCT CGC TTG -3 '，目的片段长度O. 35kb;
2、 用RNApr印pure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取带 芋花叶病毒的魔芋(dasheen mosaic virus, DsMV)叶片总RNA;
3、 取一微量离心管，加入提取的RNA 8uL， 10uM的oligo-d(T) 4uL， 72 'C下变性5min，立即取出置于冰上放置5min。再依次加入反转录酶缓冲液(5 XM-MuLV)8uL， lOmMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs) 4uL， 40U/uL的RNA 酶抑制剂(RNasin) 1 u L， 20U/y L的反转录酶(M-MuLV) 2"，加入O. 1% (V/V) 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的重蒸水(ddH20) 15uL。将反应混合物于42'C PCR
5存备用；
4、在12. 5li LPCR反应体系中，取上述反转录产物complement廳(c腿)2 uL，加10iiM的引物DF和DR各luL， lO慮ol的三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs) 0.8pL，反转录酶缓冲液(10Xbuffer) 2uL， 20慮ol的氯化镁(MgCl2) 0. L, 2u/yl的Taq酶O. 5uL，重蒸水(ddH20) 4.5uL;反应条件是94t:预变性 3rain， 94。C变性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸30s， 30个循环，最后再72。C延伸 5min，在PCR仪上扩增。
5、取扩增产物2.5nL进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统检测到 0.35kb片段长度条带的为带病毒植株，无条带的为健康植株。
上述的用RT-PCR技术快速检测魔芋中芋花叶病毒的方法，所用试剂为 RNApr印pure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，5XM-MuLV反 转录酶缓冲溶液(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，三磷酸碱基脱氧核苷 酸(dNTPs)(鼎国生物技术有限公司生物技术有限公司)，RNA酶抑制剂(RNasin) (普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，M-MuLV反转录酶(普洛麦格(北京) 生物技术有限公司)，10XTaq Reaction buffer (鼎国生物技术有限公司)，Taq DNA Polymerase(鼎国生物技术有限公司)，6XLoading Buffer(大连宝生物工程 有限公司)，DUOOO Marker(鼎.国生物技术有限公司)。
权利要求
1、一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法，其步骤是A、合成DsMV检测的特异性引物DF5′-GGG CTT GGG TGA TGA TGG A-3′，DR5′-GCC TTT CAG TGT TCT CGC TTG-3′，目的片段长度0.35kb；B、用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒提取带芋花叶病毒的魔芋叶片总RNA；C、取一微量离心管，加入提取的RNA 8μL，10μM的oligo-d(T)4μL，72℃下变性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入反转录酶缓冲液8μL，10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸4μL，40U/μL的RNA酶抑制剂1μL，20U/μL的反转录酶2μL，0.1％(V/V)焦碳酸二乙酯处理过的重蒸水15μL，将反应混合物于42℃ PCR仪中延伸1h，-20℃保存备用；D、在12.5μLPCR反应体系中，取上述反转录产物complement DNA 2μL，加10μM的引物DF和DR各1μL，10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸0.8μL，反转录酶缓冲液2μL，20mMol的氯化镁0.7μL，2u/μl的Taq酶0.5μL，重蒸水4.5μL；反应条件是94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后再72℃延伸5min，在PCR仪上扩增；E、取扩增产物2.5μL进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统检测到0.35kb片段长度条带的为带病毒植株，无条带的为健康植株。
全文摘要
本发明公开了一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法，其步骤是首先合成1对扩增DsMV的cp基因中间部分核心序列的寡核苷酸引物；然后将提取的魔芋叶片的总RNA反转成cDNA，再以cDNA为模板，结果扩增得到了与预期大小一致的0.35kb片段，接种后感病毒的魔芋叶片也扩增到了此片段，而对照中未扩增到任何产物。本方法在分子水平上为魔芋中DsMV的检测提供了一种快速、灵敏、简便的新方法，为魔芋中DsMV的防治、脱毒苗的检测提供了有效手段。
文档编号C12Q1/70GK101492746SQ20091006089
公开日2009年7月29日 申请日期2009年2月27日 优先权日2009年2月27日
发明者英 刁, 吴金平, 晓 胡, 胡中立, 顾玉成 申请人:武汉大学;湖北省农业科学院经济作物研究所