专利名称：甘蔗杆状病毒检测方法
技术领域：
本发明植物保护领域，具体是一种甘蔗杆状病毒检测方法。
背景技术：
甘蔗杆状病毒(Sugarcane Bacilliform virus, SCBV)是近年来新发生的一种传 播很快的病毒病害，主要通过糖粉蚧(Saccharicoccus sacchari)和无性繁殖材料类种质 传播。由于甘蔗种苗及育种材料在世界范围内广泛交流，现SCBV已扩散到世界上多个甘蔗 种植区如古巴、如澳大利亚、马达加斯、马拉斯、毛里求斯、南美洲、美国、马德里、摩洛哥、留 尼汪、巴布亚新、几内亚等国，以及我国的台湾、广东、广西；虽然到目前为止，该病毒对甘蔗 生产影响的研究报道还不多见，但建立该病毒的快速检测方法是阻击此危险性病毒扩散的 重要措施。指示植物法、电镜技术或酶联免疫技术是常用的检测病毒的方法。由于SCBV症状 表现不稳定，病株在一定条件下可隐症，且难于通过机械摩擦传毒，故利用指示植物症状进 行检测难度大；免疫电镜技术能直观的观察到病毒粒子，诊断比较可靠，但仪器昂贵、检测 速度慢、程序繁琐；酶联免疫法虽然具有较高的额灵敏度，但制备高纯度的抗体复杂繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、灵敏、特异检测的甘蔗杆状病毒检测方法，以克服 现有检测技术中存在的不足。本发明的这种甘蔗杆状病毒检测方法包括以下步骤1、引物设计根据GenBank数据库中已报道的甘蔗杆状病毒基因组序列的保守序列(序列登录 号AJ277091和M89923)设计了扩增甘蔗杆状病毒的特异性引物PC1/PC2，扩增的目的片段 大小为589bp，引物序列如下PCl 5' -ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3‘PC2 5' -TCACCTTGCCAACCTTCATA-3‘2、甘蔗叶组织总DNA抽提(1)称取0. 5g甘蔗叶片放入研钵中，加适量液氮研磨至粉状后转至2ml离心管 中；(2)在装有研磨物的离心管中加入800ul 65°C预热的CTAB抽提液，倒置混勻后放 入65°C恒温浴锅中温育2hr，中间每隔20min颠倒离心管数次；(3)取出装有研磨物和CTAB抽提液的离心管置_20°C冷却2min ；(4)加入600ul氯仿异戊醇(24 1)，充分混勻后室温静置30s, 12000rpm/min 离心6min ；(5)取上清液500ul加入2/3体积(340ul)的异丙醇，轻轻混勻；_20°C沉淀2hr ；(6)室温下 8000rpm/min 离心 6min ；
(7)弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温风干(8)沉淀用IOOul灭菌去离子水溶解，-20°C保存备用。3、PCR 扩增在PCR 管里力口进 2 XPCR Taq mix IOul，PCl (20umol/L) 0. 2ul, PC2(20umol/ L) 0. 2ul，DNA模板2. 0ul,ddH20 7. 6ul，加完后短速离心8 10秒后放进PCR仪，94°C预变 性2min, 94°C变性30s, 50°C退火30s, 72°C延伸Imin，30个循环后72°C延伸5min, 4°C保存。4、电泳检测取IOul PCR产物点进1. 0%琼脂糖凝胶胶孔里(凝胶里预先加入0. 5%的0. 5ug/ ml溴化乙锭)，在0. 5 X TBE和140V的电压下电泳20min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察， 在感染甘蔗杆状病毒的蔗株中扩增到589bp的条带，未感染的蔗株则未扩增出条带。该发明的有益效果是根据甘蔗杆状病毒基因组序列设计的特异性引物PC1/PC2， 提取甘蔗叶组织的总DNA，采用PCR扩增的方法，检测甘蔗杆状病毒，克服了现有检测技术 中的缺点，提供了一种快速、灵敏、特异检测甘蔗杆状病毒SCBV的方法。
具体实施例方式1、引物设计根据GenBank数据库中已报道的甘蔗杆状病毒基因组序列的保守序列(序列登录 号AJ277091和M89923)设计了扩增甘蔗杆状病毒的特异性引物PC1/PC2，扩增目的片段为 大小为589bp，引物序列如下PCl 5' -ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3‘PC2 5' -TCACCTTGCCAACCTTCATA-3‘2、甘蔗叶组织总DNA抽提(1)称取0. 5g甘蔗叶片放入研钵中，加适量液氮研磨至粉状后转至2ml离心管 中；(2)在装有研磨物的离心管中加入800ul 65°C预热的CTAB抽提液，倒置混勻后放 入65°C恒温浴锅中温育2hr，中间每隔20min颠倒离心管数次；(3)取出装有研磨物和CTAB抽提液的离心管置_20°C冷却2min ；(4)加入600ul氯仿异戊醇(24 1)，充分混勻后室温静置30s, 12000rpm/min 离心6min ；(5)取上清液500ul加入2/3体积(340ul)的异丙醇，轻轻混勻；_20°C沉淀2hr ；(6)室温下 8000rpm/min 离心 6min ；(7)弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，室温风干(8)沉淀用IOOul灭菌去离子水溶解，-20°C保存备用。3、PCR 扩增在PCR 管里力口进 2 XPCR Taq mix IOul，PCl (20umol/L) 0. 2ul, PC2(20umol/ L) 0. 2ul，DNA模板2. 0ul,ddH20 7. 6ul，加完后短速离心8 10秒后放进PCR仪，94°C预变 性2min, 94°C变性30s, 50°C退火30s, 72°C延伸Imin，30个循环后72°C延伸5min, 4°C保存。4、电泳检测取IOul PCR产物点入1. 0%琼脂糖凝胶胶孔里(凝胶里预先加入0. 5%的0. 5ug/
4ml溴化乙锭)，在0. 5 X TBE和140V的电压下电泳20min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察 在感染甘蔗杆状病毒的蔗株中扩增到589bp的条带，未感染的蔗株则未扩增出条带。
上述的 CTAB 抽提液为IOOmmol/L TrisHCl pH8. 0 ； 20mmol/L EDTA ρΗ8· 0 ； 1. 4mol/L NaCl ；2% CTAB pH8. 0。
权利要求
一种甘蔗杆状病毒检测方法，其特在于包括以下步骤(1)引物设计根据GenBank数据库中已报道的甘蔗杆状病毒基因组序列的保守序列(序列登录号AJ277091和M89923)设计了扩增甘蔗杆状病毒的特异性引物PC1/PC2，扩增的目的片段大小为589bp，引物序列如下PC1 5′ ACCAGATCCGAGATTACAGAAG 3′PC2 5′ TCACCTTGCCAACCTTCATA 3′(2)甘蔗叶组织总DNA抽提①取0.5g甘蔗叶片放入研钵中，加适量液氮研磨至粉状后转至2ml离心管中；②在装有研磨物的离心管中加入800ul 65℃预热的CTAB抽提液，倒置混匀后放入65℃恒温浴锅中温育2hr，中间每隔20min颠倒离心管数次；③取出装有研磨物和CTAB抽提液的离心管置 20℃冷却2min；④加入600ul氯仿∶异戊醇＝24∶1混合液，充分混匀后室温静置30s，12000rpm/min离心6min；⑤取上清液500ul加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀； 20℃沉淀2hr；⑥室温下8000rpm/min离心6min；⑦弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，室温风干；⑧沉淀用100ul灭菌去离子水溶解， 20℃保存备用；(3)PCR扩增在PCR管中按序加入以下试剂ddH2O7.6ul2×PCRTaq mix10ulPC1(20umol/L)0.2ulPC2(20umol/L)0.2ulDNA模板 2.0ul加完后短速离心8～10秒后放进PCR仪，94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸5min，4℃保存；(4)电泳检测取10ul PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶，凝胶里预先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙锭，在0.5×TBE和140V的电压下电泳20min后，用BIO RAD凝胶成像系统观察；在感染甘蔗杆状病毒的蔗株中扩增到589bp的条带。
2.根据权利要求1所述的甘蔗杆状病毒检测方法，其特征在于CTAB抽提液为 IOOmmol/L TrisHCl pH8. 0 ；20mmol/L EDTA pH8. 0 ；1. 4mol/L NaCl ；2% CTABpH8. 0。
全文摘要
一种甘蔗杆状病毒检测方法，根据甘蔗杆状病毒基因组序列设计的特异性引物PC1/PC2，提取甘蔗叶组织的总DNA后，采用PCR扩增的方法，检测甘蔗杆状病毒，该方法克服了现有检测技术中的缺点，提供了一种快速、灵敏、特异检测甘蔗杆状病毒的方法。
文档编号C12Q1/70GK101906481SQ20091009488
公开日2010年12月8日 申请日期2009年8月26日 优先权日2009年8月26日
发明者卢文洁, 尹兴祥, 李文凤, 王晓燕, 罗志明, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所