专利名称：用于生产琥珀酸的放线杆菌和方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种用于生产琥珀酸的放线杆菌和采用该放 线杆菌生产琥珀酸的方法，以及一种琥珀酸和乙醇的联合生产方法和装置。
背景技术：
琥珀酸(SuccinicAcid, Butanedioic Acid)，又称丁二酸，被美国 FDA 认定为“一 般认为安全”(GRAS)，因此可以用于多种用途。2004年美国能源部的一份报告指出，琥珀酸 是合成大宗日用品和重要化学品的平台化学物质，有着巨大的经济价值。随着能源紧缺，利 用生物发酵法生产琥珀酸的前景非常广阔。琥珀酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌的代谢中间体，产生琥珀酸的微生物包括 丙酸产生菌、典型的胃肠菌和瘤胃菌等。许多琥珀酸产生菌是从瘤胃中分离出来的，由于瘤 胃中微生态环境比较复杂，目前大多的分离方法都是基于最大可能的模拟与瘤胃相似的分 离环境而达到对目标瘤胃菌的分离。目前琥珀酸发酵产量最高的微生物是产琥珀酸放线杆 菌(Actinobacillus succinogenes)，又名130ZT，其在美国菌种保藏中心(ATCC)的保藏编 号为 ATCC 55618 (Int. J Syst. Bacteriol.，1999，49，207-216)，其琥珀酸产量在 50g/L 80g/L之间(US 5，723，322)。此外，属于假丝酵母属(Candida)的微生物(JP5617077B)、产 琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirllum succiniproducens) (US5, 143，834)，重组大肠杆菌 (CN1202930A)也具有较高的产酸能力。但是多数菌株在生产上不能满足工业生产在经济上 的要求，优良琥珀酸发酵菌种的欠缺一直是制约琥珀酸发酵工业发展的严重瓶颈，因此，迫 切需要筛选出能够以高浓度发酵生产琥珀酸的微生物菌株。近些年国内很多机构加强了产琥珀酸微生物菌株的筛选、改性过程(如 CN1814747A和CN1884484A)并建立了新型的琥珀酸发酵生产方法(如CN101023178A和 CN101029316A)。在琥珀酸发酵过程中，琥珀酸以及副产物如乳酸、乙酸等的积累会抑制发酵过程， 降低产物浓度，是阻碍琥珀酸发酵产业化的重要因素。为解除产物的抑制作用，可以采用 以下两个途径第一，将发酵产物及时转移，降低产物浓度，解除产物的抑制作用，推动发酵 过程向琥珀酸转化，强化琥珀酸发酵过程，提高底物转化率。第二，通过改变底物的浓度，如 CO2分压(浓度)，调控发酵过程，增大琥珀酸产量，减少副产物的产率。琥珀酸成本主要由发酵过程和分离费用组成，如何降低发酵费用、提高产量 是国内外的研究热点，已经出现了一定数量的专利。例如，一种产琥珀酸的菌株及其 筛选方法和应用(CN1884484A)，由粗水解产物生产琥珀酸的方法(CN1886516A)，产 生琥珀酸的方法(CN1875108A)，从发酵液中纯化琥珀酸的方法(CN1860237A)，新型 瘤胃细菌突变体及利用其制备琥珀酸的方法(CN1910273A)，生产琥珀酸的细菌和生 产琥珀酸的方法(CN1989238A)，大肠杆菌生产琥珀酸的方法(CN101029316A)，具有 增加的琥珀酸产量的突变大肠杆菌菌株(CN1202930A)，琥珀酸的固定化细胞单罐高 强度连续发酵工艺(CN101153294A)， Fermentation andpurification proess forsuccinic acid(US5,168，055), Proess for theproduction of succinic acid by anaerobic fermentation(US5, 143，833), Method for manufacturing organic acid by high-efficiency continuousfermentation(US6, 596,521), Method for producing succinic acid(JP2,006,320,208), Method for purifying succinic acid from fermentation broth(US5,958,744), Method for producing succinic acid from raw garbage and methodfor separating and purifying the same(JP2,006,296, 306), A proess forproduction of succinic acid from glucose(W02006/103531), Method forproducing succinic acid using wood hydrolysate(KR20,020,005, 200), Method for construction of bacterial strains with increased succinic acidproduction(US6, 159, 738)等。
另外，目前全球每年释放250多亿吨CO2，我国已于2002年成为《京都议定书》的 第37个签约国。作为一个负责任的大国，我国在不远的将来必然要承担一定量、甚至大幅 度温室气体的减排任务。乙醇是一种清洁、可再生能源。利用纤维素发酵生产乙醇是一个 产生CO2的过程，每生产一分子乙醇，会产生一分子C02，释放出大量的C02，不利于生物质资 源的高效利用。而在琥珀酸发酵过程中，每生产一分子琥珀酸可以固定一分子C02，这一绿 色反应过程引起很多专家的关注。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于生产琥珀酸放线杆菌。本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的。一种用于生产琥珀酸的放线杆菌，其保藏号为CGMCC2650。该放线杆菌为巴 斯德菌科(Pasteurellaceae)放线杆菌属(Actinobacillus)的产琥珀酸放线杆菌 (A. suCCin0genes)BE-l，其于2008年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，其保藏号为 CGMCC2650。为了获得上述用于生产琥珀酸的放线杆菌，本发明建立了一种快速有效的筛 选高产琥珀酸菌株的方法，该方法包括在常规培养基中添加有80-120mg/L两性霉素B、 60-80mg/L盐霉素富集来源于牛的瘤胃的菌株，之后添加30 100g/L的高浓度琥珀酸钠盐 进行平板筛选，随后紫外诱变提高产量，即取1 IOOmL菌体稀释液置于培养皿中，用5 50W紫外灯距离1 100cm照射，进行诱变。将诱变后在再生培养基平板上长出的菌落接种 到筛选培养基平板上，选取显色圈大的菌落作为初筛菌株。经连续传代3次后，将初筛菌株 接种到液体种子培养基中，37°C培养15 108小时后，按0. 5 10%接种量接种至液体发 酵培养基中，37°C下进行摇瓶发酵试验。具体来说，菌落原始样本来自瘤胃胃液，该胃液取自两头装有永久性瘘管的成年 公牛(北京畜牧兽医研究所)的瘤胃，取瘤胃胃液于添加两性霉素B、盐霉素的富集培养 基中在充满CO2的环境中厌氧培养2-5次。然后再挑选菌落，涂布于含有高浓度琥珀酸钠 (20 80g/L)的选择性平板上；用无菌牙签挑取菌落较大的菌株置于发酵培养基试管中， 厌氧发酵3-4天后取上清液，用HPLC法测定琥珀酸的含量。经过对来自多个瘤胃样品的大 量菌株筛选工作，从分离出来的近百株瘤胃细菌中共筛选出近45株产琥珀酸的菌株，其中大部分的产酸量都在10g/L以下，而且代谢中间产物的其它有机酸含量也很多，从中挑选 在发酵培养基中产杂酸较少，遗传稳定性好的菌株。本发明筛选得到的能有效积累琥珀酸的微生物经过16S rDNA基因鉴定， 以及按照《伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)》进行生理生化鉴定，认为其属于巴斯 德菌科(Pasteurellaceae)放线杆菌属(Actinobacillus)的产琥珀酸放线杆菌 (A. succinogenes) 0该菌属于格兰氏阴性菌、兼性厌氧。菌株在Biolog血平板上生长良 好，透明，有光泽，菌落圆形，边缘不整齐，中间有突起。1600倍显微镜观察，菌体呈短杆状， 细胞粘连在一起，无芽孢。菌体在平板、斜面上保存一周后，有明显的衰亡现象。
本发明的另一个目的在于提供一种采用上述用于生产琥珀酸放线杆菌生产琥珀 酸的方法，即一种琥珀酸的生产方法，其包括采用保藏编号为CGMCC2650的放线杆菌发酵 生产琥珀酸。在上述生产方法中，发酵的种子培养基包含葡萄糖10_50g/L，酵母膏5_15g/L， Na2HPO4 · 12H20 0. 1-2. Og/L, NaH2PO4 · 2H20 0. 1-2. Og/L, MgC035_20g/L，pH 为 6 7。在上述生产方法中，发酵的发酵培养基包含碳源10-100g/L，氮源5 · 30g/L, Na2HPO4 · 12H20 0. 1-2. Og/L，NaH2PO4 · 2H20 0. 1-2. Og/L, CaCl2 ·2Η200· 01—lg/L，MgCl2 ·6Η20 0.01-lg/L,MnCl2 0. 01-lg/L 以及 MgCO3 5-100g/L，pH 为 3 8。其中，碳源选自葡萄糖、果 糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木质纤维素水解液和糖浆中的一种或多种，例如秸秆 水解液或甜菜糖浆；氮源选自酵母膏、豆饼粉、玉米浆和无机铵盐中的一种或多种。发酵培 养基中还可以加入l-10ml/L的混合维生素溶液，每升培养基中含有维生素B12I 10mg， 叶酸1 20mg，硫胺素1 20mg，烟酸1 20mg和泛酸1 50mg。在上述生产方法中，在所述发酵过程中，使用碳酸盐溶液、NaOH溶液或氨水等碱 液，例如碳酸钠溶液保持发酵液的PH为5. 5-7. 5。在上述生产方法中，种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115 121°C，灭菌时 间为15min，微生物等热敏性材料配制后用0. 2μπι膜过滤除菌，接种前加入。发酵是在通CO2或N2的厌氧条件下进行的，30_40°C静止或搅拌培养，具体发酵方法如下首先，将实验菌株接种到种子培养基中，100ml三角瓶装液 20 80ml，于30-40°C在充满CO2的环境或在有氧的条件下振荡培养24-48小时。然后，按 照-10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度为30-40°C，发酵在通CO2 或队的厌氧条件下，厌氧培养1-4天。所述的琥珀酸发酵罐中添加有发酵培养基，使得葡萄 糖的最终浓度为80-175g/L，调节pH值为5. 4-7. 4，115°C灭菌30min，在发酵罐中加入种子 液，接种量为 10%，开启搅拌，在适宜温度下发酵；发酵菌种能够在高糖浓度下发酵。本发明还提供了一种琥珀酸和乙醇的联合生产方法，其包括以下步骤(1)采用纤维素发酵生产乙醇，同时释放包含CO2的气体；(2)以CO2为原料，采用根据权利要求1所述的放线杆菌发酵生产琥珀酸；上述联合生产方法还可以包括使用吸附剂吸附所述包含CO2的气体中的CO2作为 发酵生产琥珀酸原料，所述吸附剂选自分子筛、活性炭、氧化铝、二氧化硅和树脂吸附剂中 的一种或多种。本发明还提供了一种实施上述联合生产方法的装置，其包括乙醇发酵装置1、琥珀 酸发酵装置2、压缩装置3和吸附装置4，其中乙醇发酵装置1和琥珀酸发酵装置2通过管线相连，管线上分别设置压缩装置3和吸附装置4。其中，琥珀酸发酵装置可以为多个并联 的琥珀酸发酵装置；吸附装置可以为多个并联的吸附装置。本发明所提供的纤维素乙醇发酵与琥珀酸发酵的耦合装置，包括纤维素发酵装 置、压缩泵、吸附装置、琥珀酸发酵罐。纤维素乙醇发酵装置的顶部与传输泵相连通(相当 于导气的阀门)，然后连接有吸附装置，吸附除去泵出气体中的乙酸、甲酸等极性气体，与琥 珀酸发酵罐连通，提供纯化的CO2供琥珀酸发酵用。所述的一个或多个吸附装置与生物发 酵反应器相连的管线上安装有压缩泵。在纤维素乙醇发酵的过程中，首先连通阀门使得吸 附柱与纤维素发酵罐连通，采用吸附剂吸附脱除发酵产生气体中的乙醇、乙酸等少量极性气体，通过压缩泵与琥珀酸发酵罐连通，使得纤维素乙醇发酵过程中产生的CO2被琥珀酸发 酵利用，从而可以减少CO2释放、充分利用生物质能源。本发明将纤维素乙醇发酵与琥珀酸发酵工艺成功地进行耦合，并将纤维素发酵乙 醇装置与琥珀酸发酵装置耦合，提高了乙醇和琥珀酸产量并减少了 CO2释放，从而提高了生 物质利用率。具体来说，乙醇发酵阶段产生大量的CO2，其重量和乙醇的重量相当，而在生长 阶段主要产物CO2，整个过程产生的CO2的重量要大于乙醇的重量。另外，产生CO2的纯度很 高，达到99%以上，经过简单吸附处理，完全可以满足琥珀酸的发酵生产的需求。乙醇发酵 过程也是一个厌氧过程，通过设计合适的收集装置，与乙醇发酵反应器相连，将乙醇发酵产 生的废气收集，经过压缩和纯化后，得到高浓度的CO2,与琥珀酸发酵装置相连通，为琥珀酸 发酵提供高浓度CO2底物，强化琥珀酸的发酵过程，提高琥珀酸产量。由此可见，本发明的优点在于，从新鲜瘤胃中分离了有效产生琥珀酸的产琥珀酸 放线杆菌，该菌株是一株能有效生产琥珀酸的新菌株CGMCC2650，其在通CO2和N2的厌氧条 件并维持PH 5. 5-7. 5的环境下，厌氧发酵10-100g/L的糖质原料最高可生产110g/L琥珀 酸。用该菌株在发酵产琥珀酸的同时和纤维素乙醇发酵耦合，纤维素乙醇发酵过程中产生 的CO2可以作为琥珀酸发酵生产的原料，从而可以提高琥珀酸和纤维素乙醇的产量，同时实 现CO2的零释放。在琥珀酸发酵和纤维素乙醇发酵的耦合工艺中，琥珀酸的产量为92g/L， 乙醇的产量为108g/L。本发明的用于生产琥珀酸的放线杆菌于2008年9月2日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC2650。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中图1为本发明产琥珀酸放线杆菌CGMCC 2650的1600倍显微镜照片；图2为本发明实施例3中产琥珀酸放线杆菌CGMCC 2650的总DNA电泳图；图3为本发明实施例3中产琥珀酸放线杆菌CGMCC 2650的16SrDNA电泳；图4为本发明实施例6中琥珀酸发酵与纤维素乙醇发酵的耦合装置。附图标记与其所对应的部件说明如下1 纤维素乙醇发酵装置2 琥珀酸发酵装置3 压缩装置4 吸附装置
5 阀门
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明，而不用于限定本发明的范围。以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规 技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域技术人员可以通 过公共途径获得的。本发明中使用高效液相色谱(HPLC)法测定琥珀酸的含量，其条件为=SB-Aq 250X4. 6mm, 5 μ m ；流动相 20mM KH2PO4, pH 2. 7，DAD 检测器紫外检测波长 215nm。实施例1本发明产琥珀酸菌株的筛选本实施例为本发明产琥珀酸菌株的筛选方法，具体操作如下(1)取样从北京畜牧兽医研究所两头装有永久性瘘管的成年公牛的瘤胃中采样 胃 液。(2)富集取瘤胃胃液接种于IOOml添加100mg/L两性霉素B和80mg/L盐霉素 的富集培养基中，37°C在充满CO2的环境中厌氧培养24-48小时，按照5%的接种量进行两 次富集；其中，所使用的富集培养基组成为葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，Na2HPO4 · 12H20 3. 3g/L, NaH2PO4 · 2Η204· 4g/L, CaCl2 · 2Η20 lg/L, MgCl2 · 6Η20 lg/L, MnCl2O. lg/L, MgCO3IOg/ L,培养基pH3-8，115°C灭菌30分钟，冷却。(3)平板筛选取富集培养物用无菌水稀释后，涂布于含有高浓度琥珀酸钠40g/ L选择性平板上，37°C培养24-48小时，其中所使用的平板筛选培养基组成为TSB 10_40g/ L，琥珀酸钠30-50g/L，培养基pH 7，121°C灭菌20分钟，冷却。其中TSB培养基组成为胰 酶酶解酪蛋白 17g/L，蛋白胨 3g/L，葡萄糖 3g/L，NaCl 5g/L，K2HP042. 5g/L。(4)紫外诱变取1 IOOmL菌体稀释液于培养皿中，用5 50W紫外灯距离1 IOOcm处照射5 60秒，进行诱变，随后转接于再生培养基平板，其中再生培养基为TSB。(5)再次平板筛选将在再生培养基平板上长出的菌落接种到步骤(3)所使用的 平板筛选培养基上，选取显色圈大的菌落作为初筛菌株，连续传代3次。(6)发酵筛选用无菌牙签挑取菌落较大的菌株于发酵培养基的试管中，于发酵 培养基中厌氧发酵3-4天后取清液，用HPLC法测定琥珀酸的含量。其中所使用的发酵培 养基组成为葡萄糖 30g/L，酵母膏 15g/L，Na2HPO4 · 12H20 3. 3g/L，NaH2PO4 · 2H20 4. 4g/L， CaCl2 · 2H20 lg/L，MgCl2 · 6H20 lg/L, MnCl2 0. lg/L, MgCO3 10g/L，培养基 pH 3_8，115°C灭 菌30分钟，冷却。经过对多个瘤胃样品的大量菌株筛选工作，从分离出来的近百株瘤胃细菌中共筛 选出近45株产琥珀酸的菌株，其中大部分的产酸量都在10g/L以下，而且代谢中间产物的 其它有机酸含量也很多，从中复筛得到杂酸较少、遗传稳定性好的产琥珀酸菌株，命名为 BE-1，于2008年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC2650。实施例2对CGMCC2650菌株的生理生化鉴定产琥珀酸放线杆菌CGMCC 2650的1600倍显微镜照片如图1所示，从图1中可以看出，菌体呈短杆状，细胞粘连在一起，无芽孢。本实施例按照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)(Baltimore =Theffilliams and Wilkins Co. Baltimore Md出版，2004年5月)中的生理生化鉴定方法，对CGMCC2650菌株 的生理生化进行鉴定，结果如表1和表2所示。表1CGMCC2650生理生化鉴定结果
生理生化指标_^_
革兰氏染色-
过氧化氢酶+
氧化酶+
H2S_
V-P-
凝胶水解-葡萄糖产气-硝酸盐还原+ β-半乳糖苷酶+ 精氨酸双水解酶-色氨酸(吲哚)-精氨酸双水解酶-赖氨酸脱羧酶-
鸟氨酸脱羧酵_-__
发酵葡萄糖产酸+发酵甘露糖产酸+ 发酵甘露醇产酸 +
发酵D-山梨醇产酸_+_表2CGMCC2650碳源分布情况 “ + ”是正反应，“_”是负反应实施例3对CGMCC2650菌株16S rDNA序列比对本实施例提取出BE-I菌体总DNA，设计引物扩增出其16S rDNA基因后进行测序， 并在NCBI数据库进行同源性数据比较。16S rDNA基因扩增及PCR产物分析模板的制备吸取适量菌体离心，取出菌体沉 淀，使用基因组抽提试剂盒(基因组DNA提取方法请参见《细菌分子遗传学分类鉴定法》(上 海科学技术出版社，1990年)抽提菌体总DNA，片段大小在20k bp左右，电泳结果如图2所不。16S rDNA基因引物的设计采用通用引物1，F27 (SEQ. ID. NO. 1， 5 ‘ -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 ‘)禾口弓I 物 2，R1492 (SEQ. ID.NO. 2， 5 ‘ -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘)(上海生工生物工程技术服务有限公司)。PCR反应体 系见表3，反应条件见表4，每批次PCR反应均设立阴性参照(加入引物但不加入模板的空 白对照)，扩增出的基因片段大小在1375bp 1584bp之间，电泳结果见图3。表3PCR反应体系 表4PCR反应条件 委托宝生物工程(大连)有限公司对扩增出的16S rDNA基因进行测序，测序结果 如SEQ. NO. 3所示。将测序结果在NCBI数据库进行同源性数据比较，采用BLAST比对方法 获得结果，如表5所示。表516S rDNA序列同源性比较菌林名称__NCBI编号_同源‘I·生(％)
CGMCC 2650 -100
Actinobacillus succinogenes 130ZNC—009655.199
Mannheimia succiniciproducensNC 006300.193 MBEL55E
Actinobacillus pleuropneumoniaeAACKO 1000032.193 serovar 1 str. 4074
Haemophilus influenzae 3655NZ_AAZF01000002.193
Actinobacillus pleuropneumoniae L20NC_009053.193
Haemophilus somnus 2336 HasoO 1_39AACJ01000039.193
Haemophilus somnus 129PTNC_008309.193
Haemophilus ducreyi 35000ΗΡNC_002940.292
Pasteurella mult0Cida subsp. mult0CidaNC_002663.192 str. Pm70
Haemophilus influenzae PittEENC_009566.192
Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894NC_009778.188
Serratia proteamaculans 568reflNC—009832.188 Escherichia coli E24377ANC_009801.188
Shigella flexneri 2a str. 2457T_NC_004741.1_87实施例4CGMCC2650菌株发酵生产琥珀酸种子培养基组成为葡萄糖10-50g/L，酵母膏 5-15g/L，Na2HPO4 · 12H200. 1-2. Og/ L, NaH2PO4 · 2H20 0. 1-2. 0g/L, MgCO3 5_20g/L，培养基 pH 6—7。发酵培养基组成为葡萄糖70g/L，酵母膏 5-30g/L，Na2HPO4 · 12H200. 1-2. 0g/L, NaH2PO4 ·2Η20 0. 1-2. 0g/L，CaCl2 · 2Η20 0. 01-lg/L, MgCl2 ·6Η200· 01-lg/L，MnCl2 0. 01-lg/ L，MgCO3 5-100g/L,培养基pH 3-8,115°C灭30min，冷却，另外添加混合维生素溶液，每升包 含··维生素B121 10mg，叶酸1 20mg，硫胺素1 20mg，烟酸1 20mg和泛酸1 50mg， 过滤灭菌。5L NBS发酵罐发酵罐培养时，发酵培养基装液量为3L，以50g/LMgC03作为pH缓 冲剂，搅拌转速为90rpm 95rpm。以5% (V/V)接种量接种种子培养基到发酵培养基中， 通入CO2气体厌氧发酵，通气量是0. 5L/min, 37°C，90rpm 95rpm发酵30小时后高效液相 色谱(HPLC)检测琥珀酸。结果表明，琥珀酸产量可达110g/L，生产强度达3.5g/L*h，琥珀 酸相对于葡萄糖的产率是0. 786g琥珀酸/g葡萄糖。实施例5CGMCC2650菌株发酵生产琥珀酸种子培养基组成为葡萄糖10-50g/L，酵母膏 5-15g/L，Na2HPO4 · 12H200. 1-2. Og/ L, NaH2PO4 · 2H20 0. 1-2. 0g/L, MgCO3 5_20g/L，培养基 pH6_7。
发酵培养基组成为葡萄糖70g/L，酵母膏 5_30g/L，Na2HPO4 · 12H200. 1-2. Og/L, NaH2PO4 ·2Η20 0. 1-2. Og/L，CaCl2 · 2Η20 0. 01-lg/L，MgCl2 ·6Η200· 01-lg/L，MnCl2 0. Ol-Ig/ L,培养基pH3-8，115°C灭菌30分钟，另外添加混合维生素溶液，每升包含维生素B12I 10mg，叶酸1 20mg，硫胺素1 20mg，烟酸1 20mg和泛酸1 50mg，过滤灭菌。5L发酵罐培养时培养基装液量为3L，不通CO2,分别以氨水、10mol/LNa0H、IOmol/ Κ0Η,20% (1/力妝20)3溶液作为？!1调节剂，控制发酵？!1值为6.80。以5% (V/V)接种量接 种种子培养基，24小时后以5% (V/V)接种量接种种子培养基到发酵培养基中(5L NBS发 酵罐)，37°C，90rpm发酵48小时后高效液相色谱(HPLC)检测琥珀酸。相关结果如表6所 示，除了采用妝20)3作为pH调节剂的琥珀酸产量高，其余pH调节剂对于提高琥珀酸产量的 作用不大。表6不同pH调节剂发酵产琥珀酸酸产量
pH 调节剂_M1_NaOH_KOH_Na2CO3
琥珀酸(g/L) 10.1_2J_L9_50.1实施例6琥珀酸发酵与纤维素乙醇发酵耦合琥珀酸发酵体系同实施例4。在琥珀酸发酵罐中添加有发酵培养基，使得葡萄糖的 最终浓度为80-175g/L，调节PH值为5. 1_7. 4，115°C灭菌30min，在发酵罐中加入种子液，接 种量为 10%，开启搅拌90rpm 600rpm，在适宜温度下发酵(30°C 37°C )；本发明 所筛选出的琥珀酸发酵放线杆菌能够在高糖浓度下进行发酵。纤维素乙醇由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(购自国家生化工程技术研 究中心(北京))发酵。培养基为在玉米秸秆水解液中添加蛋白胨5-30g/L，Na2HP04*12H20
0.1-2. Og/L, NaH2PO4 · 2H20 0. 1-2. Og/L，调节 pH 值为 5. 0-7. 4，115 °C 灭菌 30min。其中 玉米秸秆水解液通过以下方法制备玉米秸秆补料酶解，汽爆粉碎的玉米秸秆起始浓度为 12wt%，纤维素酶(购自国家生化工程技术研究中心(北京))，用量为10U/g底物，分别在 反应12h、36h和60h补料6%，底物最终浓度达到30%。120h时，水解液中的葡萄糖浓度达 到175g/L。纤维素乙醇的发酵温度为30°C 37°C，搅拌转速为90 300rpm。纤维素乙醇发酵与琥珀酸发酵的耦合装置如图4所示，包括纤维素乙醇发酵装置
1、琥珀酸发酵装置2、压缩装置3和吸附装置4，其中两个发酵装置通过管线相连，管线中间 设置有阀门5，管线上安装有压缩装置3和吸附装置4。所述管线可以并联多个，且在各管 线上都安装有阀门。所述吸附装置可以为一个，也可以两个或者多个并联，其中所使用的吸 附剂选自分子筛、活性炭、氧化铝或二氧化硅和树脂吸附剂，用来吸附除去从纤维素乙醇发 酵装置泵出气体中的乙酸、甲酸等极性气体，以提供纯化的CO2供琥珀酸发酵使用，从而可 以减少CO2释放、充分利用生物质能源。两个发酵过程可以都以纤维素酶解产物中的单糖为原料，在发酵培养基中均以 10M NaOH作为pH缓冲剂。利用酿酒酵母发酵纤维素生产乙醇产生的副产物CO2，通过管路 输送到琥珀酸发酵罐进行琥珀酸的发酵生产，发酵35h时，琥珀酸的产量为92g/L，转化率 为80% ；乙醇产量为108g/L，转化率达到91%。由此可见，所述的耦合发酵过程可以明显 提高琥珀酸和纤维素乙醇生物发酵的产量，可以实现发酵过程中CO2的零释放。
序列表<110>中国科学院过程工程研究所<120>用于生产琥珀酸的放线杆菌和方法<130>DIC09110015<160>3<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1agagtttgat catggctcag 20<210>2
<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tacggttacc ttgttacgac tt 22<210>3<211>1477<212>DNA<213>CGMCC2650 的 16S rDNA 序列<400>3ggcggcaggc ttacacatgc aagtcgaacg gtaacgggtg gaaagcttgc tttccatgct 60gacgagtggc ggacgggtga gtaatgcttg gggatctggc ttatggaggg ggataacgac 120gggaaactgt cgctaatacc gcgtaatgtc taaggactaa agggtgggat tttcggaccg 180cccgccataa gatgagccca agtgggatta ggtagttggt ggggtaaagg cctaccaagc 240cgacgatctc tagctggtct gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca 300gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcgcaatg ggggcaaccc tgacgcagcc 360atgccgcgtg aatgaagaag gccttcgggt tgtaaagttc tttcggtggt gaggaaggcg 420aataagttaa cagcttattc gattgacgtt agccacagaa gaagcaccgg ctaactccgt 480gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgcg agcgttaatc ggaataactg ggcgtaaagg 540gcacgcaggc ggctatttaa gtgagatgtg aaatccccgg gcttaacctg ggaactgcat 600ttcagactgg gtagctagag tactttaggg aggggtagaa ttccacgtgt agcggtgaaa 660
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一种用于生产琥珀酸的放线杆菌，其保藏号为CGMCC2650。
2.一种琥珀酸的生产方法，其包括采用根据权利要求1所述的放线杆菌发酵生产琥珀酸。
3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述发酵的种子培养基包含葡萄糖 10-50g/L，酵母膏 5-15g/L, Na2HPO4 · 12H20 0. 1-2. Og/L, NaH2PO4 · 2H20 0. 1-2. Og/L, MgCO3 5-20g/L，pH 为 6 7。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵的发酵培养基包含碳 源 10-100g/L,氮源 5-30g/L, Na2HPO4 · 12H20 0. 1-2. 0g/L, NaH2PO4 · 2H20 0. 1-2. Og/L, CaCl2 · 2H20 0. 01-lg/L, MgCl2 · 6H20 0. 01—lg/L，MnCl2O. 01-lg/L 以及 MgCO3 5-100g/L，pH 为3 8。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、果糖、木糖、麦芽 糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木质纤维素水解液和糖浆中的一种或多种；所述木质纤维素水解液 优选为秸秆水解液，所述糖浆优选为甜菜糖浆。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述氮源选自酵母膏、豆饼粉、玉米浆 和无机铵盐中的一种或多种。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中每升培 养基还包含维生素B12 1 10mg，叶酸1 20mg，硫胺素1 20mg，烟酸1 20mg和泛酸 1 50mgo
8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于，在所述发酵过程中，使用碳 酸盐溶液、氨水或NaOH溶液等的碱液，例如碳酸钠溶液保持发酵液的pH为5. 5-7. 5。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵是在CO2和/或N2 的厌氧条件下进行的。
10.一种琥珀酸和乙醇的联合生产方法，其包括以下步骤(1)采用纤维素发酵生产乙醇，同时释放包含CO2的气体；(2)以CO2为原料，采用根据权利要求1所述的放线杆菌发酵生产琥珀酸。
11.根据权利要求10所述的生产方法，其特征在于，其中还包括使用吸附剂纯化包含 CO2的气体中的CO2，所述吸附剂选自分子筛、活性炭、氧化铝、二氧化硅和树脂吸附剂中的 一种或多种。
12.一种实施权利要求10或11所述的生产方法的装置，其包括乙醇发酵装置(1)、琥 珀酸发酵装置(2)、压缩装置(3)和吸附装置(4)，其中乙醇发酵装置(1)和琥珀酸发酵装 置(2)通过管线相连，管线上分别设置压缩装置(3)和吸附装置(4)。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述琥珀酸发酵装置为多个并联的琥 珀酸发酵装置。
14.根据权利要求12或13所述的装置，其特征在于，所述吸附装置为多个并联的吸附装备。
全文摘要
本发明提供了用于生产琥珀酸的放线杆菌和方法。本发明提供的发酵糖质原料产生琥珀酸的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC2650，可发酵生产琥珀酸，或者将琥珀酸发酵与纤维素乙醇发酵进行联合生产。在通入CO2和/或N2的厌氧条件并维持pH 5.5-7.5的环境下，厌氧发酵10-100g/L的糖质原料可生产10-110g/L琥珀酸。联合生产方法是将纤维素乙醇发酵过程中产生的CO2，用于琥珀酸的发酵生产，从而可以提高琥珀酸和纤维素乙醇的产量，实现CO2的零释放。在联合生产中，琥珀酸产量可以达到92g/L，纤维素乙醇的产量均达到108g/L。
文档编号C12P7/46GK101845407SQ20091008081
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月23日 优先权日2009年3月23日
发明者李强, 李望良, 苏志国, 邢建民 申请人:中国科学院过程工程研究所