专利名称：一种改进的甘蔗宿根矮化病菌pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域，尤其是一种改进的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法。
背景技术：
甘蔗宿根矮化病(mtoon stuning disease，RSD)是普遍存在于所有植蔗地区
的一种世界性的重要病害。此病由一种棒杆菌属细菌(07^^""^砂//8油5 .矽//)
寄生于蔗株的维管束中引起，主要通过甘蔗种苗传播蔓延，且传播性极强。蔗株染病后变矮，蔗茎变细，生长迟滞，宿根发株少，病害造成损失的程度随宿根年数的增加而增加，一般减产10 30%，干旱缺水时可达60%以上，还可导致品种退化。由于甘蔗(RSD)无明显的外部和内部症状，传统诊断方法极其困难，导致病害任意传播、扩展蔓延，对甘蔗生产危害极大。防止该病害的发生和蔓延，最经济有效的措施就是种植脱毒种苗，随着甘蔗健康种苗在甘庶生产上的运用，迫切需要建立起一种能快速、稳定、准确、高灵敏度、特异性强检观!lRSD的方法。
目前我国对甘蔗宿根矮化病菌的检测方法主要有电镜负染检测法(EM)、血清检测法(包括间接酶联免疫吸附法及组织斑点免疫检测法)和PCR检测法。但电镜负染检测需要昂贵的仪器，不适合田间大批量样品的检测；血清检测法灵敏度高，但RSD难于人工分离、纯化、培养，所以制备高纯度抗体成为此项技术应用的瓶颈；而目前应用于RSD的PCR检测技术主要是用常规的CTAB法抽提DNA或病菌快速裂解法释放DNA后再PCR扩增，虽然快速、但由于抽提或裂解释放的总DNA含量低，所以检测灵敏度低、实验体系不易稳定。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、稳定、准确、高灵敏度、特异性强的甘蔗
宿根矮化病菌PCR检测方法，以克服现有检测技术中的缺点。
本发明包括以下步骤1、引物设计根据已报道的RSD病原细菌Lxx 16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计了一对特异引物Lxxl/Lxx2，扩增的目的片段大小为438bp，引物序列如下Lxxl: 5'-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3'，Lxx2: 5'-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3;
2、 样品蔗汁采集
每个样本随机取6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成7cm左右长，再用钳子挤压25ml左右的甘蔗汁于50ml离心管内混匀，放于-20"C冰箱保存待用。
3、 蔗汁总DNA提取
(1) 蔗汁DNA提取前，每样品取2000ul蔗汁放入离心管中，12000rpm超速离心机上离心10min，弃上清，沉淀加入300ul灭菌去离子水稀释混匀；
(2) 蔗汁DNA提取时，加入600ul经65〃C预热的2^CTAB抽提缓冲液，65"C水浴lhr，期间每隔20min摇匀一次；
(3) 加入600 ul氯仿/异戊醇(24: 1)剧烈振荡30s, 12000rpm超速离心机上离心10min;
(4) 取上清液700ul置于新的1. 5ml离心管中，加入等体积氯仿异戊醇=24:1，温和地混匀，12000rpm超速离心机上离心10min;
(5) 取上清液650ul置于新的1. 5ml离心管中，加入2 / 3体积(455ul)的异丙醇，混匀后置于-2(TC冰箱中沉淀4小时；
(6) 4。C下12000rpm超速离心机上离心10min，弃上清；
(7) 沉淀分别用400ul冷70X乙醇和冷无水乙醇各洗一次，室温下风干；
(8) 沉淀用30ul灭菌去离子水稀释溶解-20〃C保存备用。
4、 PCR扩增
在PCR管中按序加入以下试剂
ddH20 8.6ul2xPCRTaqmix 8ulLxxl (20umol/L) 0.2ulLxx2(20umol/L) 0.2ul
DNA模板 3.0ul加完后短速离心IO秒后放进PCR仪，95'C预变性5mi， 94'C变性30s， 56°C退火30s， 72'C延伸lmin， 35个循环后72'C延伸5min， 4匸保存；5、电泳检测
取10ul PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶，胶里预先加入0. 5%的0. 5ug/ml溴化乙锭，在0. 5XTBE和140V的电压下电泳20min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗样品中扩增到438bp的条带。
该发明的有益效果是克服了现有检测技术中的缺点，改进了蔗汁总DNA的提取方法，提供了一种快速、稳定、准确、高灵敏度、特异性强的甘庶宿根矮化病菌PCR检测方法，适合田间大批量样品检测。
具体实施例方式
1、 引物设计
根据已报道的RSD病原细菌Lxx 16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计了一对特异引物Lxxl/Lxx2，扩增的目的片段大小为438bp，引物序列如下Lxxl: 5'-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3'Lxx2: 5'-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3
2、 样品蔗汁采集
每个样本随机取6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成7cm左右长，再用钳子挤压25ml左右的甘蔗汁于50ml离心管内混匀，放于-20°C冰箱保存待用。
3、 蔗汁总DNA提取
(1) 每样品取2000ul蔗汁放入离心管中，12000rpm超速离心机上离心10min，弃上清；
(2) 沉淀加入300ul灭菌去离子水稀释混匀，加入600ul经65〃C预热的2XCTAB抽提缓冲液，65。C水浴lhr，期间每隔20min摇匀一次；
(3) 加入600 ul氯仿/异戊醇(24: 1)剧烈振荡30s， 12000卬m超速离心机上离心10min'，
(4) 取上清液700ul置于新的1. 5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:l)温和地混匀，12， OOOrpm超速离心机上离心lOmin;
(5) 取上清液650ul置于新的1. 5ml离心管中，加入2 / 3体积(S卩455ul)的异丙醇，混匀后置于-2CTC冰箱中沉淀4小时；
(6) 4"C下12000rpm超速离心机上离心10min，弃上清；
(7) 沉淀分别用400ul冷70X乙醇和冷无水乙醇各洗一次，室温下风干；
(8) 沉淀用30ul灭菌去离子水稀释溶解-20"C保存备用。
4、 PCR扩增
在PCR管里加进2 X PCR Taq mix 8.0ul， Lxxl (20umol/L) 0.2ul, Lxx2 (20umol/L)0.2ul， DNA模板3.0ul , ddH20 8.6ul ，加完后短速离心10秒后放进PCR仪，95。C预变性5min， 94""C变性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin， 35个循环后72。C延伸5min， 4'C保存。
5、 电泳检测
取10ul PCR产物经1. 5°/。琼脂糖凝胶(胶里预先加入0. 5%的0. 5ug/ml溴化乙锭)在0. 5XTBE和140V的电压下电泳20min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗样品中扩增到438bp的条带。未感染的甘蔗样品中则未扩增出条带。
权利要求
1、一种改进的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤1)引物设计根据已报道的RSD病原细菌Lxx 16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计了一对特异引物Lxx1/Lxx2，扩增的目的片段大小为438bp，引物序列如下Lxx15′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′，Lxx25′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3；2)样品蔗汁采集每个样本随机取6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成7cm左右长，再用钳子挤压25ml左右的甘蔗汁于50ml离心管内混匀，放于-20℃冰箱保存待用，每取一个样品后砍刀和钳子均要用清水冲洗后再用70％的酒精消毒；3)蔗汁总DNA提取(1)蔗汁DNA提取前，每一样品取2000ul蔗汁放入离心管中，12000rpm超速离心机上离心10min，弃上清，沉淀加入300ul灭菌去离子水稀释；(2)蔗汁DNA提取时，加入600ul经65″C预热的2％CTAB抽提缓冲液，65℃水浴1hr，期间每隔20min摇匀一次；(3)加入600ul氯仿/异戊醇(24∶1)剧烈振荡30S，12000rpm超速离心机上离心10min；(4)取上清液700ul置于新的1.5ml离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇＝24∶1，混匀，12000rpm超速离心机上离心10min；(5)取上清液650ul置于新的1.5ml离心管中，加入455ul的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱中沉淀4小时；(6)4℃下12000rpm超速离心机上离心10min，弃上清；(7)沉淀分别用400ul冷70％乙醇和冷无水乙醇各洗一次，室温下风干；(8)沉淀用30ul灭菌去离子水稀释溶解-20″C保存备用；4)PCR扩增在PCR管中按序加入以下试剂ddH2O 8.6ul2×PCR Taq mix8ulLxx1(20umol/L)0.2ulLxx2(20umol/L)0.2ulDNA模板3.0ul加完后短速离心10秒后放进PCR仪，95℃预变性5mi，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸5min，4℃保存；5)电泳检测取10ul PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶检测，胶里预先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙锭，在0.5×TBE和140V的电压下电泳20min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗样品中扩增到438bp的条带。
2、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，其特征在于 DNA提取前，取样品蔗汁2000ul 12000rpm离心10min弃上清后，沉淀加300ul 灭菌去离子水稀释。
3、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，其特征在于蔗 汁DNA提取时加入2%CTAB抽提缓冲液后，65。C水浴lhr。
4、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，其特征在于蔗汁 DNA提取时加入异丙醇混匀后-2CTC冰箱中沉淀4 hr。
5、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，其特征在于 PCR扩增中的退火温度为56°C。
6、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，其特征在于 PCR扩增中循环数为35次。
7、 根据权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，其特征在于电泳 检测时琼脂糖凝胶浓度为l. 5%。
全文摘要
本发明提供一种改进的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法，根据RSD病原细菌Lxx 16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计了一对特异引物Lxx1/Lxx2，用改进法提取蔗汁总DNA后，采用PCR扩增的方法，检测甘蔗宿根矮化病菌；该方法克服了现有检测技术中的缺点，提供了一种快速、稳定、准确、高灵敏度、特异性强的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测方法。
文档编号C12Q1/68GK101633956SQ20091009487
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月26日 优先权日2009年8月26日
发明者卢文洁, 李文凤, 王晓燕, 罗志明, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所