专利名称：应用毕赤酵母的pGAP调控表达葡聚糖外切酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种应用毕赤酵母的pGAP启动 子调控生产生物蛋白的方法，具体是一种应用毕赤酵母的pGAP调控 表达葡聚糖外切酶的方法。
背景技术：
葡聚糖外切酶(1,4-P-D-glucancellobio-hydrolase 或 exo-l，4-卩-D-glucanase,EC3.2丄91)作用于纤维素线状分子末端，水解 |3-1， 4-D-14糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二 糖水解酶(cellobiohydrolase)(简称CBH)。当葡聚糖外切酶与葡聚糖 内切酶和p-葡萄糖苷酶的协同作用下能将植物纤维素分解为葡萄糖， 葡萄糖可作为食品也可作为生物能源乙醇的原料。
葡聚糖外切酶主要来自于某些细菌、放线菌和丝状真菌。传统 上生产葡聚糖外切酶主要是应用天然的菌株进行发酵。但是，由于细 菌产生的葡聚糖外切酶是以包涵体形式存在于胞内，产物难于纯化； 而放线菌和丝状真菌生长缓慢，营养要求较高，分泌大量自身的蛋白， 生产成本较高。
毕赤酵母(i^&a/7WtoWs )是最近迅速发展的一种真核表达宿 主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，由于Ac/z^ /7Mton'S分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的纯化。近来有应用户/c/z/fl; ^ton's的pAOXl系统表达葡聚糖外切酶，但pAOXl在系统 表达葡聚糖外切酶时需要应用甲醇为碳源，而甲醇是易挥发的有毒物 质，在生产中使用，容易造成环境污染；当大规模发酵时，甲醇的大 量使用具有潜在火灾危险；并且，外源蛋白的生产周期较长。
发明内容
本发明的目的是解决应用天然产葡聚糖外切酶菌株生产葡聚糖 外切酶的成本较高、产物难于纯化以及应用尸/c/z/a/ "stoWs的pAOXl 表达系统生产葡聚糖外切酶时需要应用毒性的甲醇为碳源的问题，为 生产葡聚糖外切酶提供一种应用毕赤酵母的pGAP (三磷酸甘油醛脱氢 酶启动子)调控表达葡聚糖外切酶的方法。
本发明所采用的技术方案
一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达葡聚糖外切酶的方法，其步 骤是
1、 首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由 pGAP调控葡聚糖外切酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转 化毕赤酵母基因组；
3、 根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；
4、 将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28 30'C在生 物反应器中发酵工程菌1 2d分泌表达葡聚糖外切酶，在发酵过程中 用氨水维持pH在4 6。所述液体培养基是由以下组分组成85%磷 酸25~28 ml/L， CaS04 21120 0. 8~ 1. 2g/L， K2S04 17 19 g/L, MgS04 '7H20 13 ~16g/L，KOH 3. 5~4. 5 g/L，碳源15~45g/L，蛋白胨18-22 g/L， Yeast extract 8 ~12g/L， PTM4 3~5 ml/L。所述碳源是甘油或油酸。所 述PTM4是由以下组分组成CuS04 *5H20 1. 5 ~2. 5g/L， Nal *2H20 0. 1~0. 2g/L， MnS04 H20 2. 5 ~3. 5g/L， Na2Mo04 2H20 0.1~0. 3 g/L， H3BO30.01~0. 03g/L， CoCl2 *6 H20 1. 0 ~2. 0g/L， ZnCl2 6. 5 ~7. 5g/L， Fe2(S04)3 7H2O20~25g/L，生物素0. 1~0. 3 g/L，硫酸1 ~2ml/L。
本发明采用了毕赤酵母的pGAP调控表达的葡聚糖外切酶，具有
下列优点
1、 生产成本低，只需使用普通的无机盐、碳源和氮源作为发酵
培养基。
2、 可在生物反应器中发酵毕赤酵母，其细胞能生长至细胞密度 达200A以上，能以足够多的细胞数量表达葡聚糖外切酶，有利于葡 聚糖外切酶的大规模生产。
3、 发酵周期短，整个发酵周期只需l~2d。
4、 使用无毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作为碳源。
5、 由于pGAP是毕赤酵母的强启动子，由pGAP调控表达的葡 聚糖外切酶约占总分泌蛋白的比例较高，并且由于在葡聚糖外切酶的 C端融合了 His标签，有利于产物的纯化。
具体实施方式
下面才用非限定性实施例对本发明作进一步说明。 实施例一1、 首先从尸/c/zz'a/ ostoWs中扩增pGAP启动子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由 pGAP调控葡聚糖外切酶基因的尸z'c/2z'a postoWs表达载体，并将这一 载体转化P/c/2/apoyto^基因组；
3、 根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；
4、 将工程菌株菌液(A600&1.5)接种(接种量为1/12)于液体 培养基中液体培养基的配方(每升)85。/。磷酸26.7ml，CaS04 2H20 0.93 g， K2S0418.2g， MgS04'7H20 14.9g， KOH4.13g，甘油40 g, 蛋白胨20 g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4 ml(PTM4配方
(每升)CuS04 '5H2O2.0g， Nal'2H2O0.1g， MnS04'1120 3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g，生物素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生 物反应器中进行发酵表达葡聚糖外切酶。其发酵参数为温度3(TC， pH5.0，搅拌转速200-900 r/min，通气量20—30 L/min;发酵过程中 通过调节通气量和搅拌转速而控制溶氧20—30%。发酵2 d后离心收 获上清进行纯化葡聚糖外切酶。 实施例二
1 、首先从尸/c/z/a;mstor/s中扩增pGAP启动子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由 pGAP调控葡聚糖外切酶基因的尸/c/^ ; asto^表达载体，并将这一 载体转化p/c/w'a paston's基因组；
3、 根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；4、将工程菌株菌液(A,"1.5)接种(接种量为1/12)于液体培 养基中液体培养基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 2H20 0.93 g， K2S0418.2g， MgS04'7H20 14.9g， KOH 4.13 g，油酸20 g， 蛋白胨20g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方 (每升)CuS04 *5H2O2.0g， Nal'2H2O0.1g， MnS04'恥3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g, H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7H20 22g (可FeSCU 7 H20 11.6 g代替)，生物 素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反应器中进行发酵表达葡聚糖外 切酶。其发酵参数为温度30。C， pH5.0，搅拌转速200-900 r/min， 通气量20—30 L/min;发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速而控制 溶氧20—30%。发酵l d (30 h)后离心收获上清进行纯化葡聚糖外 切酶。
实施例三
1、 首先从尸/c/h'apostoWs中扩增pGAP启动子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由 pGAP调控葡聚糖外切酶基因的P/cW" pwtor&表达载体，并将这一 载体转化A'c/h'a/7aston;s基因组；
3、 根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；
4、 将工程菌株菌液(A6oq^1.5)接种(接种量为1/12)于液体培 养基中液体培养基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 2H20 0.93 g， K2S0418.2g， MgS04 7 H20 14.9 g， KOH 4.13 g，山梨醇 35 g，蛋白胨20g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每升):CuS04 *5H2O2.0g， NaI*2H2O0.1g， MnS04 H20 3.0 g， Na2Mo04'2H2O0.2g， H3B03 0.02 g， CoCl2 '6H2O1.05g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g (可FeS04 7 H20 11. 6 g代替)， 生物素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反应器中进行发酵表达葡聚 糖外切酶。其发酵参数为温度30°C， pH5.0，搅拌转速200-900 r/min， 通气量20-30 L/min;发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速而控制 溶氧20—30%。发酵30 h后离心收获上清进行纯化葡聚糖外切酶。 实施例四
1、 首先从尸/c/^/ osto^中扩增pGAP启动子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由 pGAP调控葡聚糖外切酶基因的Ac/H'a pwton's表达载体，并将这一 载体转化户/c/H'apaWon's基因组；
3、 根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；
4、 将工程菌株菌液(A60()"1.5)接种(接种量为1/12)于液体培养 基中液体培养基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 '21120 0.93 g， K2S0418.2g， MgS04'7H20 14.9g， KOH4.13g，葡萄糖40g， 蛋白胨20g, Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方
(每升):CuS04 5H20 2.0 g， Nal 2H20 O.lg， MnS04 H20 3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7H20 22g (可FeS04 7 H20 11.6 g代替)，生物 素0.2 g，硫酸1 ml),在50 L生物反应器中进行发酵表达葡聚糖外 切酶。其发酵参数为温度3(TC， pH5.0，搅拌转速200-900 r/min通气量20—30L/min;发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速而控制 溶氧20—30%。发酵2d后离心收获上清进行纯化葡聚糖外切酶。 实施例五
1、 首先从P/c/w'a; astor/s中扩增pGAP启动子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由 pGAP调控葡聚糖外切酶基因的尸/c/^ ; asto^表达载体，并将这一 载体转化p/cfe'a pastor基因组；
3、 根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液(A6。Q"1.5)接种(接种量为1/12)于液体培养基中液体培养基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 *2H20 0.93 g， K2S0418.2g, MgS04 7 H20 14.9 g, KOH4.13g，乳酸30 g，蛋白 胨20g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每 升)CuS04 *5H2O2.0g， Nal 2H20 O.lg， MnS04 H20 3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7H20 22g (可FeS。4 7 H20 11.6 g代替)，生物 素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反应器中进行发酵表达葡聚糖外 切酶。其发酵参数为温度3(TC， pH5.0，搅拌转速200-900 r/min， 通气量20—30 L/min;发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速而控制 溶氧20—30%。发酵30 h后离心收获上清进行纯化葡聚糖外切酶。 实施例六
1、 首先从尸/c/^posto^中扩增pGAP启动子；
2、 在葡聚糖外切酶基因序列的3'末端融合His6标签，构建由pGAP调控葡聚糖外切酶基因的户/c/H'" / "Wor^表达载体，并将这一 载体转化尸/c/^postoWs基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株； 4、将工程菌株菌液(A,&1.5)接种(接种量为1/12)于液体培养基中液体培养基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 '2H20 0.93 g， K2S04 18.2 g， MgS04 7 H20 14.9 g， KOH 4.13 g，甘露醇40 g，蛋 白胨20 g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4 ml(PTM4配方(每 升)CuS04 5H20 2.0 g， Nal 2H20 O.lg， MnS04 H20 3.0 g， Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g， ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g (可FeSCW H20 11.6 g代替)，生物 素0.2g，硫酸lml)，在50 L生物反应器中进行发酵表达葡聚糖外 切酶。其发酵参数为温度3(TC, pH5.0，搅拌转速200-900 r/min, 通气量20—30 L/min;发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速而控制 溶氧20—30%。发酵30 h后离心收获上清进行纯化葡聚糖外切酶。
权利要求
1、一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达葡聚糖外切酶的方法，其特征在于，其具体步骤如下1)、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；2)、在葡聚糖外切酶基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控葡聚糖外切酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；3)、根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；4)、将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵工程菌1～2d分泌表达葡聚糖外切酶，在发酵过程中用氨水维持pH在4～6；所述液体培养基是由以下组分组成85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO4 17～19g/L，MgSO4·7 H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM4 3～5ml/L；所述PTM4是由以下组分组成CuSO4·5H2O 1.5～2.5g/L，NaI·2H2O0.1～0.2g/L，MnSO4·H2O 2.5～3.5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1～0.3g/L，H3BO3 0.01～0.03g/L，CoCl2·6 H2O 1.0～2.0g/L，ZnCl2 6.5～7.5g/L，Fe2(SO4)3·7 H2O 20～25g/L，生物素0.1～0.3g/L，硫酸1～2ml/L。
2、 根据权利要求1所述的应用毕赤酵母的pGAP调控表达葡聚 糖外切酶的方法，其特征在于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡 萄糖、乳酸或甘露醇。
全文摘要
本发明公开了一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达葡聚糖外切酶的方法，属生物技术领域，首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；构建由pGAP调控葡聚糖外切酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；根据载体上所带的抗性基因筛选重组子作为工程菌株；将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中发酵工程菌分泌表达葡聚糖外切酶。本发明生产成本低，发酵周期短，利用毕赤酵母的pGAP调控表达的葡聚糖外切酶有利于产物的纯化，解决应用天然产葡聚糖外切酶的菌株生产葡聚糖外切酶的成本较高、产物难于纯化等的问题，有利于葡聚糖外切酶的大规模生产。
文档编号C12N15/81GK101624601SQ20091015923
公开日2010年1月13日 申请日期2009年7月30日 优先权日2009年7月30日
发明者直 屈, 屠发志, 张添元, 张爱联, 易国辉, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所