专利名称：一种检测布鲁菌的基因液相芯片及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测布鲁菌(^""ce〃a ^p.， Bn/)的基因液相芯片及其 制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。
背景技术：
液相芯片检测是近几年发展起来的新兴技术，具有快速、特异、敏 感的特点。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜 色，作为IOO种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5nm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据 不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。
布鲁菌是布鲁菌病(brucellosic)的病原体，可感染人类、多种家畜和 野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤，如发热、流产与不育、十曼 性关节炎及神经损害等，而且引起的人类波状热、慢性感染至今无法根 治。因此，布病不仅损害人类健康，还影响着包括乳、肉及其制品、皮、 毛等在内的民生需求，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题，是 传统的生物战剂之一。
布鲁菌病的诊断除通过直接涂片染色镜检、分离培养外，也有免疫 学方法如正LISA、 cELISA等。近年来，布鲁菌分子生物学检测方法如 PCR、实时荧光PCR也飞速发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测布鲁菌的基因液相芯片，该基因液相 芯片可以用于病原体布鲁菌的检测。本发明还提供利用所述的基因液相 芯片进行检测的方法。
经过深入和大量的研究和实验，本发明以布鲁菌5CSi^基因特异序 列为耙序列，建立了布鲁菌的基因液相芯片和检测方法，为该菌的检测提供一条可行的途径。
本发明所述的基因液相芯片包括荧光编码的微球、捕获探针、引 物、PCIL良应体系、链亲和素一藻红蛋白。
本发明的PCR^应体系包括10xPCR緩冲液、dNTPs、 TaqDNA聚合酶。
本发明的引物包括:
耙组织引物序列(5，國3，)基因位 置长 度产物大 小
布鲁菌Bru誦FTGGCTCGGTTGCCAATATCAABCSP3121223
Bru -RGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG20
其中，下游引物是5'生物素标记的Bru-R，具体例如是Ft-R: 5，-生物 素-GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG
本发明的捕获探针，所述的捕获探针具有特异性:
探针 名称探针靶位探针序列(5，-3,)
Bru布鲁菌BC5P37基因的 842-864bpTTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT
本发明中，所述捕获探针在合成时在5'端进行氨基修饰，并且连接 15-20个T或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球进行偶 联。
本发明的微球， 一般选择荧光编码的微球，例如来源于Luminex或 其他代理公司的任何编号的微球，特异性探针与焚光编码孩"求偶联形成 检测微球，由此构成检测芯片。
本发明的链亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin ， SA-PE ) 为一种荧光蛋白，能被液相芯片检测系统中的绿色激光激发发光，由此 可以进行定性或定量检测。
本发明涉及上述基因液相芯片的制备方法，该方法包^^:
1. 选取编码微球，取适量例如约1.25x 106个于离心管内，离心弃上清 后，加入一定量，例如0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液使之重悬；
2. 用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针(即捕获探针Bru)稀释，加至微球 悬浮液中，振荡混匀；
53. 加入例如10 mg/mL的EDC ( l-乙基-3-[3-二曱基氨基丙基]碳二亚胺 盐酸盐)溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀，室温孵育例如30
分钟；
4. 用例如0.02%的PBST洗涤，14000g下离心；移弃上清液，将上述孩t 球重悬于例如1 ml的0.1% SDS (即十二烷基磺酸钠)中，洗涤，离
5. 移弃上清液，微球重悬于例如100itil的pH8.0TE中，振荡悬起混匀， 得到偶联好的检测微球，即本发明的基因液相芯片，4。C避光保存。
另 一方面，本发明还涉及上述布鲁菌检测基因液相芯片的检测方法， 该方法包括样本核酸的提l^， PCR扩增，；险测病原体。本发明对上述 三个步骤的操作和条件进行了改进和优化。
本发明的样本核酸的提取采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核 酸。例如，具体步骤如下
1) 向每管样本中加入6mol/LNal，振荡混匀，煮沸；
2) 离心，转上清液至另一含20%玻璃粉液的离心管中；
3) 充分混匀，室温放置10分钟，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上； 8000r/分钟离心，小心倾去上清液；
4) 向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/o乙醇l ml,充分混匀，离心， 小心倾去上清液；
5) 重复步骤(4)，然后置于37。C恒温箱内干燥；
6) 向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20jxlTE，充分混匀，65°C 加热，离心，回收上清液备用。
本发明的PCR扩增包括，以上述核酸提取步骤中制备的上清液作为 PCR反应的模板，采用PCR反应体系以及反应条件。 本发明的PCR体系例如是
10xPCR緩冲液 3^1
Taq DNA聚合酶 0.3^1
dNTPs: 0.3 (il
上游引物 0.3|ul
下游引物 0.3pl 模板DNA: 2jxl双蒸水ddH20: 补足30inl
反应条件
预变性
94-96。C 10分钟
35个循环
94-96°C 30-40秒 55-58。C 30-40秒 72 。C 30-40秒
延伸
72 °C 4-7分4中
同时，PCR空白对照品为如下
10xPCR緩冲液 3 pl
Taq酶 0.3|iil dNTPs: 0.3 |il
上游引物 0.3(^1 下游引物 0.3nl 双蒸水ddH20: 补足30ji1
反应结束后以1%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。 本发明的检测方法，优选是
1) 取上述两种偶联微球混合，装于PCR管中，根据微球计数结 果计算相应加入量，使每种樣i球的量相同，每次反应每种 3000-5000个；
2) 向各管中加5-17pl上面的PCR扩增得到的产物，混匀；
3) 95。C变性10分钟；随后45 ~ 60。C反应10 ~ 30分钟；
4) 离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；
5) 再向各孔加SA-PE，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE;
6) 再向各孔加入75iiilTE悬浮液，振荡使微球重悬；
7) 反应结束后上LUMINEX检测仪器进行检测。例如使用Bio-plex 检测设备，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从 而对微球编号进行识别，绿色激光对结合体的荧光蛋白进行识别，实现 捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。
附图为用探针Bru检测布鲁菌核酸的剂量-反应曲线，即模板DNA 的量与发生反应的荧光信号值MFI之间的对应关系；横轴代表PCR反应 体系中模板DNA的浓度(fg/test)，纵轴代表荧光信号值MFI。
具体实施例方式
实施例l、基因液相芯片的制备
1.选取编码微J求，如025号，取约1.25xl()6个置于离心管，14000g 下离心，例如离心3-5分钟，小心吸出上清液；
2. 加入50 (il O.lmol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡混匀。
3. 用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到O.lmmol/L;将lpl稀释的 探针Bru加于025号微球悬浮液中，振荡混匀。
4. 加入2.5^1新鲜配制的10 mg/mL的EDC溶液至孩U求与揮:针混和液 中，振荡，室温孵育30分钟。
5. 用0.02% PBST lml洗涤l次,离心14000g 3-5分钟。
6. 移弃上清液，微球重悬于1 ml0.1%SDS中，洗涤，离心。
7. 移弃上清液，微球重悬于lOOpl pH8.0 TE中，振荡悬起混匀，即 得到偶联好的检测微球。
8. 用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度。
9. 把偶联好的检测微球放在4。C避光保存， 一般每种探针偶联的微球 单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
实施例2、样本核酸的提取
采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核酸。具体如下
1) 向每管样本中加入6mol/LNal 100pl，振荡混匀，煮沸30分钟。
2) 将上述煮沸处理的样本于10000r/分钟离心5分钟，将上清液转 至另 一含20%玻璃粉液的离心管中。
3) 充分混匀，置室温10分钟，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上 清液。
4) 向玻璃粉DNA沉淀中加入75。/。乙醇1 ml，充分混匀，洗涤玻璃 粉，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上清液。5) 重复清洗一次后，放置于37。C恒温箱使彻底干燥。
6) 向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20plTE，充分混匀，65°C 加热15分钟。8000r/分钟离心2分钟，回收上清液备用。
实施例3、 PCR扩增
以回收的上清液作为PCR反应的模板，PCR反应体系以及反应条件: PCR体系
10 xPCR緩冲液
Taq酶
dNTPs:
上游引物
下游引物
模板DNA:
双蒸水ddH20:
反应条件
预变性
94 。C
35个循环
94。C
58°C
72。C
延伸
72 °C
3 (il 0.3|nl 0.3 jil 0.3|til 0.3|ul
补足30j^1
10分钟
30秒 30秒 40秒
7分钟
同时设置PCR空白对照，如下
10xPCR緩冲液 3^1
Taq酶 0辜
dNTPs: 0.3 pi
上游引物 0.3nl
下游引物 0.3pl
双蒸水ddH20: 补足30(al
反应结束后以1 %的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。实施例4、检测
1. 取偶联微球025号各5000个混合，分装于PCR管中(根据微球 计数结果计算相应加入量)
2. 向各管中加5 ~ 17^1上面的PCR产物使其终体积为50(1l。
3. 95。C变性IO分钟。
4. 45 ~ 60。C反应10 ~ 30分钟。
5. 转移至滤板抽滤去捧未结合的PCR产物。
6. 再向各孔加75(il 4ng/|iil SA-PE，室温避光孵育IO分钟，抽滤 去掉未结合的SA-PE。
7. 再向各孔加入75inl悬浮液，振荡使微球重悬。
8. 反应结束后上纟;U^测。
9. Bio-plex检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发 微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色微球对表面结 合的荧光染料进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定 量分析。
在检测时，同时以PCR阴性对照进行检测做为检测本底。对于每个 检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球 群的焚光强度中位值(Median Fluorescence Intensity,MFI )，亦即读取的这 种编号的微球群(IOO个或以上)的每个微球信号强度的统计平均值。结 果判断当待检测样本孔的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时 即判为阳性。
实施例5、定量检测
提取布鲁菌的基因组DNA，利用核酸蛋白分析仪测定其浓度，进行 系列稀释，PCR扩增后，同上面检测步骤进行检测，Bio-Plex Version 4.0 分析，拟合出剂量-反应曲线和曲线方程。样本检测值代入方程实现定量 检测。
结果
针对布鲁菌的检测，本发明设计了位于染色体5CS尸37基因的探针进行检测。提取布鲁菌基因组DNA测定浓度后进行10倍系列稀释， 10fg~108fg,按上述确定的方法进行PCR扩增和检测，拟合曲线，得出 曲线方程
探针Bru的曲线方程
FI =2.66921 + (2535.28-2.66921) / (1 + (Cone / 1.902E+006)画28)
从标准曲线计算出检出限，本发明的检出限为24pg/test。
从上述结果可以得出，本发明的悬浮芯片和;f企测方法具有以下优越
性
1. 灵敏较之于普通的多重PCR反应，本发明的灵敏度提高从以下 两个方面体现1)检测仪器存在信号的放大系统；2)PCR产物带上的 生物素与荧光染料藻红蛋白连接的亲和素结合的^t大作用。
2. 特异采用核酸纟笨针^a术对标记上生物素的PCR产物进行特异性 的识别，而非传统的电泳方法通过PCR产物片段大小进行识别。
3. 准确高效整合核酸体外扩增、核酸分子杂交、编码微球、生物素 标记、荧光检测和流式细胞技术于一体，同时实现核酸样品的检测、鉴 定，使结果准确，工作高效。
4. 芯片制作方便只用设计好待检目标菌的引物，优化PCR条件， 标记对应的探针于编码微球，即可组装成检测体系。
5. 本发明涉及的方法同样适用于其他病原体或目标物的核酸检测。可 实现多重检测，待检目标灵活可调可根据不同检测目标，选择对应的 引物和微球，组成不同目标组合的检测体系。
权利要求
1.一种检测布鲁菌(Brucella spp.，Bru)的基因液相芯片，该芯片包括荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白。
2. 权利要求l所述的基因液相芯片，其中所述引物包括Bru-FTGGCTCGGTTGCCAATATCAABru -RGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG下游引物5，端经生物素标记Bru -R: 5，誦生物素-GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG。
3.权利要求1所述的基因液相芯片，其中所述捕获探针选自探针名称4笨针序列(5，-3，)BruTTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT上面所述探针在合成时在5'端进行氨基修饰，并且连接15-20个T 或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球进行偶联。
4. 一种制备权利要求l-3任一项所述的基因液相芯片的方法，该方法包 括1) 选取编码微球，取适量于离心管内，离心弃上清后，加入2-(n-吗啉代) 乙磺酸溶液使之重悬；2) 用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针，即捕获探针Bru稀释，加至微球悬 浮液中，振荡混匀；3) 加入EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀，室温孵育；4) 用0.02。/。PBST洗涤，14000g下离心；移弃上清液，将上述微球重悬 于0.1。/。SDS中，洗涤，离心；5) 移弃上清液，微球重悬于pH8.0TE中，振荡悬起混匀，得到偶联好 的检测微球，得到所述基因液相芯片。
5. 利用权利要求1-3任一项所述的基因液相芯片检测布鲁菌的方法， 该方法包括样本核酸的提取，PCR扩增，检测病原体核酸。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述样本核酸的提取包括以下步骤1) 向每管样本中加入NaI，振荡混匀，煮沸；2) 离心，转上清液至另一含20%玻璃粉液的离心管中；3) 充分混匀，室温放置，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；离心，小心倾 去上清液；4) 向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/。乙醇，充分混匀，离心，小心倾去上 清液；5) 重复步骤4),然后置于37。C恒温箱内干燥；6) 向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加TE,充分混匀，65。C加热，离心， 回收上清液备用。
7. 权利要求5或6所述的方法，其检测步骤包括1) 取上述偶联微球，装于PCR管中，根据微球计数结果计算相应加入 量；2) 向各管中加5~17^1上面的PCR扩增得到的产物，混匀； 3 ) 95°C变性10分钟；随后45 ~ 60。C反应10-30分钟；4) 离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；5) 再向各孔加SA-PE，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE;6) 再向各孔加入75plTE悬浮液，振荡使微球重悬；上检测仪器进行检测。
全文摘要
本发明涉及一种检测布鲁菌的基因液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。本发明以BCSP31特异基因为靶序列，建立了布鲁菌液相芯片和检测方法，为布鲁菌的检测提供一条可行的途径。
文档编号C12Q1/68GK101560563SQ20091008026
公开日2009年10月21日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者刘衡川, 孙肖红, 文海燕, 宇 杨, 静 王, 胡孔新 申请人:中国检验检疫科学研究院