专利名称：一种含有免疫球蛋白基因的载体、构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种载体，具体地涉及一种含有免疫球蛋白基因的载体及其
构建方法，并以葡激酶(staphylokinase SAK)的融合表达为例，说明该载体
在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。
背景技术：
利用DNA体外重组技术获得目的蛋白是蛋白质结构功能和生物工程医药 研究的基础。基因组学和蛋白组学研究的不断深入，极大地拓展了新型蛋白 质药物的研究领域。经过几十年的探索，外源基因在原核细胞中的高效表达 技术已经比较成熟，已有大量通过该表达的重组蛋白应用于临床。然而目前 临床上使用的第一代基因工程蛋白药物，大多数存在半衰期短、需要频繁给 药才能达到治疗效果，增加了患者治疗成本，严重降低了患者的生活质量等 问题，从某些方面来说限制了重组蛋白药物的临床应用。因此延长重组蛋白 在体内的半衰期，降低外源蛋白的免疫原性是重组蛋白药物研究需要迫切解 决的问题。
IgG (Immunoglobulin gamma)型的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白 质，它们的半衰期可长达21天，与基因工程蛋白药物相比，Fc融合蛋白具有半 衰期长、亲和力高和免疫源性低等优势。将人IgG的Fc区域与其它蛋白质(如 各种细胞因子和可溶性受体)结合形成融合蛋白以延长半衰期已有报道 (Capon DJ， Chamow SM， Mordenti J， et al. Nature, 1989， 337， 525 531; Chamow SM, Ashkenazi A， TrendsBiotechnol， 1996， 14 (2) : 52 60)，由于结 构上的同源，Fc融合蛋白表现出的体外药物代谢动力学特性与同类型的人IgG相当。这种制备融合蛋白的方法己用于一些重要的细胞因子如IL-2和IFNa-2a 和可溶性受体如TNF-Rc和L-5-Rc (Landolfi NF. US PatentNo.5349053; Sm池 CA， Goodwin RG, Beckmann MP. US PatentNo.6224867),由此制备的一些药物 已成功地使用在临床上并用于治疗一些特定疾病。据此，我们希望采用基因 工程技术制备一种能融合表达IgGFc片段的载体，以期提供高效的应用平台， 使外源基因能方便地与IgGFc片段融合，融合IgGFc片段的重组蛋白不仅具 有多肽或蛋白所特有的生物学功能，而且兼备较长血清半衰期等特性(Hodges TL, Antimicro-Agonts-Chemother, 1991， 35: 2580-2586)。
到目前为止，尚未见到利用人IgGlFc段构建融合表达载体的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有免疫球蛋白基因的载体。 本发明的目的也在于提供该载体的构建方法。 本发明的目的还在于提供一种包含该载体的转化体。 本发明的目的还在于提供该载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面 的应用。
本发明的一种含有免疫球蛋白基因的载体，包含编码免疫球蛋白IgGl Fc 片段的基因，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，该载体被命名为 pBV220/Fc。
所述编码免疫球蛋白IgGl Fc片段的基因来源于人，其核苷酸序列为SEQ ID
No. 1中的7-717bp。
本发明的转化体为含有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的载体。 所述pBV220/Fc融合表达载体具备Z力oLI、 ^a/zHI、 5aJI、历'/7c11、尸stl、
历'/7din多克隆酶切位点。所述载体的构建方法，按如下操作步骤进行
(1) 根据来源于人的IgGl基因序列，设计并合成针对上述基因序列的引物， 以来源于人的基因组或基因组文库为模板，通过PCR方法扩增目的产物；
(2) 用T4连接酶将回收后的目的产物，与pEASY-T载体连接，经转化和筛
选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定；
(3) 测序正确的连接产物和pBV220载体分别经/5boRI和Aa^I双酶切后用 L连接酶连接，经转化和筛选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定，最终获得重 组载体，命名为pBV220/Fc。
所述的引物如下 上游引物
5'-GGAATTCCATGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC-3' (SEQ ID No. 2) 下游引物
G-3' (SEQ ID No, 3)
所述下游引物中包括编码5肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头(linker) 的基因序歹!j CGATCCGCCACCGCC。
所述模板为人胎肝cDNA文库。
该载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。 利用本发明的载体表达融合蛋白能使目的蛋白的分子量增加约21kD，其
中，编码IG1 Fc的基因为1666bp，同时利用IgGl Fc蛋白形成天然的二聚体
结构，增加了整个蛋白的空间结构。体内动物实验结果表明，由IgGFc连接
的融合蛋白可以显著的延长其血浆半衰期。
5图1为从胎肝库提取的IgGlFc的PCR产物电泳图2为pEASY-T/Fc克隆的酶切鉴定电泳图3为载体pBV220和pBV220/Fc重组载体的酶切鉴定电泳1: pBV220/EcoRI+BamHI酶切；2: pBV220-Fc/EcoRI+BamHI酶切
图4为pBV220/Fc/SAK表达电泳1. 蛋白Marker;
2. pBV220/Fc/SAK/DH5 a诱导表达全菌；
3. pBV220/Fc/SAK/DH5 a诱导表达破碎上清；
4. pBV220/Fc/SAK/DH5 a诱导表达破碎沉淀； 图5为SAK及Fc-SAK蛋白溶栓活性测定；
1A， 4A重组蛋白Fc-SAK; 1B， 4B， 1C， 4C重组蛋白SAK;2， 3活性标准品
图6为SAK及Fc-SAK血药-时间曲线图7为pBV220载体示意图8为pBV220/Fc重组载体结构图9为pBV220/Fc构建流程图10为5^r基因扩增产物电泳图。
具体实施例方式
以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分 子克隆实验指南》第二版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社) 或参阅所用试剂盒的说明书。 实施l重组载体pBV220/Fc的构建
1、钓取编码人免疫球蛋白IgGl (Human Immunoglobulin gamma-l)重链恒定区 Fc片段的基因
具体方法如下根据已报道来源于人的IgGl基因序列(Genbank登录号为BC006402)，设 计合成特异性引物，钓取的Fc片段位于上述已知序列的816-1523bp位置，弓l物
如下
上游引物
g|gaattc|catggagcccaaatcttgtgacaaaactc-3，(se;q ID No. 2)
￡coR I
下游引物
5awH I G陽3' (SEQ ID No. 3)
勘l I
接头(linker)
上游引物含有五coRl酶切位点，下游引物带有编码5肽0^0^-0^-0^-
Ser柔性接头(linker)的基因，该基因编码的5个氨基酸具有疏水性和低电荷效
应，下游引物还带有lolI禾口B"mHl位点。
以人胎肝cDNA文库(购自Takara)为模板，用上述的一对引物进行PCR 扩增，引入单克隆酶切位点，获得带有接头(linker)的Fc cDNA， PCR产物 长度为796bp。
PCR反应体系如下
人胎肝库
上游引物(10umol/O 下游引物(10umol/l) 10xbuffer 2.5mmol dNTP Pyrobest高保真酶(TaKaRa) 水
PCR反应参数均为
94。C5min; 94°C 30s， 55°C 30s, 72°C 30s;
lul 2ul 2ul 5ul 4ul 0.5ul 加至50ul
72 °C 7min
30个循环
PCR产物使用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，如图1所示。将跑胶后的PCR产物使用凝胶回收试剂盒(购自北京东盛生物试剂有 限公司)进行回收。
2、含IgG Fc重组质粒的构建
回收产物与pEASY-T载体通过T4连接酶连接，转化感受态细胞DH5a，进 行蓝白斑筛选，挑取白斑在LB液体培养基中培养16小时，提质粒，使用&。RI 内切酶进行酶切鉴定，如图2所示，最后将酶切正确的克隆测序鉴定。
测序正确的质粒用限制性内切酶化oRI和v^;出I (Takara公司)进行双 酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段IGlFc， 747 bp， pBV220 载体(中国科学院病毒研究所候云德院士厚赠，结构如图7)也用上述两种酶 进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收3657 bp的载体片段，将 回收的目的基因与载体片段按3:1的比例在T4连接酶的作用下连接，然后将 连接产物转化感受态细胞DH5a，涂含有氨苄青霉素抗性的LB平板，37。C过 夜培养，挑取阳性克隆在LB液体培养基中培养16小时，提质粒，使用^boRI 和i^MH内切酶进行酶切鉴定，结果如图3所示，利用T7启动子引物对酶切 正确的重组质粒进行测序鉴定，测序公司为上海生物公司，测序正确的为 pBV220/Fc重组载体，结构图如图8所示。其中质粒DNA的提取、酶切反应、 连接反应、感受态的制备及转化等操作均参照《分子克隆实验指南》第二版， 构建载体的整个流程图如图9所示。
pBV220/Fc融合表达载体具备J力olI、万a/zin、 5^21、历'/7cII、/^tl、历'/7din 多克隆酶切位点。
实施例2以葡激酶(staphylokinase，SAK)的融合表达为例，说明该载体在延 长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用
天然葡激酶(staphylokinase， Sak)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合 成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成。葡激酶本身不具有酶活性，其可 与血栓表面的纤溶酶原hl结合形成复合物，并进一步激活纤溶系统。由于 Sak激活纤溶酶具有纤维蛋白专一性，出血倾向较低，Sak的溶栓作用并不影 响血浆中纤维蛋白原和纤溶酶原以及a 2-抗纤溶酶的水平而且对陈旧性血栓和富含血小板血栓的溶解作用比传统溶栓药物更强，因此Sak是一种很有希 望的溶栓剂。
1、 SAK克隆入重组表达载体pBV220/Fc的方法
利用上述重组表达载体pBV220/ Fc中引入的单克隆酶切位点屈oll和 ^ mffl，设计SAK相应的引物上下游分别带有^olI和&mHI酶切位点。根据已 报道的W堪因序列(Genbank登录号为GC515445)，设计合成^ 因特异性 引物，引物如下
上游引物 勘ll
G-3， (SEQ ID No. 4)
下游引物
5 ，-CG|GGATCdCTATGAGTGTACCACCATTGGAAGA-3 ， (SEQIDNo.5)
以pBV220-SAK (构建方法参照邹民吉等，军事医学科学院院刊，1998， 22 (4): 257-292)为模板，禾拥上述引物PCR扩增6^違因，扩增片段的长 度为408bp。
PCR反应体系如下
pBV220/SAK lul
上游引物(lOumol/1) 2ul
下游引物(lOumol/1) 2ul
10xbuffer 5ul
2.5mmo1 dNTP 4ul
Pyrobest高保真酶(TaKaRa) 0.5ul
水 加至50ul PCR反应参数均为
94°C 5min;^4。C 30s， 55°C 30s， 72。C 30;; 72°C 7min
30个循环
PCR产物使用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，如图10所示。扩增产物经回收后，利用限制性内切酶Z力o11和5a 出I酶切后与经相同 酶切的pBV220/Fc载体连接，制备重组质粒，转化感受态细胞DH5 a ，涂板(氨 苄青霉素抗性)，筛选阳性克隆并测序，具体操作步骤同实施例1，最终得到 重组载体pBV220/Fc/SAK。
2、 pBV220/Fc/SAK和pBV220/SAK在大肠杆菌中的表达与纯化 按CaCl2转化法将表达载体pBV220/Fc/SAK转化A co〃DH5 a 。按以下步 骤表达和纯化转化菌落经3(TC过夜活化16小时，然后以2。/。比例接种于LB 液体培养基中，3(TC培养至对数生长期(0D 6。。=0. 4 0. 6)，立即转入42。C水 浴摇床，200 rpm培养4 hr，诱导目的蛋白在￡ co7j'DH5 a中表达。诱导表 达培养物于4。C， 12，000 rpm离心15min，将沉淀重悬于1: 10 PB (100扁ol/L Na2HP04,， 100mmol/LNaH2P04)中，以超声波破碎菌体(0. 4kW功率破碎10s间 隙10s，总长40min)，离心12000卬m/min离心10min4。C，分别收取沉淀和 上清，进行15% SDS-PAGE电泳，获得30kD左右的融合蛋白，分析此蛋白在 DH5a中的表达分布情况。蛋白电泳结果如图4所示。结果表明该融合蛋白在 DH5 a中以包涵体形式表达。超声处理后得到的包涵体经2 mol/L尿素洗涤2 次，8 mol/L尿素变性溶解，所用柱子为凝胶过滤层析柱(购自Amersham Biosciences公司)，以Sephaciyl-200(S-200)为填料对溶解上清进行凝胶过滤层 析，洗脱剂为8mol/L尿素，采用15% SDS- PAGE分析各洗脱峰对应的样品纯 度。纯化的样品在复性缓冲液(100 mmol/L Na2HP04, 100 mmol/L NaH2P04， 0. 1 mmol/L GSSG ， 1 mmol/L GSH， 0. 1 % PEG)中4。C稀释复性72hr，之后 以62pg/mL PEG 6000缓慢浓縮。经Lowry法测定，得到蛋白样品浓度为 4. 25mg/nl。Lowry法原理为，蛋白质在碱性溶液中其肽键与012+鳌合，形成蛋白质一 铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件 下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线，并测定样品中蛋白 质的浓度。步骤l，用不同浓度的蛋白标准品绘制标准曲线；步骤2，稀释待 测样品至合适浓度，加入碱性铜试剂工作液，充分混匀，25'C水浴10min后 加入Folin-酚试剂，25。C水浴30min,紫外660nm测定吸光值；步骤3，根据 所测样品吸光值与标准曲线作对比，计算出样品实际浓度。
pBV220-SAK (中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所实验室保 存)在大肠杆菌中的表达与纯化步骤同pBV220/Fc/SAK，得到重组蛋白浓度 为4mg/mL。
3融合蛋白Fc-SAK的活性鉴定
使用琼脂糖-纤维蛋白平板溶圈法(Saksela O， Anal Biochem, 1981， 111: 276-282.)测定重组蛋白溶栓活性。Bradford法测定重组蛋白含量，生理盐 水将重组蛋白Fc-SAK稀释至5ug/ml后点样每孔6ul (如图5的1A， 4A)， 重组蛋白SAK稀释至5ug/ml后点样每孔6tU (如图5的1B， 4B，1C,4C)， 点样平板在黑色背景下纵横两次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数 为横坐标，以溶圈直径的平均数的对数为纵坐标，利用统计学软件中的回归 分析方法作标准曲线，根据样品的溶圈直径可以求得样品的活性。使用上述 方法测定重组蛋白Fc-SAK的溶栓活性为2.616X104AU/mg;重组蛋白SAK 的溶栓活性为2.689X104AU/mg;测定中使用的葡激酶蛋白标准品(购自中 国生物制品鉴定)如图5的2和3，其浓度从左到右依次为500AU/mL， 250AU/mL， 125AU/mL， 62.5AU/mL， 31.25AU/mL04融合蛋白Fc-SAK的半衰期分析
1) 选择雄性大耳白兔20只，分成两组，每组10只，皮下注射给药，分 别注射等量的Fc-SAK、 SAK (实施例2的纯化产物)，注射剂量为200ug/kg， 分别于注射0.25、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 8.0、 12.0小时后，经 耳缘静脉采血400pL， 1%肝素钠抗凝，血液于4。C放置10min后，5000rpm， 离心10min，收集血浆，-20°。保存，集中检测。
2) 按SAK ELISA试剂盒(购自Uscn life Science & Technology company) 说明书检测不同时间点血浆中药物浓度用Microsoft Excel 2003软件绘制血 药-时间曲线(如图6所示)，采用统计矩方法进行初步药代动力学分析；不同 蛋白间比较用Student's t-检验进行统计分析。本实验采用统计矩方法进行初步 药代动力学分析，表1中显示IgG Fc-SAK的半衰期较SAK生物半衰期得到了 显著的延长，与SAK相比延长了l倍。
表l不同时间点血浆中药物浓度
样品时间(h)SAK (pg/mL)FC-SAK(pg/mL)
0. 2550.79± 17.1845.68±15.13
0. 5305.75±21.61251.77± 19.26
1375.41 ±18.76381.63±12.56
2349.23 ±8.09330.87± 15.50
3215.56±7.87245.27±8.22
4121.41 ±9.47175.61 ±20.31
578.42± 14.53146.59± 10.83
657.29± 14.52120.14±8.39
840.56±23.3979.66 ±8.02
1225.76±7.2055.17± 19.59
参考文献
1 Capon DJ, Chamow SM， Mordenti J， et al. Designing CD4 immunoadhesins forAIDS therapy. Nature, 1989,337 (6207) : 525 531.
122Chamow SM， Ashkenazi A. Immunoadhesins: principles and applications. TrendsBiotechnol， 1996， 14 (2) : 52 60.
3 Landolfi NF. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses. US PatentNo. 5349053.
4 Smith CA， Goodwin RG， Beckmann MP. Tumor necrosis factor2 alpha and beta receptors. US PatentNo. 6224867.
5 Hodges TL. Phase I study of recombinant human CD4-immunoglobulin G therapy of patient with AIDS and AIDS-related complex. Antimicro-Agonts-Chemother， 1991， 35:2580-2586.
6 J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社， 1996.
7邹民吉，王嘉玺等，葡激酶基因的分离及其在大肠杆菌中的高效表达，军事 医学科学院院刊，1998， 22 (4): 257-292.
8 Saksela O， Radial caseinolysis in agarose: a simple method for detection of plasminogen activator in the presence of inhibitory substances and serum[J ]. Anal Biochem, 1981， 111:276-282.SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
<120> —种含有免疫球蛋白基因的载体、构建方法及其应用 <130> 34 <160> 5
<170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 4404 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223>包括来源于人编码IGlFc片段的基因的重组质粒 <400> 1
gaattcatgg agccc肌atc ttgtgac肌a actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 60
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccceccaa aacccaagga caccctcatg 120
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccetgag 180
gtcaagttca actggtacgt gg狄ggcgtg gaggtgc由atgccaagac aaagccgcgg 240
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 300
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 360
gagaa幼cca tctccaaagc c肌agggcag ccccgag肌c cacaggtgta caccctgccc 420
ccatcccggg atgagctgac caag肌ccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 480
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 540
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 600
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 660
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgagt gcgacggggc 720
ggtggcggat cgctcgaggc gggatccgga tccgtcgacc tgcagccaag cttctgtttt 780
ggcttatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag肌gcggtctg 840
ataaaacaga atttgcctcc cggeagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac 900
tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctceccatgc gagagtagcc 960
aactgceagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 1020
ctg"g"tg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag cggatttg幼 1080
cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc ccgecataaa ctgccaggca 1140
tcaaaggaat eagaaggcca tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac aaactctttg 1200
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 1260
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 1320
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 1380
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgc狄g agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 1440
cggt肌gatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgttttccaatgatga gcacttttaa 1500
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 1560
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtc狄ag a肌agcatct 1620
tacggatggc atg级c汪gtaa gagaattatg c级gtgctgcc汪taaccatga gtgataacac 1680
tgcggecaac ttacttctga caacgatcgg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 1740
acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggatctg aatgaagcca 1800taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggca级ca级cg ttgcgc汪aac 1860
tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 1920
cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 1980
ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 2040
gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 2100
gaaatagaca gatcgctgag由ggtgcct cactgatt肌gcattggtaa ctgtcagacc 2160
aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 2220
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 2280
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct tttt(tctgc 2340
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc ageggtggtt tgtttgccgg 2400
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 2460
atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcacegc 2520
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgecagtggc gataagtcgt 2580
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 2640
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagataec 2700
tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 2760
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 2820
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc aacctctgac ttgagcgtcg attttgtgat 2880
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttaeggttcc 2940
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 3000
ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 3060
gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgccctta tctttccc" tatttttgct 3120
gcggtaagtc gcataaaaac cattcttcat aattcaatcc atttaetatg ttatgttctg 3180
aggggagtga aaattcccct aattcgatga agattcttgc tc肌ttgtta tcagctatgc 3240
gccgaccaga acaccttgcc gatcagccaa acgtctcttc aggccactga ctagcgataa 3300
ctttccccac aacggaacaa ctctcattgc atgggatcat tgggtactgt gggtttagtg 3360
gttgtaaaaa cacctgaccg ctatccctga tcagtttctt gaaggtaaac tcatcacccc 3420
caagtctggc tatgcagaaa tcacctggct caacagcctg ctcagggtca acgagaatta 3480
acattccgtc aggaaagctt ggcttggagc ctgttggtgc ggtcatggaa ttaccttcaa 3540
cctcaagcca gaatgcagaa tcaCtggctt ttttggttgt gcttacccat ctctccgcat 3600
cacct"ggt aaaggttcta agcttaggtg agaacatccc tgcctgaaca tgagaaaaaa 3660
cagggt狄tc atactcactt ct肌gtgacg gctgcatact aaccgcttca t狄atctcgt 3720
agatttctct ggcgattgaa gggctaaatt cttcaacgct aactttgaga attt付geaa 3780
gc肌tgcggc gttat肌gqa ttt肌tgcat tgatgccatt肌at肌agca cc肌cgcctg 3840
actgccccat ccccatcttg tctgcgacag attcctggga taagccaagt tcatt付tct 3900
ttttttcata aattgcttta aggcgacgtg cgtcctcaag ctgctcttgt gttaatggtt 3960
tcttttttgt gctcatacgt taaatctatc accgcaaggg ataaatatct aacaccgtgc 4020
gtgttgacta ttttacctct ggcggtgata atggttgcat gt狄taagga ggttgtatgg 4080
aacaacgcat aaccctgaaa gattatgcaa tgcgctttgg gcaaaccaag acagctaaaa 4140
gatctctcac ctaccaa汪ca atgcccccct gcaaaa级at级aattcatata aaaa￡icatac 4200
agataaccat ctgcggtgat aaattatctc tggcggtgtt gacat肌ata ccactggcgg 4260
tgatactgag cacatcagca ggacgeactg accaccatga aggtgacgct cttaaaaatt 4320
aagccctgaa gaagggcagc attcaaagca g肌ggctttg gggtgtgtga tacgaaacga 4380
agcattggtt aaaaatt肌g gagg 4404
15<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223>用于扩增IGlFc基因的上游引物
<400> 2
ggaattccat ggagcccaaa tcttgtgaca a肌ctc 36
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223>用于扩增IGlFc基因的下游引物
<400> 3
taaatgagtg cgacggggcg gtggcggatc gctcgaggcg ggatcccgcc eg 52
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220> ' <223>用于扩增SAK基因的上游引物
<400> 4
etcgaggegt caagttcatt cgacaaagga aaatatagaa aaggcgatga cgegag 56
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223>用于扩增SAK基因的下游引物
<400> 5
cgggatccct atgagtgtac c狄cattgga aga 33
1权利要求
1、一种含有免疫球蛋白基因的载体，包含编码免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2、 根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述编码免疫球蛋白IgGl Fc 片段的基因来源于人。
3、 一种转化tf，其特征在于，所述转化体含有核苷酸序列如SEQ IDNo. l所 示的载体。
4、 一种含有免疫球蛋白基因的载体的构建方法，其特征在于，由如下操作步骤构成(1) 根据来源于人的IgGl基因序列，设计并合成针对上述基因序列的引物， 以来源于人的基因组或基因组文库为模板，通过PCR方法扩增目的产物；(2) 用T4连接酶将回收后的扩增产物，与pEASY-T载体连接，经转化和筛选 阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定；(3) 测序正确的连接产物和pBV220载体分别经fcoRI和"』1双酶切后用 T4连接酶连接，经转化和筛选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定，最终获得重 组载体。
5、 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的引物为 上游引物如SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No. 3所示。
6、 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述模板为人胎肝cDNA 文库。
7、 权利要求1所述的载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。
全文摘要
本发明公开了属于分子生物学领域的一种含有免疫球蛋白基因的载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明也公开了该载体的构建方法，使用该载体能显著延长重组蛋白药物在体内半衰期，从而可以延长药效、减少患者用药次数、降低成本。
文档编号C12N15/63GK101509011SQ20091008060
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者徐东刚, 王园园, 王金凤, 欣 蔡, 邹民吉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所