专利名称：一种复合蜂产品原料的保健食品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种保健食品，尤其是一种利用蜂胶的乙醇提取、鲜蜂王浆的真空冷冻干燥和蜂花粉的真空冷冻干燥及以蜂王浆、蜂胶、蜂花粉、蜂蜜四种物质为主要原料的保健食品。
背景技术：
人体具有对各种抗原物质的生理反应，即免疫功能，这种免疫功能称为非特异性免疫。在各种抗原刺激机体之后，产生特异性免疫物质引起的免疫反应称为特异性免疫。免疫功能低下会对机体健康产生极为不利影响，所以免疫功能是健康的基础。免疫功能失调，会降低机体抵抗感染的能力，降低识别和清除自身衰老的组织细胞的能力，杀伤和清除异常突变细胞在体内生长的能力，结果导致机体抗病力和自愈力下降，易患多种疾病，是未老先衰原因之一。造成机体免疫功能下降的原因有多种如营养失调、精神或心理因素、内分泌失调和遗传因素等。具有增强免疫功能的食品，能够增强机体对各种疾病的防御能力和抵抗力。
人的一生都不能离开氧，人体内在利用氧的过程中，会因各种内因或外因性原因而产生各种活性氧合自由基。而体内页有各种消除活性氧合自由基的防御系统，以免遭组织伤害，但当体内出现各种各样的复合状态时，就会使活性氧合自由基的形成和消除之间平衡丧失，从而诱发各种组织损伤和疾病。医学研究表明，心脑血管病、糖尿病、癌症等慢性病的发生和发展与营养代谢、机体氧化、抗氧化能力密切相关。营养好，抗氧化能力强，就可以防止基因突变和脂质过氧化，可以防止细胞损伤防止疾病。所以，营养、氧化、抗氧化，是影响我们生老病死的根本。均衡营养、阻止氧化，就可以减少癌症、减少心脑血管疾病、减少糖尿病及其并发症。抗氧化是健康长寿的根本，抗氧化是疾病防治的必须途径。
蜂产品就是理想的天然保健品。鲜蜂王浆、蜂花粉和蜂胶都有良好的保健功能，蜂王浆营养丰富，具有对人体整个免疫系统产生有益的影响，调节免疫功能。蜂花粉被誉为“浓缩的营养库”，具有益免疫、益血管、益抗老、益肠胃等功效。蜂胶富含黄酮等活性物质，具有很强的增强免疫力，抗衰老等功效，本公司将蜂花粉、蜂王浆、蜂胶进行科学的复配，添加药用辅料或食品添加剂，制成产品，有针对性的开发为增强免疫力和抗氧化功能的保健食品，属药食两用之佳品，无任何毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供桩一种以复合蜂产品原料的保健食品，该产品具有增强免疫力和提高人体抗氧化的功能。
本发明的技术方案为该一种保健食品配方重量组份5-80份蜂花粉、5-50份蜂王浆冻干粉、1-20份蜂胶、1-20份蜂蜜、2-60份微晶纤维素、2-60份麦芽糊精、0.1-1份二氧化硅、2-5份薄膜包衣剂混剂。其具体的制备步骤(1)蜂胶的提取蜂胶采用乙醇浸提，再经脱蜡、脱铅处理，经减压浓缩，得到蜂胶提取物。(2)蜂王浆的冻干将鲜蜂王浆和相当于蜂王浆重量20-30％的纯化水混合均匀。再用不锈钢盘分装王浆液，进行真空冷冻干燥。控制干燥过程中物料温度≤40℃，干燥15-30小时后得蜂王浆冻干块。将蜂王浆冻干块80目粉碎，再过80目/时筛网，收集筛过物，得到蜂王浆冻干粉。(3)花粉的冻干将油菜花粉通过风选、除质。然后将物料通过12目筛网分离，再通过色选除杂，除去蜂尸及沙石等杂质，然后将花粉投入真空冷冻干燥机，控制干燥温度≤40℃，干燥时间12-18小时，将油菜花粉80目粉碎，再过80目/时筛网，收集筛过物，得到蜂花粉粉末。(4)制剂工艺将蜂王浆冻干粉、油菜花粉粉末、微晶纤维素和麦芽糊精在混合机中搅拌混合均匀，再在沸腾制粒干燥机中与蜂蜜和蜂胶的乙醇混合溶液造粒，进风温度为40～60℃，干燥1～4小时。再将颗粒经14-20目筛整粒，然后再将整粒后的颗粒投入双锥回旋真空干燥器，并加入一定量的二氧化硅，总混。混合时间为2-10分钟。然后按产品规格要求进行压片，即750mg/片。将适量的素片在高效糖衣、薄膜包衣机中进行薄膜包衣，每片包衣增重量控制在2-5％的范围内。再将包好衣的片子在晾片间敞开放置8～12小时后人工选片，按照产品的质量标准剔除断片、包衣色素不均匀等不合格的片子。按包装规格要求进行装瓶包装。装瓶后钴60辐照杀菌，控制辐照剂量6～8KGy。杀菌后按要求装入外纸箱进行外包装。检验合格后及时入库。
本发明的优点在于蜂王浆(royal jelly)是5-15日龄的哺育工蜂上颚腺和舌腺的分泌物，为乳白色或淡黄色的浆状物，略带黏稠，具有特殊香味。研究证实蜂王浆能促进机体受伤组织的再生能力，使衰老、受伤的组织细胞被新生细胞替代，从而达到延缓衰老的作用。蜂王浆对骨髓、胸腺、脾脏、淋巴组织等免疫器官和整个免疫系统产生有益的影响，能激发细胞的活力，调节免疫功能，刺激抗体产生，增强人体免疫功能。蜂王浆对高血脂、高血糖具有调节作用。能降低血清中胆固醇的作用，还具有调节血压、净化血液、增强血管弹性、预防冠状动脉硬化和动脉粥样硬化的作用。蜂胶(propolis)是蜜蜂从杨树、桦树、柳树，栎树、马栗以及针叶树等胶原植物的叶芽和树皮采集的树脂，由蜜蜂混入蜂蜡和腺体分泌物形成的胶状物质。研究证实蜂胶能调节免疫功能，增强巨噬细胞吞噬能力和自然杀伤细胞活性，增加抗体产量，增强体液免疫和细胞免疫功能，提高抗病力与自愈力。降低血管的脆性与渗透性，改善血液循环状态，净化血液，降血压、降血脂、降血糖、降胆固醇、降低血液粘稠度，抗动脉硬化和抗血栓形成。对饮食中的致癌物质表现出很强的抗变异原性，抑制致癌物的代谢活性，调节细胞周期，促进肿瘤坏死因子生成。能通过血脑屏障，抗氧化、清除自由基、延缓衰老。调节内分泌功能，对胸腺、胰腺、性腺、甲状腺、肾上腺及内分泌系统产生有益的影响。蜂花粉(bee pollen)是工蜂采集花粉，并混以研自己特殊的腺体分泌物、唾液和花蜜等初步加工而成的花粉球。究证实蜂花粉具有对营养不良所致免疫功能低下的人群具有显著的促进和调整作用，并能增强免疫细胞的活性，提高机体的免疫功能，对移植性肝瘤有抑制作用。特别是能促进与肝瘤免疫密切相关的T淋巴细胞和巨噬细胞的活性，以增强机体的抵抗作用。有助于提高超氧化歧化酶的活性，有增强体质，延缓衰老的作用。花粉有利于骨髓造血功能的改善，并能提高T淋巴细胞、巨噬细胞的数量和活性，对肿瘤及其转移有抑制作用。
蜂产品在我国自古以来，就有为人们用来健身和治疗某些疾病的传统。古书《黄帝内经》、《神农本草》等均有记载。蜂产品是一种天然食品，符合现代人崇尚自然食品的需求，可作为人们的营养保健品，既能补益健身，又能对某些疾病起到辅助治疗的作用。
根据查阅大量的文献资料，蜂花粉、蜂王浆和蜂胶具有多种保健功能，而它们同时具有增强免疫力和抗氧化的功效，因此考虑结合此三种原料开发增强免疫力和抗氧化功能的保健食品。生产过程多采用真空冷冻干燥的工艺处理，制剂操作也是在较低温度下完成，低温操作是非常适合于使用鲜蜂王浆和蜂花粉为原料生产产品的工艺，能充分保留蜂王浆和花粉中的活性物质。
本品的适用人群为免疫力低下者、中老年人。
汪氏牌蜂四宝片增强免疫力试验 华中科技大学同济医学院保健食品功能学检验中心 检验报告单 CERTIFICATE OF ASSAY 检品名称汪氏牌蜂四宝片检品编号2007002 Number of Delivery________ Name of Sample_______ 生产单位江西汪氏蜜蜂园有限公司 Department of Product______________ 送检单位江西汪氏蜜蜂园有限公司 Department of Delivery_________ 750mg/片×180片/瓶×50 检品性状黄色片剂 检品数量 瓶 Shape and Properties of Sample___ Quantity of Sample_______ 检品批号20060408 检测项目增强免疫力功能 Lot of product____________________ Items of Assay__________ 收样日期2007.04.12报告日期2007.06.20 Date of Acceptance________________ Date of Report__________ 检验依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版) In Accordance with____________ 结果与判定(Results of Evaluation) 汪氏牌蜂四宝片成人(60kg计)推荐摄入量6.0g/d，即0.1g/Kg.bw。动物采用清洁BALB/c小鼠，实验按人体摄入量10倍、20倍、30倍分别设1.0、2.0、3.0g/Kg.bw三个剂量组，结果表明与对照组相比1)汪氏牌蜂四宝片各剂量组对小鼠的体重、脾脏/体重比值和胸腺/体重比值无明显影响；2)汪氏牌蜂四宝片各剂量组对ConA诱导的淋巴细胞增殖能力无明显影响，三个剂量组均能明显增强DNFB诱导的迟发型变态反应；3)汪氏牌蜂四宝片各剂量组对小鼠血清溶血素含量和抗体生成细胞的生成无明显影响；4)汪氏牌蜂四宝片各剂量组对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力和小鼠碳廓清能力无明显影响；5)汪氏牌蜂四宝片三个剂量组均能明显增强小鼠NK细胞活性。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，判定汪氏牌蜂四宝片具有增强免疫力功能。
1.材料与方法 1.1受试物汪氏牌蜂四宝片，江西汪氏蜜蜂园有限公司生产，每片750mg，成人推荐每天摄入2次，每次4片。按成人60kg体重计，即0.1g/kg.bw。以蒸馏水配制成所需浓度灌胃。
1.2试验动物清洁级BALB/c小鼠，雄性，250只，18-22g，购自西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号为SCXK(沪)2003-0002号。
1.3剂量选择试验设三个剂量组10倍人体摄入量(1.0g/kg.bw)组、20倍人体摄入量(2.0g/kg.bw)组、30倍人体摄入量(3.0g/kg.bw)组，以及对照组，小鼠灌胃体积为0.2mg/10g.bw。灌胃液每天配制。10倍剂量组取5.0g样品溶于蒸馏水中，定容至100mL。20倍剂量组取10.0g样品溶于蒸馏水中，定容至100mL。30倍剂量组取15.0g样品溶于蒸馏水中，定容至100mL。
1.4主要仪器与试剂5mm直径打孔器、显微镜、微量血凝试验板、离心机、酶标仪、96孔培养板、5％CO2培养箱、200目筛网、注射用墨洁、刀豆蛋白A(ConA)、MTT、DNFB、丙酮、麻油、脱毛剂、SRBC、生理盐水、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液、YAC-1细胞、Hanks液(pH7.2-7.4)、RPMI1640完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、Tris-HCL缓冲液(pH8.2)、1％NP40、台盼兰、1mol/L盐酸等。
1.5实验方法 1.5.1碳廓清实验和脏器/体重比值测定实验末期，小鼠称重后，按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(100ml/kg)，注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20ul，并立即将其加到2ml 0.1％ Na2CO3溶液中。用721分光光度计在600nm处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液做空白对照。将小鼠处死，解剖动物，取出肝脏、脾脏及胸腺，用滤纸吸干血迹后称重。
1.5.2迟发型变态反应(DTH)小鼠连续灌胃30天后，每鼠腹部皮肤用脱毛剂进行脱毛处理，范围约3cm×3cm，后用DNFB溶液50ul均匀涂抹致敏；5天后，再用DNFB溶液10ul均匀涂抹于小鼠右耳两面，进行攻击；24小时后，劲椎脱臼处死小鼠，剪下左右两耳，用打孔器取下直径5mm的耳片称重。
1.5.3半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞检测(Jerne改良玻皮法)小鼠连续灌胃30天后，每只鼠腹腔注射2％(V/V)SRBC的细胞悬液0.2ml进行免疫。5天后，取小鼠血及脾脏分别做半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞检测。
1.5.3.1半数溶血值(HC50)的测定将小鼠搞除眼球取血于离心管中，放置约1h，使血清析出，2000r/min离心10min，收集血清。用生理盐水稀释血清(300倍)，将稀释后的血清1ml置试管内，依次加入10％(V/V)SRBC 0.5ml，补体1ml(用生理盐水按1∶10稀释)，另设不加血清的对照管(以生理盐水代替)，置37℃恒温水浴中保温15-30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清液1ml，加都氏试剂3ml于试管内，同时取10％(V/V)SRBC 0.25ml加都氏试剂至4ml，于另一支试管内，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照和作空白，分别测定各管光密度值。
1.5.3.2抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)取SRBC免疫5天后的小鼠脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，经200目筛网过滤，制成单细胞悬液。离心10min(1000r/min)，用Hanks液洗两次，将细胞悬浮于5ml RPMI 1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/ml。将表层培养基加热溶解后，与等量pH7.2-7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50ul 10％SRBC，20ul脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片扣放在片架上，放入CO2培养箱中孵育1-1.5h，然后用SA稀释的补体(1∶8)加入玻片架凹槽内，继续温育1-1.5h，计数溶血空斑数。
1.5.4小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)小鼠连续灌胃30天后，每鼠腹腔注射2％鸡红细胞悬液1ml。30min后，颈椎脱臼处死动物，仰位固定于蜡板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，于37℃孵箱温育30min。孵华，在生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定20min，4％(V/V)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，于显微镜下计数巨噬细胞。
1.5.5ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)小鼠连续灌胃30天后，颈椎脱臼处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，经200目筛网过滤，制成单细胞悬液，将细胞悬液分为两部分，分别用于ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和小鼠NK细胞活性测定。
1.5.5.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验用Hanks液洗涤细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中，台盼兰染色计数活细胞数(在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/ml。将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75ul ConA液，另一孔作为对照，置培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清0.7ml，加入0.7ml不含血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT 50ul/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。
1.5.5.2小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)试验前24小时将靶细胞传代培养，应用前以Hanks液洗3次，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。用Hanks液洗涤脾细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水20秒后，裂解红细胞后再加入0.5ml 2倍Hank’s液及8ml Hank’s液，离心10min(1000r/min)，用1ml完全培养基重悬，用1％冰醋酸稀释后计数，台盼兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2×107个/ml。取靶细胞和效应细胞各100ul(效靶比50∶1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul、靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100ul，上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，然后将培养板离心(1500r/min)5min，每孔吸取上清100ul置96孔培养板中，同时加入LDH基质液100ul，反应3min，每孔加入1mol/L的HCL30ul，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。
1.6实验数据统计实验所得数据采用SAS软件进行分析。
2结果 2.1汪氏牌蜂四宝片对小鼠体重的影响，结果见表1.1-表1.5。
表1.1碳廓清实验和脏器/体重实验前后动物体重记录(X±S)
表1.2DTH实验前后动物休重记录(X±S)
表1.3半数溶血值(HC50)实验和抗体生成细胞实验前后动物体重记录(X±S)
表1.4吞噬实验前后动物体重记录(X±S)
表1.5小鼠脾淋巴细胞转化实验和小鼠NK细胞活性实验前后动物体重记录(X±S)
经方差分析，各剂量组与对照组之间各试验前、后体重以及增重均无显著性差异，P＞0.05。
2.2汪氏牌蜂四宝片对小鼠脏器/体重比的影响，结果见表2 表2汪氏牌蜂四宝片对小鼠脏器/体重比的影响(X±S)
脾脏/体重比值经方差分析，F＝1.13，P＞0.05，各剂量组与对照组相比，无显著性差异。胸腺重比值经方差分析，F＝0.86，P＞0.05，各剂量组与对照组相比，无显著性差异。
2.3汪氏牌蜂四宝片对小鼠细胞免疫功能(小鼠脾淋巴细胞转化实验以及小鼠迟发型变态反应(DTH))的影响，见表3。
表3汪氏牌蜂四宝片对小鼠细胞免疫功能的影响(X±S)
注*表明与对照组比较，P＜0.05；**表明与对照组比较，P＜0.01 淋巴细胞增殖实验的OD差异经方差分析，F＝0.78，P＞0.05，各剂量组与对照组相比，无显著性差异。耳肿程度经方差分析，F＝7.07，P＜0.01，Q检验，10倍剂量组与对照组相比较，有极显著性差异，P＜0.01，20、30倍剂量组与对照组相比较，有显著性差异，P＜0.05。
2.4汪氏牌蜂四宝片对小鼠体液免疫功能(抗体生存细胞测定以及小鼠半数溶血性值测定)的影响，见表4。
表4汪氏牌蜂四宝片对小鼠体液免疫功能的影响(X±S)
溶血空斑数经方差分析，F＝1.47，P＞0.05，各剂量组与对照组相比，无显著性差异。HC50经方差分析，F＝1.55，P＞0.05，各剂量组对照组相比，无显著性差异。
2.5汪氏牌蜂四宝片对小鼠单核-巨噬细胞功能(小鼠碳廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力)的影响，见表5。
表5汪氏牌蜂四宝片对小鼠单核-巨噬细胞功能的影响(X±S)
小鼠碳廓清实验吞噬指数经方差分析，F＝1.22，P＞0.05。各剂量组与对照组相比较，无显著性差异。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率经方差分析，F＝0.26，P＞0.05，各剂量组与对照组相比较，无显著性差异。吞噬指数经方差分析，F＝1.21，P＞0.05，各剂量组与对照组相比较，无显著性差异。
2.6汪氏牌蜂四宝片对小鼠NK细胞活性的影响，见有6。
表6汪氏牌蜂四宝片对小鼠NK细胞活性的影响(X±S)
注*表明与对照组相比较，P＜0.05 经方差分析，F＝3.99，P＜0.05。Q检验，三个剂量组与对照组相比较均有显著性差异，P＜0.05。
3结论、 1)汪氏牌蜂四宝片各剂量组均未见对动物体重及体重增长有明显的影响。
2)汪氏牌蜂四宝片各剂量组对小鼠的脾脏/体重比值和胸腺/体重比值无明显影响。
3)小鼠细胞免疫功能实验表明，在脾淋巴细胞转化实验中，汪氏牌蜂四宝片各剂量组的OD差值与对照组比较无显著性差异；迟发型变态反应实验表明，耳肿程度与对照组相比，10倍剂量组有极显著性差异，20、30倍剂量组有显著性差异，呈阳性结果。
4)小鼠体液免疫功能实验表明，在抗体生存细胞实验中，与对照组相比，汪氏牌蜂四宝片各剂量组脾细胞溶血斑数无明显差异；小鼠半数溶血值测定表明，汪氏牌蜂四宝片各剂量组的HC50值与对照组相比无显著差异。
5)小鼠单核-巨噬细胞功能实验结果表明，在小鼠碳廓清实验中，汪氏牌蜂四宝片各剂量组的吞噬指数与对照组相比，无显著性差异；小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验表明，各剂量组的吞噬率与吞噬指数与对照组相比无显著性差异。
6)NK细胞活性测定实验表明，与对照组相比较，三个剂量组均有显著性差异，呈阳性结果。由以上结果判定汪氏牌蜂四宝片具有增强免疫力功能。
汪氏牌蜂四宝片抗氧化试验 华中科技大学同济医学院保健食品功能学检验中心 检验报告单 CERTIFICATE OF ASSAY 检品名称汪氏牌蜂四宝片检品编号2007002 Number of Delivery_______ Name of Sample____ 生产单位江西汪氏蜜蜂园有限公司 Department of Product__________ 送检单位江西汪氏蜜蜂园有限公司 Department of Delivery_________ 750mg/片×180片/瓶×50 检品性状黄色片剂 检品数量 瓶 Shape and Properties of Sample________ Quantity of Sample________ 检品批号20060408 检测项目抗氧化功能 Lot of product___________________ Items of Assay____________ 收样日期2007.04.12报告日期2007.06.20 Date of Acceptance________________ Date of Report__________ 检验依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版) In Accordance with_____________ 结果与判定(Results of Evaluation) 汪氏牌蜂四宝片人体推荐摄入量为0.10mg/kg.bw。小鼠抗氧化试验中，老龄小鼠按人体推荐摄入量的5、10、20倍剂量(即0.50、1.00、2.00g/kg.bw.)给予受试物，另设老龄和青年对照组，结果表明，与老龄对照组相比10倍、20倍两剂量组血清MDA水平明显下降；20倍剂量组血清GSH-Px活性、GSH水平及红细胞SOD活性明显升高。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，判定汪氏牌蜂四宝片具有抗氧化功能。
以下空白 2.材料与方法 1.1材料 1.1.1样品汪氏牌蜂四宝片，江西汪氏蜜蜂园有限公司生产。检品为片剂，每片750mg，成人推荐每天摄入2次，每次4片。按成人60kg体重计，人体推荐摄入量可折算为每日0.1mg/kg.bw。以蒸馏水配制成所需浓度灌胃。
1.1.2实验动物昆明种小鼠，雌性，清洁级，共50只，其中老龄鼠(10月龄)40只，体重55±4g；青年鼠(2月龄)10，体重22±3g(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，医动字19-052号)。
1.1.3主要仪器与试剂 SOD、GSH、GSH-Px、MDA试剂盒南京建成生物工程研究所。
722分光光度计上海第三分析仪器厂 生化恒温培养箱广东省医疗器械厂 低温高速离心机德国Eppendorf公司(5804R) 1.2方法 1.2.1小鼠抗氧化试验40只老龄小鼠经适应性喂养5天后，采尾血测定血清MDA水平，然后按MDA水平并参考体重随机分为4组，即低、中、高三个剂量组和一个老龄对照组，10只青年小鼠作为青年对照组。三个剂量组分别按人体推荐摄入量(0.10mg/kg.bw.)的5、10、20倍(即0.50、1.00、2.00g/kg.bw.)经口灌胃给予受试物，两对照组则以蒸馏水灌胃，各组动物灌胃容量均为0.20ml/10g.bw.。试验期间，各组动物饲以全价颗粒料，自由进食和饮水，每周称一次体重。试验结束时(30天)采眼眶血，测血清GSH-Px活性、MDA和GSH含量，以及红细胞SOD活性。
1.2.2检测指标与测定方法 血清MDA含量4℃分离血清，采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法(详见试剂盒说明书)，结果以nmol/ml表示 血清GSH含量4℃分离血清，采用5-5’-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)显色法测定GSH含量(详见试剂盒说明书)，结果以mg/L表示 血清GSH-Px活性4℃分离血清，采用5-5’-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)直接显色法测定GSH-Px活性(详见试剂盒说明书)。每0.1ml血清在37℃反应5min，扣除酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位，结果以U表示。
红细胞SOD活性取全血10μL，经生理盐水洗涤、破膜、乙醇沉淀蛋白质和三氯甲烷脱脂后，采用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-亚硝酸盐形成法测定上层提取液SOD活性(详见试剂盒说明书)。以1ml反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD为一个亚硝酸盐单位，结果以Nu/mgHb表示(Hb采用氰化高铁血红蛋白比色法测定)。
1.2.3统计方法采用SAS软件(8.01版)对所测数据进行方差分析(F检验)和两两比较(Q检验)。
2.结果 2.2.1汪氏牌蜂四宝片对小鼠体重的影响试验期间，各组动物给予受试物或对照物后，体重变化情况如表1 表1试验期间小鼠体重的变化(X±S)
由表1见，试验期间，各剂量组和老龄对照组小鼠体重均无明显变化，而青年对照组小鼠因处于生长期，体重不断上升。
2.2.2汪氏牌蜂四宝片对小鼠氧化-抗氧化系统的影响给予受试物前，老龄小鼠血清MDA水平及试验结束时各组小鼠血清GSH-Px活性和MDA、GSH含量，以及红细胞SOD活性，结果如表2所示 表2汪氏牌蜂四宝片对小鼠氧化-抗氧化系统的影响(X±S)
注*、**分别表示与老龄对照组相比有显著(p＜0.05)和极显著性差异(p＜0.01)； Δ、ΔΔ分别表示与青年对照组相比有显著(p＜0.05)和极显著性差异(p＜0.01) 方差分析结果表明试验前各老龄小鼠血清MDA水平无明显差异；试验结束后，三剂量组与两对照组在所测指标间均存在着明显差异(p＜0.0001)。组间比较(Q检验)结果表明老龄对照组与青年对照组所测各项指标之间均存在极显著性差异(p＜0.01)；各剂量与老龄对照组相比 (1)10倍、20倍两剂量组血清MDA含量明显低于老龄对照组，差异有显著性(F＝14.00，p＜0.0001)； (2)20倍剂量组血清GSH水平明显高于老龄对照组，差异有极显著性(F＝16.24，p＜0.0001)； (3)20倍剂量组红细胞SOD活性明显高于老龄对照组，差异有显著性(F＝14.08，p＜0.0001)； (4)20倍剂量组血清GSH-Px活性明显高于老龄对照组，差异有极显著性(F＝14.42，p＜0.0001)。
以上结果表明，汪氏牌蜂四宝片具有升高老龄模型小鼠抗氧化酶活性和降低脂质过氧化水平的作用。
3.结论 小鼠抗氧化试验结果表明汪氏牌蜂四宝片具有显著升高老龄小鼠抗氧化酶活性、降低脂质过氧化的作用。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，判定汪氏牌蜂四宝片对小鼠具有抗氧化功能。
汪氏牌蜂四宝片抗氧化试验 华中科技大学同济医学院保健食品功能学检验中心 检验报告单 CERTIFICATE OF ASSAY 检品名称汪氏牌蜂四宝片检品编号2007002 Number of Delivery_____ Name of Sample____ 生产单位江西汪氏蜜蜂园有限公司 Department of Product__________ 送检单位江西汪氏蜜蜂园有限公司 Department of Delivery_________750mg/片×180片/瓶×50 检品性状黄色片剂 检品数量瓶 Shape and Properties of Sample_____ Quantity of Sample_______ 检品批号20060408 检测项目抗氧化功能(人群试验) Lot of product______________Items of Assay_______ 收样日期2007.04.12报告日期2008.02.14 Date of Acceptance_________ Date of Report________ 检验依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版) In Accordance with__________ 结果与判定(Results of Evaluation) 选择年龄45-65岁，身体健康的男、女性志愿受试者共101例，随机分成对照组和试验组(脱失人数5人，脱离率为4.7％)。所有受试者在试验期间，坚持原生活，饮食不变，试验组按照人群推荐用量每日2次，每次4片(750mg/片)服用受试物，连续3个月。结果表明试验组试食前后比较MDA含量下降17.9％，SOD活性升高7.96％，GSH-Px活性升高4.56％，自身前后以及与对照组比较差异均有极显著性(P＜0.01)。试食前后试验组和对照组血、尿、大便常规和血生化检测均未见明显异常，胸透、腹部B超、心电图检查结果均未见异常，说明该试验样品对受试者健康无不良影响。
按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003)判定“汪氏牌蜂四宝片”具有抗氧化作用。本人群试验由华中科技大学同济医学院保健食品功能学检测中心委托湖北省黄冈市第一人民医院(三甲医院)共同实施。
1材料和方法 1.1受试产品 汪氏牌蜂四宝片，由江西汪氏蜜蜂园有限公司提供，每片内容物重750mg。该产品的成人推荐服用量为每日2次，每次4片。
1.2受试对象 选择符合抗氧化诊断要求的106人，年龄在45-65岁，征求受试者意见后纳入观察对象，有下列情况之一者排队。
(1)妊娠或哺乳妇女，对保健食品过敏者。
(2)合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病患者。
(3)短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。
(4)不合作者，不按规定食用受试样品，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。
1.3试食方法 依照上述标准选择自愿受试者106人，按试验前的人群过氧化脂质含量(MDA)为主、同时考虑超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH——PX)测定值及性别、年龄、生活饮食习惯等因素，均衡地分为2组，每组53例，然后随机分为试验组和安慰剂对照组，以保证组间的可比性。试验组按推荐服用方法，服用受试产品，每日2次，每次4片；对照组服用外形相似的安慰剂胶囊。试食时间3个月，试验期间对照组和试验组原生活、饮食不变。试验中受试者脱离5人，脱离率为4.7％，因此，最后实际有效例数为101例，试验组和对照组分别为51例、50例。
1.4主要仪器与试剂 SOD、MDA、GSH-PX采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定。
1.5观察指标 各项指标在试验前及试验后分别进行检测。
1.5.1一般情况 包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等。
1.5.2血、尿、便常规检查。
1.5.3血生化指标包括血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、血糖(GLu)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。
1.5.4体格检查指标胸透、心电图、腹部B超检查。
1.5.5过氧化脂质含量测定检测试食前后2％溶血液样品MDA的变化及MDA下降百分率。
1.5.6超氧化物歧化酶测定检测试验前后红细胞抽提液的SOD的变化及SOD升高百分率。
1.5.7谷胱甘肽过氧化物酶测定检测试验前后2％溶血液样品GSH-PX的变化及GSH-PX升高百分率。
1.5.8计算公式如下计算每个试验者的差值和百分率，然后计算差值和百分率的均值。
1.6数据处理和结果判定 自身对照资料采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验。
各功效观察指标试验前后自身比较和试食后组间比较均有统计学意义，方可判定该指标阳性。
过氧化脂质含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项实验中任一项实验结果阳性，可判定该受试样品具有抗氧化功能作用。
2结果 2.1一般资料。实际有效例数为101例，试验组和对照组分别51例、50例。试验组和对照组的受试对象在试验前、后的生活和饮食情况基本无改变。试验前后试验组的受试对象精神状况、睡眠等临床症状有所改善；试验组和对照组的年龄、性别情况见表1。
表1试验组和对照组年龄、性别情况
2.2安全性指标试食前后两组受试者其血象、生化、血压各项指标均在正常值范围内(见表2)，试验前后胸透、腹部B超、心电图检查均未见明显异常；尿常规(WBC、KET、URO、BTL、SG、BLD、PRO、GLU、NIT、PH)和大便常规(颜色、性状、粘液、脓细胞、红细胞、虫卵等)检测指标试验前后无明显异常。
表2试食前后血液安全性指标变化比较
2.3功效性指标的变化(见表3、4、5) 试食前两组SOD、MDA、GSH-PX差异无显著性。试食后试验组MDA值明显下降，SOD、GSH-PX明显升高，自身前后比较及组间比较差异均有显著性(P≤0.01)。服用受试物三个月后，试验组MDA下降百分率、SOD升高百分率、GSH-PX升高百分率分别为17.9％、7.96％、4.56％。
表3试食前后过氧化值脂质含量及下降百分率
#自身比较P＜0.01，*组间比较P＜0.01 表4试食前后超氧化物歧化酶活力及升高百分率
#自身比较P＜0.01，*组比较P＜0.01 表5试食前后谷胱甘肽过氧化物酶活力及升高百分率
#自身比较P＜0.01，*组比较P＜0.01 3结论 选择年龄45-65岁，身体健康的男、女性志愿受试者101例，随机分成对照组和试验组(脱失人数5人，脱离率为4.7％)。所有受试者在试验期间，坚持原生活，饮食不变，试验组按照人群推荐用量每日2次，每次4片(750mg/片)服用受试物，连续3个月。结果表明试验组试食前后比较过氧化脂质含量下降17.9％，超氧化物歧化酶升高7.96％，谷胱甘肽过氧化物酶升高4.56％，自身前后以及与对照组比较差异均有极显著性(P＜0.01)。试食前后试验组和对照组血、尿、大便常规和血生化检测均未见明显异常，胸透、腹部B超、心电图检查结果均未见异常，说明该试验样品对受试者健康无不良影响。
按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003)，判定汪氏牌蜂四宝片对受试人群具有抗氧化作用。
具体实施例方式 实施例1(1)将冷冻后的蜂胶低温粉碎，过4目/时筛网过筛后，加2-8倍量60-95％的乙醇提取15-30小时，过120目滤布离心过滤，离心转速300-3000r/min，收集滤液，滤液在-10～-20℃的环境下，冷冻4-10小时以上，过300目滤布离心过滤除蜡，除蜡的工艺重复2-4次，过300目滤布，收集滤液减压浓缩，温度45-50℃、真空度-0.09--0.1MPa浓缩到相对密度≥1.2(45℃温度下)，得到1千克的蜂胶提取物。(2)10千克蜂王浆的冻干粉将鲜蜂王浆和相当于蜂王浆重量20-30％的纯化水混合均匀。再用不锈钢盘分装王浆液，进行真空冷冻干燥。控制干燥过程中物料温度≤40℃，干燥15-30小时后得蜂王浆冻干块。将蜂王浆冻干块80目粉碎，再过80目/时筛网，收集筛过物，得到蜂王浆冻干粉。(3)80千克油菜花粉的冻干将油菜花粉通过风选、除质。然后将物料通过12目筛网分离，再通过色选除杂，除去蜂尸及沙石等杂质，然后将花粉投入真空冷冻干燥机，控制干燥温度≤40℃，干燥时间12-18小时，将油菜花粉80目粉碎，再过80目/时筛网，收集筛过物，得到蜂花粉粉末。(4)制剂工艺将蜂王浆冻干粉、油菜花粉粉末、2千克微晶纤维素和2千克麦芽糊精在混合机中搅拌混合均匀，再在沸腾制粒干燥机中与2千克蜂蜜和1千克蜂胶的乙醇混合溶液造粒，进风温度为40～60℃，干燥1～4小时。再将颗粒经14-20目筛整粒，然后再将整粒后的颗粒投入双锥回旋真空干燥器，并加入一定量的1千克二氧化硅，总混。混合时间为2-10min。然后按产品规格要求进行压片，即750mg/片。将2千克薄膜包衣剂、适量的素片在高效糖衣、薄膜包衣机中进行薄膜包衣，每片包衣增重量控制在2-5％的范围内。再将包好衣的片子在晾片间敞开放置8～12小时后人工选片，按照产品的质量标准剔除断片、包衣色素不均匀等不合格的片子。按包装规格要求进行装瓶包装。装瓶后钴60辐照杀菌，控制辐照剂量6～8KGy。杀菌后按要求装入外纸箱进行外包装。检验合格后及时入库。成品低温避光保存，保质期24个月。
实施例250份油菜花粉、25份蜂王浆冻干粉、4份蜂胶提取物、5份蜂蜜、10份微晶纤维素、4份麦芽糊精、0.5份二氧化硅、2份薄膜包衣剂，其它步骤与实施例1相同。
实施例340份油菜花粉、35份蜂王浆冻干粉、2份蜂胶提取物、6份蜂蜜、6份微晶纤维素、8份麦芽糊精、1份二氧化硅、2份薄膜包衣剂，其它步骤与实施例1相同。
权利要求
1、一种复合蜂产品原料的保健食品，其特征为该保健食品的配方重量组份
蜂花粉 5-80 蜂王浆冻干粉5-50
蜂胶1-20 蜂蜜1-20
微晶纤维素 2-60 麦芽糊精2-60
二氧化硅0.1-1薄膜包衣剂混剂 2-5
制备步骤(1)蜂胶的提取蜂胶原料经过-10～-20℃冻库，冷冻时间4-10小时后至蜂胶原料完全冻透，经低温粉碎，过4目/时筛网过筛后，加2-8倍量60-95％的乙醇提取15-30小时，过120目滤布离心过滤，离心转速300-3000转/分钟，收集滤液，滤液在-10～-20℃的环境下，冷冻4-10小时以上，过300目滤布离心过滤除蜡，除蜡的工艺重复2-4次，过300目滤布，收集滤液减压浓缩，温度45-50℃、真空度-0.09--0.1MPa浓缩到相对密度≥1.2，此相对密度在45℃温度下测定，得到蜂胶提取物，备用；(2)蜂王浆的冻干将在-18℃以下贮存的蜂王浆在王浆解冻间，温度为18-25℃下解冻10-24小时，解冻间配置紫外灯，对蜂王浆进行灭菌；然后将蜂王浆和相当于蜂王浆重量20-30％的纯化水混合30min至均匀；过60目滤布过滤，然后将蜂王浆分装，每个不锈钢盘装王浆3.0-3.5kg，进行真空冷冻干燥，要求干燥过程中物料温度≤40℃，干燥15-30小时直至最终产品蜂王浆冻干块水分≤3％；将蜂王浆冻干块80目粉碎，再过80目/时筛网，收集筛过物，得到蜂王浆冻干粉，备用；(3)花粉的冻干将油菜花粉通过风选、除质；然后将物料通过12目筛网分离，再通过色选除杂，除去蜂尸及沙石等杂质，然后将花粉投入真空冷冻干燥机，控制干燥温度≤40℃，干燥时间12-18h，将油菜花粉80目粉碎，再过80目/时筛网，收集筛过物，得到蜂花粉粉末，备用；(4)制剂工艺将蜂王浆冻干粉、油菜花粉粉末、微晶纤维素和麦芽糊精在槽型混合机中搅拌30分钟，转入沸腾制粒干燥机继续吹常温风进行混合10分钟，控制进风频率为40～45HZ；备用；将蜂蜜和蜂胶用50-95％的乙醇溶液溶解，搅拌均匀，再与上述备用混合料在沸腾制粒干燥机内湿法一步造粒，待蜂蜜、蜂胶液完全喷淋完全后，开始升温干燥1～4小时，进风温度为40～60℃；再将颗粒经整粒机14-20目筛整粒，然后再将整粒后的颗粒投入双锥回旋真空干燥器，并加入一定量的二氧化硅，开启设备混合，混匀物料；混合时间为2-10min；然后按产品规格要求进行压片，即750mg/片；将适量的素片在高效糖衣、薄膜包衣机中进行薄膜包衣。
全文摘要
本发明公开一种由蜂花粉、蜂王浆冻干粉、蜂胶、蜂蜜组成的保健食品。经动物功能试验和人体试食试验证明，具有增强免疫力、抗氧化的保健功能。
文档编号A23L1/08GK101606706SQ20091011566
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者玲 汪, 良 叶, 喻建辉 申请人:江西汪氏蜜蜂园有限公司