专利名称：一种检测类鼻疽的基因液相芯片及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测类鼻疽(B"HywWen'a戸ei/cfowa〃" 5./ )的基因液相 芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的 方法。
背景技术：
液相芯片检测是近几年发展起来的新兴技术，具有快速、特异、敏 感的特点。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜 色，作为IOO种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5pm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据 不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。
类鼻疽菌为革兰阴性，双极，需氧，有动力，棒状无芽孢杆菌。类 鼻疽菌引起热带和亚热带地区人和动物的类鼻疽病，感染人可通过过呼 吸道、皮肤等多途径进入人体内，潜伏期一般为3~5天，少数也有数年 后发病，即所谓"潜伏型类鼻疽"，甚至20年以上。本病有急性败血症 型、亚急性、慢性及亚临床型3种表现，临床症状不典型，不易诊断。 亚急性或慢性类鼻疽典型表现是类似结核病的肺叶空洞，急性败血症患 者常伴多处化脓性损害，病情一般较为严重，如不及时治疗，病死率很 高。
应用传统的培养、生化鉴定的方法对类鼻疽做出^^断通常需要1周的 时间才能获得结果，且往往导致鉴定错误。利用直接免疫荧光、胶乳凝 集、ELISA等免疫学方法对培养物或标本中的抗原、外毒素等进行冲企测特 异性和敏感性都较好。分子生物学方法检测类鼻疽菌已见诸多报道。
发明内容
本发明涉及一种改进的基因液相芯片及其制备方法，该基因液相芯 片可以用于病原体类鼻疽的检测。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。
经过深入和大量的研究和实验，本发明以类鼻疽染色体标识序列为 靶序列，建立了类鼻疽的基因液相芯片和检测方法，为该菌的检测提供 一条可行的途径。
本发明所述的基因液相芯片包括微球、捕获探针、引物、PCR^ 应体系、链亲和素一藻红蛋白，该基因液相芯片可4企测类鼻疽。
本发明还涉及上述可检测类鼻疽的基因液相芯片，该芯片包括荧 光编码的微球、捕获探针、引物、PCR^应体系、链亲和素一藻红蛋白。
本发明的PCR^应体系包括10xPCR緩冲液、dNTPs、 Taq DNA聚 合酶。
本发明的引物包括:
靶引物序列(5，画3，)基因长产
组位置度物
织大 小
类Bp-FCGATCTCGTCAAGGTGTCGG染色体20
鼻 疽Bp-RCCCCAGTTCATCTGATACTTGC标识序 歹'J22150
其中，下游引物是5'生物素标记的Bp-R。
具体例如是Bp-R: 5，-生物素-CCCCAGTTCATCTGATACTTGC
本发明的捕获探针，所述的捕获探针具有特异性
探针 名称探针靶位探针序列(5，-3，)
Bp类鼻疽染色体标识序列 209-231 bpAGGTCAATTTCCCGAACAAGACT
本发明中，上面所述捕获探针在合成时在5'端进行氨基修饰，并且 连接15-20个T或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球 进行偶联。
本发明的微球， 一般选择荧光编码的微球，例如来源于Luminex或
5其他代理公司的任何编号的微球，特异性探针与焚光编码微球偶联形成 检测微球，由此构成检测芯片。
本发明的链亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin , SA-PE ) 为一种荧光蛋白，能被液相芯片检测系统中的绿色激光激发发光，由此 可以进行定性或定量检测。
本发明涉及上述基因液相芯片的制备方法，该方法包括
1. 选取编码微球，取适量例如约1.25x 106个于离心管内，离心弃上清 后，加入例如0.1 mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液使之重悬；
2. 用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针(即捕获探针Bp)稀释，加至微球 悬浮液中，振荡混匀；
3. 加入10 mg/mL的EDC ( l-乙基-3-[3-二曱基氨基丙基]碳二亚胺盐酸 盐)溶液至微球与探针混和液中，振荡混勻，室温孵育例如30分钟；
4. 用0.02。/。PBST洗涤，14000g下离心；移弃上清液，将上述微球重悬 于例如lml的0.1。/oSDS (即十二烷基磺酸钠)中，洗涤，离心；
5. 移弃上清液，微球重悬于例如100(il的pH8.0TE中，振荡悬起混匀， 得到偶联好的检测微球，即本发明的基因液相芯片。4。C避光保存。
另一方面，本发明还涉及上述类鼻疽检测基因液相芯片的检测方法， 该方法包括样本核酸的提取，PCR扩增，检测病原体。本发明对上述 三个步骤的操作和条件进行了改进和优化。
本发明的样本核酸的提取采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核 酸。例如，具体步骤如下
1) 向每管样本中加入6mol/LNal，振荡混匀，煮沸；
2) 离心，转上清液至另一含20%玻璃^=分液的离心管中；
3) 充分混匀，室温放置10分钟，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上； 8000r/分钟离心，小心倾去上清液；
4) 向玻璃粉-DNA沉淀中加入75%乙醇1 ml,充分混匀，离心， 小心倾去上清液；
5) 重复步骤(4)，然后置于37。C恒温箱内干燥；
6) 向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20plTE，充分混匀，65°C 加热，离心，回收上清液备用。
本发明的PCR扩增例如是以上述核酸提取步骤中制备的上清液作为PCR反应的模板，PCR反 应体系以及反应条件。
本发明的PCR体系例如是
10xPCR緩冲液 3 jil
TaqDNA聚合酶 0.3jxl
dNTPs: 0.3nl
上游引物 0.3pl
下游引物 0.3|til
模板DNA: 2|il
双蒸水ddH20: 补足30fxl 反应条件 预变性
94-96°C 10分4中 35个循环
94-96 。C 30-40秒
55-58°C 30-40秒
72 °C 30-40秒 延伸
72 °C 4-7分钟 同时，PCR空白对照品为如下
10xPCR緩沖液 3^1
Taq酶 0牟
dNTPs: OJ)il
上游引物 0.3jil
下游引物 0.3^1
双蒸水ddH20: ^卜足30^d
反应结束后以P/。的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。
本发明的^r测方法包括
1)取上述两种偶联微球混合，装于PCR管中，根据微球计数结 果计算相应加入量，使每种微球的量相同，每次反应每种例如3000-5000个；
2) 向各管中加5-17pl上面的PCR扩增得到的产物，混匀；
3) 95°C变性10分钟；随后45 ~ 6(TC反应10 ~ 30分钟；
4) 离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；
5) 再向各孔加SA-PE，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE;
6) 再向各孔加入75|ilTE悬浮液，振荡使微球重悬；
7) 反应结束后土 LUMINEX检测仪器进行检测。例如使用Bio-plex 检测设备，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从 而对微球编号进行识别，绿色激光对结合体的荧光蛋白进行识别，实现 捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。
附图为用探针Bp检测类鼻疽核酸的剂量-反应曲线，即模板DNA的 量与发生反应的焚光信号值MFI之间的对应关系；横轴代表PCR反应体 系中模板DNA的浓度(fg/test),纵轴代表荧光信号值MFI。
具体实施例方式
实施例l、基因液相芯片的制备
1.选取编码微球，如034号，取约1.25xl()6个置于离心管，14000g 下离心，例如离心3-5分钟，小心^及出上清液；
2. 加入50 fxl 0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡混匀。
3. 用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L;将lpl稀释的 探针Yp加于034号微球悬浮液中，振荡混匀。
4. 加入2.5nl新鲜配制的10 mg/mL的EDC溶液至凝J求与4笨针混和液 中，振荡，室温孵育30分钟。
5. 用0.02% PBST lml洗涤1次，离心14000g 3-5分钟。
6. 移弃上清液，微球重悬于1 ml 0.1%SDS中，洗涤，离心。
7. 移弃上清液，微球重悬于lOOjil pH8.0 TE中，振荡悬起混匀，即 得到偶联好的检测微球。
8. 用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度。
9. 把偶联好的检测微球放在4'C避光保存， 一般每种探针偶联的微球 单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
8实施例2、样本核酸的提取
采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核酸。具体如下
1) 向每管样本中加入6mol/LNal lO(Hil，振荡混匀，煮沸30分钟。
2) 将上述煮沸处理的样本于10000r/分钟离心5分钟，将上清液转 至另 一含20%玻璃粉液的离心管中。
3) 充分混匀，置室温10分钟，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上 清液。
4) 向玻璃粉DNA沉淀中加入75。/。乙醇1 ml，充分混匀，洗涤玻璃 粉，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上清液。
5) 重复清洗一次后，放置于37。C恒温箱使彻底干燥。
6) 向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20nlTE，充分混匀，65°C 加热15分钟。8000r/分钟离心2分钟，回收上清液备用。
实施例3、 PCR扩增
以回收的上清液作为PCR反应的模板，PCR反应体系以及反应条件 PCR体系
10 xPCR緩沖液:
Taq酶
dNTPs:
上游引物
下游引物
模板DNA:
双蒸水ddH20:
反应条件
预变性
94°C
35个循环 94°C 58°C 72。C
3 |Lll
0.3|il 0.3|a1 O辜 0.3|iil
2|Lll
补足30pl
10分钟
30秒 30秒 40秒延伸
72°C 7分钟 同时设置PCR空白对照，如下
10xPCR緩沖液 3^1
Taq酶 0.3jil
dNTPs: 0.3jli1
上游引物 0.3|td
下游引物 0.3|xl
双蒸水ddH20: 补足30)Li1
反应结束后以1%的琼脂糖凝"交电泳4企查扩增情况。 实施例4、检测
1. 取偶联微球034号5000个混合，分装于PCR管中(根据微球计 数结果计算相应加入量)
2. 向各管中加5 ~ 17|il上面的PCR产物使其终体积为50pl。
3. 95。C变性IO分钟。
4. 45-60。C反应10~30分钟。
5. 转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物。
6. 再向各孔加75(nl 4ng/nl SA-PE,室温避光孵育IO分钟，抽滤 去掉未结合的SA-PE。
7. 再向各孔加入75|11悬浮液，振荡使微球重悬。
8. 反应结束后上枳i;险测。
9. Bio-plex检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发 微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色微球对表面结 合的焚光染料进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定 量分析。
在检测时，同时以PCR阴性对照进行检测做为检测本底。对于每个 检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球 群的焚光强度中位值(Median Fluorescence Intensity，MFI)，亦即读取的这 种编号的微球群(100个或以上)的每个微球信号强度的统计平均值。结 果判断当待检测样本孔的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时即判为阳性。
实施例5、定量检测
提取类鼻疽的基因组DNA，利用核酸蛋白分析仪测定其浓度，进行 系列稀释，PCR扩增后，同上面检测步骤进行检测，Bio-Plex Version 4.0 分析，拟合出剂量-反应曲线和曲线方程。样本检测值代入方程实现定量 检测。 结果
针对类鼻疽的检测，本发明设计了位于染色体标识序列的探针进行 检测。提取类鼻疽基因组DNA测定浓度后进行10倍系列稀释，9.6fg ~ 9.6xl06fg，按上述确定的方法进行PCR扩增和检测，拟合曲线，得出曲 线方程
探针Bp的曲线方程FI =-2.20043 + (16806.9+ 2.20043)/((1 + (Cone
从标准曲线推算检出限，本体系的检出限为0.62pg/ test。 从上述结果可以得出，本发明的悬浮芯片和检测方法具有以下优越
性
1. 灵敏较之于普通的多重PCR反应，本发明的灵敏度提高从以下 两个方面体现1)检测仪器存在信号的放大系统；2)PCR产物带上的 生物素与荧光染料藻红蛋白连接的亲和素结合的放大作用。
2. 特异采用核酸探针技术对标记上生物素的PCR产物进行特异性 的识别，而非传统的电泳方法通过PCR产物片段大小进行识别。
3. 准确高效整合核酸体外扩增、核酸分子杂交、编码微球、生物素 标记、荧光检测和流式细胞技术于一体，同时实现核酸样品的检测、鉴 定，使结果准确，工作高效。
4、 芯片制作方便只用设计好待检目标菌的引物，优化PCR条件， 标记对应的探针于编码微球，即可组装成4企测体系。
5、 本发明涉及的方法同样适用于其他病原体或目标物的核酸检测。
6、 可实现多重检测，待检目标灵活可调可根据不同检测目标，选择 对应的引物和微球，组成不同目标组合的检测体系。
权利要求
1.一种检测类鼻疽(Burkholderia pseudomallei，B.p)的基因液相芯片，该芯片包括荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白。
2. 权利要求l所述的基因液相芯片，其中所述引物包括<formula>formula see original document page 2</formula>下游引物5，端经生物素标记Bp-R: 5，-生物素曙CCCCAGTTCATCTGATACTTGC
3.权利要求1所述的基因液相芯片，其中所述捕获探针选自探针名称探针序列(5，-3，)BpAGGTCAATTTCCCGAACAAGACT上面所述探针在合成时在5'端进行氨基修饰，并且连接15-20个T 或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球进行偶联。
4. 一种制备权利要求1任一项所述的基因液相芯片的方法，该方法包括(1) 选取编码微球，取适量于离心管内，离心弃上清后，加入2-(n-吗啉代) 乙磺酸溶液使之重悬；(2) 用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针，即捕获探针Bp稀释，加至微球悬 浮液中，振荡混匀；(3 )加入10 mg/mL的EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀，室温 孵育30分钟；(4) 用0.02。/。PBST洗涤，14000g下离心；移弃上清液，将上述《效球重悬 于0.1。/。SDS中，洗涤，离心；(5) 移弃上清液，微球重悬于pH8.0TE中，振荡悬起混匀，得到偶联好的检测微球，得到所述的基因液相芯片。
5. 权利要求1-4任一项所述的类鼻疽检测基因液相芯片的检测方法， 该方法包括样^4亥酸的提取，PCR扩增，4企测病原体核酸。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述样本核酸的提取包括以下步骤1) 向每管样本中加入NaI,振荡混匀，煮沸；2) 离心，转上清液至另一含20%玻璃粉液的离心管中；3) 充分混匀，室温放置，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；离心，小心倾 去上清液；4) 向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/。乙醇，充分混匀，离心，小心倾去上 清液；5) 重复步骤4)，然后置于37。C恒温箱内干燥；6) 向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中力口 TE，充分混匀，65。C加热，离心， 回收上清液备用。
7. 权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述检测步骤包括1) 取上述偶联微球，装于PCR管中，根据微球计数结果计算相应加入量；2) 向各管中加5-17ji1上面的PCR扩增得到的产物，混匀； 3 ) 95°C变性10分钟；随后45 ~ 60。C反应10-30分钟；4) 离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；5) 再向各孔加SA-PE，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE;6) 再向各孔加入75(ilTE悬浮液，振荡使微球重悬；上检测仪器进行检测。
全文摘要
本发明涉及一种检测类鼻疽的基因液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。本发明以类鼻疽染色体标识序列为靶序列，建立了类鼻疽液相芯片和检测方法，为类鼻疽的检测提供一条可行的途径。
文档编号C12R1/01GK101560561SQ20091008026
公开日2009年10月21日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者刘衡川, 孙肖红, 宋亚军, 文海燕, 宇 杨, 静 王, 胡孔新 申请人:中国检验检疫科学研究院