专利名称：一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明于农作物病害检测鉴定及植物检疫的领域，更具体涉及一种大豆疫霉根腐病菌分子检测弓I物及其检测试剂盒。
背景技术：
由大豆疫霉根腐病菌(尸Ajto/7totora w/"e)引起的大豆疫霉根腐病是一种毁灭性的土传病害，在我国被列为I类外检对象，该病于1991年首次在我国黑龙江省发现，此后呈逐年扩大的趋势，福建省1997年在漳州地区发现大豆疫病，2002年在漳州地区分离到了大豆疫病菌，目前该病害己对我国大豆生产构成了威胁。大豆疫霉根腐病是一种土传病害，病原菌可以经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，而且其侵染能力强，由其引起的病害多属于多循环病害，在较短的时间内可造成植株死亡。因此，开展大豆疫霉根腐病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对大豆疫霉根腐病的传播与控制具有重要意义。
自从发现大豆疫霉根腐病菌以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究，传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，从而确定是否存在大豆疫霉根腐病菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由大豆疫霉根腐病菌引起的病害。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期及海关进出境快速检测和鉴定的需求，因此传统病原学检测方法己不能满足现代植物病理学研究的需要。
现在部分病原菌免疫血清学鉴定方法已经建立，但是特异性较差，常常受到相似种的干扰，也受到抗血清质量的影响，血清学检测结果的准确性取决于抗血清的质量。单克隆抗体的专化性太强，主要用于流行学中检测菌系，通常将多种单克隆抗体混合使用，以消除过度专化的问题。目前认为在检测应用方面，多克隆抗体要优于单抗，而多克隆抗体又易与亲缘关系相近的细菌发生交叉反应。因此，常规血清学方法的应用受到了一定的限制。随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对大豆疫霉根腐病菌的分子检测开展研究，但是由于ITS在病原菌的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物将两个相似性高的种区分开具有较大难度。目前国内外学者利用基于ITS碱基序列设计引物对大豆疫霉根腐病菌的分子检测特异性较差，经常出现假阳性的现象，主要是由于设计引物时没有充分考虑引物序列在近缘种之间的差异。因此要对大豆疫霉根腐病菌进行高特异性检测，从疫霉菌ITS碱基序列设计高特异引物是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是是提供一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒，针对il有技术中大豆疫霉根腐病菌的生物学检测方法所需周期长、目前大豆疫霉根腐病菌分子检测方法特异性差，灵敏度低的问题，通过测定大豆疫霉根腐病菌及其它疫霉菌的ITS碱基序列，并进行多重比对分析，针对大豆疫霉根腐病菌的ITS碱基特异序列设计出了一对高特异引物，用于带大豆疫霉根腐病菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，并提供一种结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的大豆疫霉根腐病菌的快速分子检测试剂盒，该试剂盒可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，对于大豆疫霉根腐病菌引起病害显症之前的早期监测及海关进出境大豆所携带大豆疫霉根腐病菌高灵敏度快速分子检测和鉴定具有十分重要的意义。
本发明的豆疫霉根腐病菌分子检测的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为上游引物PSDll (18 bp): 5' TGAGGTGTCTTGCGGCGT 3'下游引物PSD12 (19 bp ): 5'~ AATTGAGATGCCACCTCCG ~3 '。
该大豆疫霉根腐病菌分子检测引物的快速分子检测试剂盒包括
管 号名称浓度
1超纯水d.d.H20299% (重量浓度)
2PCR缓冲液10x
3MgCl25mM
4■Ps10mM
5Taq聚合酶5U/[il
6阳性对照DNAlOOng/^il
7二甲基亚砜(DMSO)299.5% (重量浓度)
8上游引物PSDll20pmol/|al
9下游引物PSD1220pmol/jil
PCR扩增反应采'用25^1体系，其中10x PCR buffer 2.5^1;MgCl2(5mM) 2.5nl;dNTPs (10mM) 2单PSD11 (20pmol/nl) 0.2jil;PSD 12 (20pmol4U) 0.2pl;
Taq聚合酶 0.2^1;
模板DNA (5ng/nl) l.O)il;
DMSO 0，
d.d.H20 15.90^1
PCR扩增程序为94。C变性5min; 94。C变性lmin， 68。C退火30sec, 72。C延伸lmin， 35 个循环；最后72'C延伸10min。
上述大豆疫霉根腐病菌特异分子检测试剂盒体系的建立
(1 )从被所述大豆疫霉根腐病菌感染的植物组织中或存在大豆疫霉根腐病菌的土壤样品 中分离DNA;
(2) PCR扩增PCR反应体系25nl，包括2.5^110xPCR反应缓冲液，5mM MgCl22.5^1， 10mM dNTPs 2.0^11 ， l.OU Taq DNA聚合酶，20praol/nl引物PSD11/PSD12各0.2^1，重量浓 度99.5% DMSO 0.5pil和10ng模板DNA,， d.d.H20补足25pl。 PCR扩增程序为94。C变性 5min; 94。C变性lmin， 68。C退火30sec， 72'C延伸lmin， 35个循环，最后72。C延伸10min。
① 当在用于植物组织中存在大豆疫霉根腐病菌时，采用CTAB法提取大豆疫霉根腐病菌 的DNA，按如下的PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行PCR扩增PCR反应体 系25nl，包括2.5nl 10xPCR反应缓冲液，5mM MgCl2 2.5^1， lOmM dNTPs 2.0pl， l.OU Taq DNA 聚合酶，20pmol/pl引物PSD11/ PSD12各0,2nl，重量浓度99.5% DMSO 0.5)il和lOng模板 DNA， d.d.H20补足25jJ。 PCR扩增程序为94"C变性5min; 94。C变性lmin， 68'C退火30sec， 72'C延伸lmin， 35个循环，最后72。C延伸10min。
② 当在土壤样品中存在大豆疫霉根腐病菌条件下，采用土壤DNA提取法(具体操作见实 施例3)提取土壤中大豆疫霉根腐病菌的DNA，按如下的PCR反应体系和反应条件用所设计 的引物进行PCR扩增PCR反应体系25nl，包括2.5^1 10xPCR反应缓冲液，5mM MgCl2 2.5W， 10mM dNTPs 2.0nl， 1.0U Taq DNA聚合酶，20pmol/nl引物PSD11/PSD12各0.2nl，重量浓 度99.5% DMSO 0.5^1和10ng模板DNA，， d.d.H20补足25^1。 PCR扩增程序为94'C变性 5min; 94。C变性lmin， 68。C退火30sec， 72。C延伸lmin， 35个循环，最后72'C延伸10min。
(3) 然后将8WPCR产物用l，/。琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据 扩增产物的大小判定结果。
(4) 如果能特异性地扩增出382bp产物时，即可判断所述的植株组织或土壤样品中存在 大豆疫霉根腐病菌否则所述的植株组织或土壤样品中未存在大豆疫霉根腐病菌。
本发明的关键技术是大豆疫霉根腐病菌的高效特异扩增引物序列及其扩增方法。为了获
7得大豆疫霉根腐病菌的特异引物序列，本发明以我国福建、黑龙江等省和国外的大豆疫霉根 腐病菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌 株基因组DNA，具体方法如下取50tng冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入卯O(il 重量浓度2% CTAB(十六垸基三甲基溴化铵)提取液(重量浓度重量浓度2% CTAB; 100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0; 20mmol/L EDTA，pH8.0; 1.4 mol/L NaCl)禾卩90^1重量浓度10% SDS (十二垸基苯磺酸钠)后振荡混匀，于55 60。C水浴1.5 h，每10 min颠倒混匀一次，水浴 1.5h后离心(12,000rpm) 15min，取上清液加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述 混合溶液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 : 24 : 1，离心(12,000rpm)5 min，取上清液(水 相)，加入等体积氯仿抽提一次(12，000rpm离心5min)，吸上清液，加0.1体积的3mol/LNaAC 溶液和2体积的—20'C无水乙醇，—2(TC下沉淀30min后12，000rpm离心5 min,轻轻地倒去 上清液，加入700pl—2(TC体积浓度70n/。乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台 上自然晾干无酒精味后用lxTE (10mmol/LTris-HCL, 0.1mmol/LEDTA， pH8.0)溶液进行溶 解(TE中含5pg^L RNase)，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至 50ng4U待用。在大豆疫霉根腐病菌特异DNA片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计 特异引物，经对供试菌株和大豆疫霉根腐病菌的特异性进行PCR验证(PCR反应体系25^1， 包括2.5(al 10xPCR反应缓冲液，5mMMgCl2 2.5^11, 10mM dNTPs 2.0^1, l.OUTaqDNA聚合 酶，2Opmol4d引物PSD11/ PSD12各0.2pl，重量浓度99.5% DMSO 0.5^1和10ng模板DNA,, d.d.H20补足25^1， PCR扩增程序为94。C变性5min; 94。C变性lmin, 68r退火30sec， 72°C 延伸lmin， 35个循环，最后72。C延伸10min，此特异引物在大豆疫霉根腐病菌上特异性地 扩增出382bp的产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植物组织和土样中大豆疫霉根 腐病菌快速可靠的检测和鉴定。
本发明有益效果本发明方法适用于土样和植物组织中大豆疫霉根腐病菌的快速可靠检 测和鉴定，对于农业生产中大豆疫霉根腐病菌引起的病害防治及海关进出境大豆所携带大豆 疫霉根腐病菌高灵敏度快速分子检测和鉴定具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比， 具有以下的技术优势和积极效果
1、 特异性强本发明检测方法是利用大豆疫霉根腐病菌的rDNA基因具有种内保守、种 间变异的特点，根据多变性特异序列设计引物进行检测。已经对源于来自我国福建、黑龙江 等省及国外不同地区的大豆疫霉根腐病菌和疫霉菌近缘种及其它卵菌的验证，结果具有很强 的特异性；
2、 实用性好本发明所设计出的一对特异性引物，可用于带大豆疫霉根腐病菌的植物组 织和土壤的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌土壤和发病植物组织中存在的大豆疫霉根腐病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；
3、操作简便快速应用本发明方法，对带大豆疫霉根腐病菌的土样和植物组织进行病菌 DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切 酶酶切。 一般整个检测过程可在8小吋内完成。
图1为本发明所要检测的大豆疫霉根腐病菌的特异PCR扩增图。
图中泳道M为100bp ladder分子量marker,泳道1为阳性对照，泳道2阴性对照，泳 道3-5为福建省分离的大豆疫霉根腐病菌，泳道6、 7为黑龙江省分离的大豆疫霉根腐病菌， 泳道8、 9为国外的大豆疫霉根腐病菌。
图2为本发明对发病组织和带菌土壤的检测结果图。
图中泳道M为2000bp分子量marker,泳道1为阳性对照，泳道2阴性对照，泳道3、 4、 5为发病的植物组织，泳道6、 7、 8为带菌土壤。
具体实施例方式
本发明的技术内容包括大豆疫霉根腐病菌的特异检测引物，所设计的引物及其序列为 上游引物PSDll (18 bp): 5' TGAGGTGTCTTGCGGCGT 3' 下游引物PSD12 (19bp): 5' AATTGAGATGCCACCTCCG 3' 利用该引物可从大豆疫霉根腐病菌中特异扩增出382bp的产物。
以下结合实施例具体阐述本发明
实施例l:引物对大豆疫霉根腐病菌的特异性扩增
1. 大豆疫霉根腐病菌的特异检测
PCR反应体系25^,包括2.5^1 10xPCR反应缓冲液，5mM MgCl2 2.5jal， 10mM dNTPs 2.(^1， l.OU Taq DNA聚合酶，20pmol/nl引物PSD11/ PSD12各0.2^1，重量浓度99.5% DMSO 0.5^1和10ng模板DNA,， d.d.H20补足25^1。 PCR扩增程序为94。C变性5min; 94。C变性 lmin， 68。C退火30sec, 72。C延伸lmin， 35个循环，最后72。C延伸10min。
2. 检测结果
检测的特异性除了来自我国福建、黑龙江等省及国外的大豆疫霉根腐病菌DNA可特异 地扩增出382 bp的产物外，检测了卵菌的其它13种疫霉种、霜霉菌、腐霉菌及其它的真菌 和细菌等菌株DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性。 实施例2:发病植物组织中大豆疫霉根腐病菌的检测。
1. 样品采集植物组织样品采自福建省龙海市榜山镇大豆蔬菜基地
2. DNA提取及检测
9发病植物组织采用CTAB法提取DNA，按上述试剂盒实施的方法进行PCR扩增，PCR 反应体系25pl，包括2.5(al 10xpCR反应缓冲液，5mM MgCl2 2.5|il， 10mM dNTPs 2.0|xl， 1.0U Taq DNA聚合酶，20pmol/nl引物PSD11/ PSD 12各0.2pl，重量浓度99.5% DMSO 0.5pl和lOng 模板DNA,， d.d.H20补足25pl。 PCR扩增程序为94。C变性5min; 94。C变性lmin， 68。C退 火30sec， 72'C延伸lmin， 35个循环，最后72。C延伸10min。电泳检测扩增产物。
3.检测结果
结果见图2，见到一条清晰的分子量为382bp的特异条带，因而判断发病组织感染大豆疫 霉根腐病菌。
实施例3: 土壤样品中大豆疫霉根腐病菌的检测。
1. 样品采集土壤样品采自福建省龙海市浮宫镇大豆蔬菜基地
2. DNA提取及检测
(1) 从发病土壤样品中提取DNA:
取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细 粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500 ^重量浓度0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000 rpm离心15min。取上清加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10ng/ml蛋白酶K， 55°C 水浴l-3h。水浴结束后，加入1/2体积的7.5MNH4AC溶液，上下颠倒混匀。12000 rpm离 心15min。吸上清加2倍体积无水乙醇-20。C沉淀(沉淀时间1.5h)。沉淀结束后，12000 rpm 离心15min。用体积浓度70%乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用10 pl lxTE (或无菌超纯水)溶解，-2(TC保存备用。
(2) 大豆疫霉根腐病菌的PCR检测
按上述方法进行PCR扩增，PCR反应体系25pi1，包括2.5pl 10xPCR反应缓冲液，5mM MgCl2 2.5(il， 10mM dNTPs 2.0nl， l,OU Taq DNA聚合酶，20pmol4U引物PSD11/PSD12各0.2(il， 重量浓度99.5% DMSO 0.5nl和10ng模板DNA,， d.d.H20补足25pl。 PCR扩增程序为94。C 变性5min;94。C变性lmin，68。C退火30sec，72'C延伸lmin，35个循环，最后72。C延伸10min。 电泳检测扩增产物。
3. 检测结果
结果见图2，见到一条清晰的分子量为382bp的特异条带，判断土壤样品存在大豆疫霉根 腐病菌。序列表
<110>福建省农业科学院植物保护研究所
<120>—种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒
<160>2
<210> 1
<211> 18
<212>DNA
<213>大豆疫霉根腐病菌(尸/^o/ /^wasq/ae)
<220>
<400> 1
5'~ tgag卿cttgcggcgt ~ 3'
<210>2 <211> 19 <212> DNA
<213>大豆疫霉根腐病菌(尸/^fop/^/wraray"e)
<220〉
<400> 2
5'~ aattgagatgccacctccg ~3'
权利要求
1. 一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于所述大豆疫霉根腐病菌分子检测的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为上游引物PSD11(18bp)5′～TGAGGTGTCTTGCGGCGT～3′下游引物PSD12(19bp)5′～AATTGAGATGCCACCTCCG～3′。
2. 根据权利要求l所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于所述大豆疫霉根腐 病菌分子检测引物PSDll和PSD12在大豆疫霉根腐病菌上特异性地扩增出382bp的产物。
3. 根据权利要求1所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物的序列获得方法为大豆疫霉根腐病菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下 取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900一重量浓度2%十六烷基三甲 基溴化铵CTAB提取液和9(V1重量浓度10%十二垸基苯磺酸钠SDS后振荡混匀，于55 60'C水洛1.5 h,每10 min颠倒混匀一次，水浴1.5h后离心15min，离心速度为12,000rpm，取上清液加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚氯仿异戊醇的体积比为25:24:1，离心5min，离心速度为12,000rpm，取上清液，即水相，加入等 体积氯仿抽提一次，离心5min,离心速度为12，000rpm，吸上清液，加0.1体积的3mol/L NaAC溶液和2体积的—2(TC无水乙醇，—20'C下沉淀30min后12，000rpra离心5 min，轻 轻地倒去上清液，加入700^1体积浓度70。/。的一2(TC乙醇进行洗涤，在超净工作台上自 然晾干无酒精味后用lxTE(溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA 浓度并稀释至50ng^U待用，在大豆疫霉根腐病菌特异DNA片段序列的基础上应用 ClustalX软件比对设计特异引物，获得大豆疫霉根腐病菌分子检测引物序列，经对供试菌 株和大豆疫霉根腐病菌的特异性进行PCR验证，所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物 在大豆疫霉根腐病菌上特异性地扩增出382bp的产物。
4. 根据权利要求3所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，'其特征在于所述十六烷基三甲 基溴化铵CTAB提取液为重量浓度2。/。CTAB; 100 m mol/L Tris-HCl， PH 8.0; 20mmol/L EDTA， pH8.0; 1.4mol/LNaC。
5. 根据权利要求3所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于所述lxTE溶液为 10mmol/LTris-HCL， 0.1腿ol/LEDTA， pH8.0,其中TE中含5 ng^L RNase。
6. 根据权利要求3所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物，其特征在于所述经对供试菌株 和大豆疫霉根腐病菌的特异性进行PCR验证的具体的反应体系是PCR反应体系25til， 包括2.5nl 10xPCR反应缓冲液，5mMMgCl22.5nl， 10mM dNTPs 2.0^1， l.OUTaqDNA聚 合酶，20pmol/nl引物PSD11/ PSD12各0.2nl，重量浓度99.5% DMSO 0.5^1和10ng模板DNA， d.d.H20补足25pl; PCR扩增程序为94。C变性5min; 94'C变性lmin， 68。C退火 30sec， 72'C延伸lmin， 35个循环，最后72。C延伸10min。
7. —种采用如权利要求l、 2、 3、 4 、 5或6所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物的快速 分子检测试剂盒，其特征在于所述快速分子检测试剂盒包括装有重量浓度299%的超 纯水d.d.H20的超纯水管；装有浓度10xPCR缓冲液的管；装有5mM MgCl2的管；装有 10mM dNTPs的管；装有5U/pl Taq聚合酶的管；装有lOOng^il阳性对照DNA的管；装 有重量浓度^99.5。/。二甲基亚砜DMSO的管；装有20pmol/^上游引物PSD11的管；装有 20pmol/pl下游引物PSD12的管；采用该试剂盒进行PCR扩增反应为PCR扩增反应采 用25pl体系，其中10xPCR buffer2，；5mM MgCl22，；lOmM dNTPs2顺；20pmol/nlPSD11O，；20pmol/nl PSD12Taq聚合酶5ng/nl模板DNAl単；DMSOd.d.H2015,1;PCR扩增程序为94。C变性5min; 94。C变性lmin, 68。C退火30sec, 72。C延伸lmin， 35 个循环；最后72'C延伸10min。
8. —种采用如权利要求7所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物快速分子检测试剂盒体系的建立，其特征在于按照以下步骤建立(1) 从被所述大豆疫霉根腐病菌感染的植物组织中或存在大豆疫霉根腐病菌的土壤样品中分离DNA;(2) 采用所述的分子检测试剂盒进行PCR扩增PCR反应体系25pl，包括2.5^1 10xPCR 反应缓冲液，5mM MgCl2 2.5jil' 10mM dNTPs 2.0^1， 1.0U Taq DNA聚合酶， 20pmol/|J引物PSD11/ PSD12各0.2^1，重量浓度99.5% DMSO 0.5fil和10ng模板 DNA， d.d.H20补足25^， PCR扩增程序为94。C变性5min; 94。C变性Imin， 68°C 退火30sec， 72。C延伸lmin, 35个循环，最后72'C延伸10min;(3) 将8 ^tl步骤(2)的PCR产物用1.5%琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外 灯下根据扩增产物的大小判定结果；如果能特异性地扩增出382bp产物时，即可判断所述的植株组织或土壤样品中存在大豆疫霉根腐病菌；否则所述的植株组织或土 壤样品中未存在大豆疫霉根腐病菌。
9. 根据权利要求8所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物快速分子检测试剂盒体系的建立， 其特征在于当在用于植物组织中存在大豆疫霉根腐病菌时，采用CTAB法提取大豆疫霉 根腐病菌的DNA。
10. 根据权利要求8所述的大豆疫霉根腐病菌分子检测引物快速分子检测试剂盒体系的建立， 其特征在于当在土壤样品中存在大豆疫霉根腐病菌条件下，采用土壤DNA提取法提取 土壤中大豆疫霉根腐病菌的DNA，所述土壤DNA提取法为取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每 管加入500 ^1重量浓度0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12000 rpm离心15 min，取上清 加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10ng/ml蛋白酶K， 55。C水浴l-3h，水浴结束 后，加入1/2体积的7.5 M NH4AC溶液，上下颠倒混匀，12000 rpm离心15 min,吸上清 加2倍体积无水乙醇-20。C沉淀，沉淀时间1.5h,沉淀结束后，12000 rpm离心15 min， 用体积浓度70%乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干，每份样品所提DNA用10pl lxTE或无 菌超纯水溶解，-2(TC保存备用。
全文摘要
本发明提供一种大豆疫霉根腐病菌分子检测引物及其检测试剂盒，上游引物PSD11和下游引物PSD12，试剂盒包括PCR缓冲液，MgCl<sub>2</sub>，dNTPs，Taq聚合酶，阳性对照DNA，DMSO，PSD11/PSD12和超纯水。以此引物为基础的试剂盒，在大豆疫霉根腐病菌纯DNA、带菌的发病组织及土壤中特异性地扩增出片段长度为382bp的特异扩增产物。所发明的特异分子检测引物及其检测试剂盒可用于生产实践中被大豆疫霉根腐病菌感染的植物组织和土壤中大豆疫霉根腐病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断，也可为海关进出境大豆所携带大豆疫霉根腐病菌高灵敏度快速分子检测和鉴定。
文档编号C12Q1/68GK101519697SQ20091011142
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月7日 优先权日2009年4月7日
发明者兰成忠, 李本金, 翁启勇, 健 赵, 陈庆河 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所